劉偉

中藥當(dāng)歸是臨床上應(yīng)用較為普遍的補(bǔ)血藥物,其味甘、性辛溫,可歸肝、心、脾經(jīng),入藥后能夠發(fā)揮良好的補(bǔ)血效果,其不僅在血虛所致的多種癥狀中發(fā)揮效果,同時(shí)也能發(fā)揮活血、止痛、補(bǔ)血等功效,為婦科調(diào)經(jīng)治療的首選藥物［1］。炮制則是現(xiàn)階段應(yīng)用十分廣泛的一種中藥臨床用藥手法,當(dāng)前臨床上當(dāng)歸炮制品應(yīng)用種類繁多,其中較為常見的炮制品包含生當(dāng)歸、酒當(dāng)歸以及土炒當(dāng)歸等多種類型［2］。中藥炮制主要是一種依據(jù)中醫(yī)臨床用藥需求及藥物自身性狀,并結(jié)合調(diào)劑、制劑方法的差異對(duì)藥物進(jìn)行加工處理的制藥技術(shù)［3］。對(duì)于當(dāng)歸炮制后成分的鑒定與明確則是確保其臨床用藥安全性的重要手段,但在采取不同炮制方法的情況下,其臨床效果也有一定差異,新產(chǎn)生成分的化學(xué)成分也不一樣,這對(duì)于臨床用藥藥物的藥性研究十分關(guān)鍵,且單單依據(jù)氣味、顏色難以辨別,故為了有效確保其使用效果及安全性,采取合理手段明確當(dāng)歸炮制后新產(chǎn)生的成分十分重要［4,5］。對(duì)此,本文主要分析當(dāng)歸炮制后新產(chǎn)生成分的分離方式及結(jié)構(gòu)鑒定?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究中選取儀器試劑主要為核磁共振儀(產(chǎn)自瑞士；AVANCE Ⅲ；500 MHz)；液相色譜儀(產(chǎn)自美國(guó)Asi-lent；Agilent1200)；制備型高效液相色譜儀(產(chǎn)自美國(guó)Asi-lent；Agilent1100)。研究中應(yīng)用材料主要包含柱層析硅膠(產(chǎn)自青島海洋化學(xué)廠；100-200 目、200-300 目)；當(dāng)歸生品(產(chǎn)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠)。

1.2 方法

1.2.1 當(dāng)歸炮制前后圖譜對(duì)比 針對(duì)此次研究中生當(dāng)歸炮制后新產(chǎn)生成分主要經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)圖譜發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸炮制過程如下：稱取40%干燥60 目生品當(dāng)歸及1 g 制品粉末,將其置于圓底燒瓶(50 ml)中,注入50 ml 甲醇(CH4O)在水浴(80℃)環(huán)境下回流60 min,抽濾并使用10 ml CH4O 分次對(duì)瓶壁及濾渣進(jìn)行洗滌,此后合并濾液,減壓濃縮；針對(duì)殘?jiān)褂肅H4O 溶解,并將其定容到容量瓶(5 ml),從而得到當(dāng)歸生品及制品樣品。使用微孔濾膜(0.22 μm)進(jìn)行過濾,取續(xù)濾液,予以10 μl 進(jìn)樣,并進(jìn)行HPLC 分析,得到色譜圖如圖1(炮制前)、圖2(炮制后),對(duì)比炮制前后色譜圖可見,色譜峰1、2 為炮制后新得到的產(chǎn)物。

1.2.2 提純分離 制取4 kg 當(dāng)歸,加入95%的乙醇(EtOH)60 kg(當(dāng)歸的15 倍量)；加熱回流提取2 次,提取時(shí)間為90 min/次,提取液回收至無醇味,加入水適量以分散,并分別應(yīng)用石油醚(C7H16)、乙酸乙酯(C4H8O2)和正丁醇［CH3(CH2)3OH］進(jìn)行萃取,C4H8O2萃取物(80 g)通過硅膠柱色譜,使用C7H16-C4H8O2梯度洗脫,得到洗脫部位1、2,前者應(yīng)用制備液相(H2O-CH4O 為流動(dòng)相)分離,獲得化合物A；后者采取重結(jié)晶分離,獲得化合物B 與C。

2 結(jié)果

2.1 化合物A 經(jīng)觀察鑒定,化合物A 為微黃色油狀物,經(jīng)10%的硫酸(H2SO4)顯色(于硅膠薄層板上)后,呈墨綠色。具體色譜資料見表1。結(jié)合波譜數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示,化合物A 與5-HMF 高度一致,故鑒定為5-HMF。分離后結(jié)合相同色譜條件進(jìn)行高效液相分析,顯示圖2 色譜峰2 為5-HMF。

表1 化合物A 色譜分析結(jié)果

2.2 化合物B 化合物B 為白色針狀結(jié)晶(CH4O),經(jīng)溴甲酚(C21H14Br4O5S)綠反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性,提示可能含有羧基；經(jīng)三氯化鐵(FeCl3)反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性,顯示可能存在酚羥基。具體色譜資料見表2。結(jié)合上述理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分析可見,該化合物結(jié)構(gòu)與香草酸(C8H8O4)高度一致,故分析其為香草酸。

表2 化合物B 色譜分析結(jié)果

2.3 化合物C 化合物C 表現(xiàn)為白色結(jié)晶,通常為針狀,其于溴甲酚綠(C21H14Br4O5S),發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后,呈現(xiàn)陽(yáng)性,故表明存在羧基。ESI(+)-MS 得出結(jié)果(m/z124［M+H］+)。則表明分子中有C=O；80［M+HCO2］則表明分子中存在-COOH。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)譜給出質(zhì)子信號(hào)5 個(gè),峰形較寬,結(jié)合色譜顯示可能為羰基信號(hào),推測(cè)為羧基氫信號(hào)；9.114 為吡啶環(huán)上連接雜原子的碳上質(zhì)子信號(hào)；8.854、8.303、7.573構(gòu)成吡啶環(huán)上3 個(gè)相鄰質(zhì)子偶合系統(tǒng)。C-NMR 譜給出碳信號(hào)6 個(gè),δ166.35 為羧基碳信號(hào),其余5 個(gè)位連接雜原子的碳信號(hào)。結(jié)合上述分析可推斷該化合物的構(gòu)成為連接1 個(gè)吡啶環(huán)、1 個(gè)羧基。結(jié)合上述理化表現(xiàn)及波譜數(shù)據(jù)顯示其與煙酸(C6H5NO2)基本一致,故分析化合物C 為煙酸。

3 討論

當(dāng)歸是中醫(yī)臨床上應(yīng)用較為普遍的一味中草藥,其為多年生草本植物,主要產(chǎn)自甘肅東南部［6］,多用于中醫(yī)治療,具有極高的藥用價(jià)值,臨床上多將其應(yīng)用于心臟、心血管等疾病的治療中,具備抗氧化、抗炎癥及抗血小板聚集等多種功效［7］。目前,臨床上主要通過中醫(yī)炮制形式對(duì)當(dāng)歸的功效進(jìn)行明確,從當(dāng)歸炮制方式來看,臨床上主要有酒當(dāng)歸、當(dāng)歸炭及當(dāng)歸土炒等形式［8］。相關(guān)研究資料顯示,當(dāng)歸中包含的水溶性及揮發(fā)性物質(zhì)是其主要成分,水溶性成分多為阿魏酸,揮發(fā)性成分主要為揮發(fā)油及總鞣質(zhì)等［9］。同時(shí)也有相關(guān)研究顯示,采取不同的方法進(jìn)行炮制后得到的藥品質(zhì)量也存在一定的差異,并對(duì)其成分質(zhì)量有一定影響［10］。目前在當(dāng)歸中包含的已知化合物主要包含香草酸與煙酸,而5-HMF 則是當(dāng)歸炒制中產(chǎn)生的一種新成分［11］；在當(dāng)歸中包含糖,故在其處于酸性環(huán)境及高溫條件下則會(huì)導(dǎo)致多糖水解為單糖,進(jìn)一步處于酸性環(huán)境下則會(huì)脫水形成5-HMF。經(jīng)分離得到的5-HMF進(jìn)一步純化后,經(jīng)薄層色譜法(TLC)、HPLC 檢查可見,其含量高于98%［12］。結(jié)合此次研究分析可見,在當(dāng)歸炒制后共產(chǎn)生新物質(zhì)為2 種化合物,通過分離提純得到其中一個(gè)為5-HMF,另一個(gè)未能得到,經(jīng)HPLC 色譜圖分析可見,其出峰時(shí)間早于5-HMF,這顯示其對(duì)比5-HMF 的極性更大,結(jié)合圖譜及理化分析可見,其可能含有羥基、羰基。既往有研究人員發(fā)現(xiàn),在中藥材何首烏進(jìn)行炮制后,新產(chǎn)生了兩種化合物,經(jīng)分離提純后鑒定顯示其一為5-羥基麥芽酚,其二為5-HMF。在HPLC 色譜中顯示5-羥基麥芽酚對(duì)比5-HMF 出峰時(shí)間更早,經(jīng)質(zhì)譜得出其分子量為144。結(jié)合這一研究認(rèn)為分離得到的兩種物質(zhì)可能為麥拉德反應(yīng)產(chǎn)物,即為單糖與蛋白質(zhì)或氨基酸在某種條件下經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成的新產(chǎn)物。故分析在當(dāng)歸炮制后產(chǎn)生的新增化合物可能為5-羥基麥芽酚,但具體產(chǎn)物分析還有待進(jìn)一步深入探析。

綜上可見,在當(dāng)歸炮制后得到的產(chǎn)物主要有3 種,即為5-HMF、香草酸與煙酸,其中5-HMF 為當(dāng)歸炮制后得到的新化合產(chǎn)物之一,而針對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的另一新產(chǎn)物仍需進(jìn)一步研究加以鑒別。