吳 博，李明瑕，劉姝瑞，劉忠思，黃朝波，陳歷水?

（漯河市衛(wèi)龍生物技術(shù)有限公司，漯河市食品安全與營(yíng)養(yǎng)健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462000）

魔芋學(xué)名Amorphophallus rerieri，為單子葉植物綱，天南星科耐蔭性多年生草本植物的塊莖[1]。鮮魔芋塊莖經(jīng)過(guò)干燥、機(jī)械粉碎、風(fēng)選等工序得到魔芋飛粉、魔芋精粉、魔芋全粉等產(chǎn)物。這些魔芋粉樣品中同時(shí)含有葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）和淀粉兩種大分子物質(zhì)[2]。其中，葡甘露聚糖由D-葡萄糖和 D-甘露糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵聚合而成[3]。它具有多種獨(dú)特的理化性質(zhì)，如流變性、增稠性、膠凝性和成膜性，同時(shí)對(duì)人體有降低膽固醇、改善血糖、促進(jìn)腸道活性和免疫功能的作用[1,4-7]。魔芋淀粉是魔芋第二大營(yíng)養(yǎng)成分，僅次于KGM，魔芋淀粉也被證明具有調(diào)節(jié)消化速率，降低糖尿病患者的血糖反應(yīng)和胰島素抵抗等功效[1]。

目前，魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的檢測(cè)方法通常采用GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》和NYT 494—2010《魔芋粉》描述的方法進(jìn)行。但是這兩種方法在同時(shí)含有葡甘露聚糖和淀粉的魔芋粉樣品的測(cè)定中互相干擾，導(dǎo)致測(cè)定值均遠(yuǎn)高于實(shí)際值，不能很好地對(duì)魔芋粉樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)[8-10]。DB 43/T 477—2009《魔芋食品中葡甘聚糖的測(cè)定 氣相色譜法》采用氣相色譜法對(duì)魔芋精粉中葡甘聚糖含量進(jìn)行測(cè)定，但氣相色譜的衍生過(guò)程操作較為繁瑣并且可能產(chǎn)生衍生異構(gòu)體[11]，同時(shí)該方法沒(méi)有對(duì)魔芋粉中淀粉含量進(jìn)行分析。

近些年來(lái)，柱前衍生化高效液相色譜多被用于多糖物質(zhì)中單糖組成的測(cè)定以及魔芋粉中葡甘聚糖含量的檢測(cè)[12-16]。本研究使用柱前衍生高效液相色譜法對(duì)四種魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飛粉、葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量進(jìn)行分析檢測(cè)，同時(shí)與上述兩種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值進(jìn)行比較。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柱前衍生高效液相色譜法能夠?qū)λ姆N不同葡甘聚糖和淀粉占比的魔芋粉樣品進(jìn)行測(cè)定，且該方法回收率高、重復(fù)性好，為魔芋粉的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉（樣品1）、魔芋飛粉（樣品2）、葡甘露聚糖樣品（樣品3）、魔芋全粉（樣品4）：楚雄德源魔芋生物科技有限公司；D-甘露糖（純度99%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮：上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖（純度99.5%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜LC-16L：日本島津公司；十萬(wàn)分之一分析天平：梅特勒公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品中水分、蛋白、灰分、單糖含量的測(cè)定

水分測(cè)定方法參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中描述的方法進(jìn)行。蛋白測(cè)定方法參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中描述的方法進(jìn)行?；曳譁y(cè)定方法參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》中描述的方法進(jìn)行。

單糖含量測(cè)定：稱(chēng)取2.0 g左右魔芋粉樣品，用100 mL乙醇（85%，體積比）數(shù)次洗滌，收集洗滌后的乙醇溶液，水浴蒸干乙醇后，于105 ℃烘箱烘干至恒重，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱(chēng)重。

同時(shí)以GB 5009.9—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》測(cè)定淀粉和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法測(cè)定葡甘露聚糖含量。

1.3.2 樣品前處理

樣品前處理方法參照GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》中第二法，稍作修改。

除單糖：稱(chēng)取2.5 g左右魔芋粉樣品（精確到0.001 g），置于放有慢速濾紙的漏斗中，用150 mL乙醇（85%，體積比）分?jǐn)?shù)次洗滌殘?jiān)?，以充分除去可溶性糖?lèi)物質(zhì)。

酸解：濾干乙醇溶液。以100 mL水洗滌漏斗中殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，加入30 mL鹽酸（1+1），接好冷凝管，置沸水浴中回流2 h。回流完畢后，立即冷卻。

除蛋白、定容：待試樣水解液冷卻后，以氫氧化鈉溶液（400 g/L）調(diào)節(jié)樣品pH約為7。然后加20 mL乙酸鉛溶液（200 g/L），搖勻，放置10 min。再加20 mL硫酸鈉溶液（100 g/L），以除去過(guò)多的鉛。搖勻后將全部溶液及殘?jiān)D(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，用水洗滌錐形瓶，洗液合并入容量瓶中，加水稀釋至刻度。過(guò)濾，棄去初濾液20 mL，濾液稀釋4倍供測(cè)定用。

1.3.3 衍生化方法

衍生化方法參照周彥強(qiáng)等[12]描述的方法進(jìn)行，稍作修改。取1 mL樣品，加入0.65 mL 0.1 moL/L氫氧化鈉、0.75 mL PMP的甲醇溶液（0.1 g/mL），70 ℃水浴30 min，反應(yīng)后加入0.65 mL 0.1 moL/L HCL。使用2 mL氯仿洗滌6次。取0.5 mL上清，加入1 mL水，通過(guò)0.45 μm水系濾膜過(guò)濾，裝入液相小瓶。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：XBridge C18（4.6×150 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）=18∶72；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)時(shí)間30 min。

1.3.5 KGM中葡甘露聚糖和淀粉含量的計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中葡萄糖和甘露糖的質(zhì)量濃度。

試樣中葡甘露聚糖的含量按式（1）計(jì)算，淀粉的含量按式（2）計(jì)算：

式中：x1：試樣中的葡甘露聚糖含量（g/100 g）；x2：試樣中的淀粉含量（g/100 g）；ρ1：試樣液中甘露糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；ρ2：試樣液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；m：稱(chēng)樣量（g）；n：樣品稀釋倍數(shù)；1.562：KGM分子中葡甘露聚糖與甘露糖的質(zhì)量比；0.9：魔芋葡甘露聚糖/淀粉相對(duì)分子質(zhì)量與單糖相對(duì)分子質(zhì)量之比；100：換算系數(shù)；計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

1.3.6 方法學(xué)考察

精密度：分別稱(chēng)取魔芋精粉、魔芋飛粉、市售葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉2.5 g各6份，經(jīng)酸解前處理和衍生處理后用高效液相色譜儀分別進(jìn)行6組基質(zhì)樣品獨(dú)立測(cè)試甘露糖和葡萄糖含量，并通過(guò)公式計(jì)算為葡甘聚糖和淀粉含量，通過(guò)計(jì)算樣品6組測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)方法的精密度。

回收率：分別稱(chēng)取魔芋精粉、魔芋飛粉、市售葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉各2.5 g，經(jīng)酸解前處理后進(jìn)行相應(yīng)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)后進(jìn)行衍生并通過(guò)高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，每組3個(gè)平行。不同樣品的中濃度和高濃度加標(biāo)量如表1所示。

回收率按公式（3）計(jì)算：

在現(xiàn)今高速發(fā)展的信息時(shí)代，傳統(tǒng)官僚體制已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)的變革，管理型政府向服務(wù)型政府轉(zhuǎn)變的過(guò)程中需要基層政府能夠做出更快的反應(yīng)、付出更低廉的成本并提供更優(yōu)質(zhì)的服務(wù)，而作為五大資源之一的人力資源的有效開(kāi)發(fā)與精準(zhǔn)運(yùn)用也就變得尤為重要。

式中：R：回收率；C1：加標(biāo)后測(cè)定濃度（g/L）；C2：加標(biāo)之前測(cè)定濃度（g/L）；C3：加標(biāo)目標(biāo)的理論濃度（g/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3個(gè)以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件（IBM，Chicago，IL，USA）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中水分、蛋白、灰分、單糖含量

魔芋粉中除葡甘聚糖和淀粉外，還包含蛋白、灰分、單糖、灰分等成分。對(duì)四種魔芋粉樣品中蛋白、灰分、單糖、灰分進(jìn)行測(cè)定，能夠更全面的了解不同魔芋粉的組成，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 魔芋粉樣品中水分、灰分、蛋白、單糖含量Table 2 Moisture, ash, protein and monosaccharide contents in konjac flour samples %

2.2 樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

在該部分實(shí)驗(yàn)中，分別采用有國(guó)標(biāo)NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法以及柱前衍生高效液相色譜法對(duì)魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)結(jié)合魔芋粉中其它理化指標(biāo)對(duì)測(cè)定值進(jìn)行評(píng)價(jià)，以選擇適于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的測(cè)定方法。

2.2.1 柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配置不同濃度的甘露糖和葡萄糖混合溶液，依照1.3中描述的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生和檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)樣品中甘露糖和葡萄糖測(cè)定的高效液相色譜圖如圖1所示。可知，甘露糖和葡萄糖出峰時(shí)間分別為12.883、24.932 min。兩種成分在35 min內(nèi)達(dá)到完全分離，分離度高，峰型好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard sample

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性參數(shù)Table 3 Linear parameters of standard curves

表4 高效液相色譜法測(cè)定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 4 Determination of KGM and starch in samples by HPLC %

以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積/105為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系如表3所示。甘露糖和葡萄糖在0.05～1.5 g/L的檢測(cè)范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系好，可用于單糖樣品的檢測(cè)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

分別使用GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法測(cè)定四種魔芋粉樣品中KGM和淀粉含量，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 5 Determination of KGM and starch in samples by standard method %

2.2.3 測(cè)定結(jié)果分析

根據(jù)NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法對(duì)樣品中葡甘聚糖和淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果與水分、灰分、蛋白、單糖含量進(jìn)行累加，其中魔芋精粉總量達(dá)185.90%、楚雄德源魔芋飛粉總量達(dá)110.00%、葡甘聚糖樣品總量達(dá)177.97%、魔芋全粉總量達(dá)150.87%，顯然是不合理的。

柱前衍生高效液相色譜法對(duì)樣品中葡甘聚糖和淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，楚雄德源魔芋精粉總量達(dá)97.92%、楚雄德源魔芋飛粉總量達(dá)93.25%、襄樊惠葡葡甘露聚糖總量達(dá)96.64%、魔芋全粉總量達(dá)99.53%，表明該方法能夠很好地用于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的檢測(cè)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法重復(fù)性驗(yàn)證

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，完全酸水解結(jié)合柱前衍生化的方法能夠很好的用于魔芋粉組成的測(cè)定，對(duì)該方法測(cè)定樣品的重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。4種魔芋粉檢測(cè)方法重復(fù)性的測(cè)定結(jié)果如表6所示。

表6 方法重復(fù)性驗(yàn)證（n=6）Table 6 Method repeatability validation (n=6) %

4種魔芋粉樣品中葡甘露聚糖和淀粉6組平行的測(cè)定值RSD≤4.40%，表明該方法重復(fù)性好，能夠用于魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的測(cè)定。

2.3.2 方法回收率驗(yàn)證

葡甘聚糖為大分子混合物，市面上沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品售賣(mài)。故在該實(shí)驗(yàn)中僅測(cè)定柱前衍生部分的回收率?；厥章拾尤氲母事短呛推咸烟菢?biāo)準(zhǔn)品的回收率以及折算回葡甘露聚糖和淀粉的回收率。4種魔芋粉檢測(cè)方法回收率的測(cè)定結(jié)果如表7所示。

表7 方法回收率驗(yàn)證Table 7 Method recovery validation %

4種魔芋粉樣品中甘露糖加標(biāo)回收率在87.98%～103.31%之間，RSD≤5.25%；葡萄糖加標(biāo)回收率在92.94%～107.57%之間，RSD≤3.25%；折算回葡甘露聚糖回收率在87.98%～103.31%之間，RSD≤5.25%；淀粉回收率在91.50%～108.05%之間，RSD≤7.67%?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果表明該方法回收率高，平行性好。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)檢測(cè)4種魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飛粉、葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量的高效液相色譜方法。魔芋精粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為62.69%和15.92%；魔芋飛粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為13.73%和42.16%；葡甘露聚糖樣品中葡甘聚糖和淀粉含量分別71.23%和16.38%；魔芋全粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為43.32%和24.04%。該方法同時(shí)測(cè)定4種魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量6組重復(fù)樣品間RSD≤4.40%，加標(biāo)回收率在87.98%～108.05%之間，RSD≤7.67。本方法可滿(mǎn)足魔芋粉樣品中葡甘聚糖和淀粉含量的同時(shí)測(cè)定，為魔芋粉樣品的分級(jí)提供可行的評(píng)價(jià)方法。