陳 菊

黔東南民族職業(yè)技術(shù)學院， 貴州 凱里 556000

續(xù)斷，為川續(xù)斷科，多年生草本植物，俗稱接骨草、南草、和尚頭等，臨床上常用于肝腎不足、腰膝酸軟、風濕痹痛、跌撲損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等疾病[1]。貴州是續(xù)斷的主產(chǎn)區(qū)之一，在其東南部境內(nèi)，常常生于路旁、溝邊、田埂及撂荒土地等潮濕處。目前對續(xù)斷的研究主要是其中的三萜皂苷類、揮發(fā)油、生物堿[2-3]等化學成分，續(xù)斷中還含有多糖成分,有關(guān)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化續(xù)斷多糖提取工藝及其抗氧化特性方面的研究鮮見報道。因此，本試驗以黔東南產(chǎn)續(xù)斷為材料，提取續(xù)斷中的多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并在體外測定其抗氧化活性，以期為進一步開發(fā)和利用續(xù)斷資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 續(xù)斷采自黔東南州境內(nèi)，洗凈，烘干；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)、維生素C、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮，分析純；蒸餾水，實驗室自制。

UV8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；MS204S型電子分析天平(精確度0.0001g)，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)；SYG-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；DUG-90764型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 續(xù)斷多糖的提取 續(xù)斷烘干品，粉粹→粗粉(5 g)，石油醚脫脂2次→以90%乙醇超聲提取2～3次→抽濾，棄去濾液，殘渣加水，水浴提取→活性炭脫色→減壓抽濾→用Sevag法脫蛋白→定容→測吸光度→計算提取率。

1.2.2 續(xù)斷多糖提取率的測定 精密稱取無水葡萄糖對照品0.0116 g,置于100 mL量瓶中,加水適量使溶解,稀釋至刻度,搖勻，即得標準溶液(每1 mL中含無水葡萄糖0.116 mg)。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，并加水補至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻，于水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白，在490 nm的波長處測定吸光度[4]。以葡萄糖對照品的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線并得出回歸方程：A=16.310C-0.075(R2=0.9998)。續(xù)斷多糖提取率按(1)式計算

(1)

式中：C為續(xù)斷提取液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為續(xù)斷多糖的定容體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗 選取料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1))、提取時間(30、60、90、120、150 min)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)和提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)為單因素，分別依次按照1.2.1進行續(xù)斷多糖提取的單因素試驗。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)之上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法對續(xù)斷中多糖的提取條件進行優(yōu)化，并對優(yōu)化條件進行驗證。試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表

1.2.5 續(xù)斷多糖抗氧化活性測定 取適量干燥的續(xù)斷多糖，配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的續(xù)斷多糖水溶液，備用。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻[5]的方法稍作修改，準確移取2.0 mL 不同濃度的續(xù)斷多糖水溶液液于比色管中，加入預(yù)先配置好的2.0 mL 2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其在517 nm 波長處吸光度A，同時測定樣品溶液在 517 nm 處的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在517 nm 處的吸光度A1，每個樣品重復(fù)3 次。清除率計算如(2)式所示。

(2)

1.2.5.2 羥基自由基清除能力測定 參考文獻[6]的方法稍作修改，取2.0 mL 不同濃度的續(xù)斷多糖溶液，依次加入2.0 mL 6 mmol 硫酸亞鐵、2.0 mL 6 mmol 水楊酸和2.0 mL 6 mmol/mL 雙氧水，混勻后在35 ℃水浴中反應(yīng)25 min后，在536 nm處測吸光度Ai。以蒸餾水代替雙氧水測定吸光值A(chǔ)j，空白對照以2.0 mL 蒸餾水代替續(xù)斷多糖溶液測定吸光度A0。清除率計算如(3)所示。

(3)

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 單因素試驗采用EXCEL、SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗采用Design-Expert 8.0.6進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖1所示，隨著料液比的增加，續(xù)斷多糖提取率逐漸增加，當料液比達1∶25時，提取率達最大，繼續(xù)增加料液比，提取率反而下降。這是因為液料比較小時，溶劑無法充分浸透，分子擴散速度低，使得提取率較低，隨著液料比的增大，溶劑與續(xù)斷細胞間的濃度差增加，增大了多糖從細胞內(nèi)部向溶劑主體的擴散系數(shù)，使提取率增大，當料液比超過1∶25后，繼續(xù)增加溶劑，由于溶劑過多，會導(dǎo)致細胞內(nèi)的其他物質(zhì)溶出，使提取率下降。因此，最佳料液比選擇1∶25。

2.1.2 提取時間對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖2所示，隨著提取時間的延長，續(xù)斷多糖提取率逐漸增大，當達最大值90 min時，提取率達最大，繼續(xù)延長提取時間，提取率反而下降。其原因可能是提取時間過長，多糖經(jīng)長時間的高溫浸泡，多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率下降。因此，最佳提取時間選擇90 min。

2.1.3 提取溫度對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖3所示，提取溫度在60～90 ℃之間，隨著溫度的升高，續(xù)斷多糖提取率逐漸增大，當溫度到達 90 ℃ 時，提取率達最大值，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降。這可能是溫度過高，會導(dǎo)致多糖開始降解，造成提取率下降。因此，最佳提取溫度選擇90 ℃。

2.1.4 提取次數(shù)對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖4所示，當提取次數(shù)在2～4之間時，續(xù)斷多糖提取率變化最為明顯，提取次數(shù)在3次時，提取率最大，提取次數(shù)超過3次以后，提取率逐漸減少。其原因可能是提取次數(shù)增多后提取液逐漸粘稠過濾困難，造成損失，導(dǎo)致提取率下降。因此，最佳提取次數(shù)選擇3次。

2.2 響應(yīng)優(yōu)化試驗結(jié)果與優(yōu)化分析

2.2.1 回歸模型的建立和顯著性檢測 采用Design-Expert 8.0.6 分析軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理設(shè)計29個試驗，其中4、12、13、22、27 五個試驗為中心試驗，其余試驗為析因試驗，結(jié)果如表2所示，續(xù)斷多糖提取率Y為響應(yīng)值。

由表2，可建立(4)式的四元二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

(4)

由表3、表4可知，該回歸模型P<0.0001，說明該二次方程模型為高度顯著，而失擬項不顯著(P=0.1532<0.05)，說明方程擬合效果好，CV%=3.29表明試驗的可信度和精確度高。因此，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。通過對回歸方程進行顯著性分析可知，二次項B2與C2達高度顯著，二次項A2、D2及一次項B、D均達極顯著，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對續(xù)斷多糖提取率均不顯著。因此，各因素對續(xù)斷多糖提取的影響順序從大到小依次為提取溫度、提取次數(shù)、提取時間、料液比。根據(jù)四元二次回歸模型，在所選取的各工藝條件范圍內(nèi)，由軟件分析得到提取續(xù)斷多糖的最佳條件為：料液比1∶24.78、提取溫度90.62 ℃、提取時間 91.8 min、提取次數(shù)2.62次，此條件下多糖提取率理論上為4.91%。根據(jù)實際操作要求，選取最佳提取工藝條件為料液比1∶25、提取溫度91 ℃、提取時間90 min、提取次數(shù)3次、試驗重復(fù)3次，得到提取率為4.74%，與理論值接近，由此得出該續(xù)斷多糖提取工藝條件具有較好的穩(wěn)定性和可操作性。

表3 回歸模型方差分析

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸模型的可靠性分析

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基(DPPH·)能力測定 續(xù)斷多糖清除DPPH自由基能力如圖5所示。在續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度增加，清除DPPH自由基能力增強。當質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，清除能力最強，達到93.9%，相同濃度下VC的清除率為105.9%，說明續(xù)斷多糖具有較強的清除DPPH自由基能力。

2.3.2 清除羥基自由基(·OH)能力測定 續(xù)斷多糖清除羥基自由基能力如圖6所示。在續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度增加，清除羥基自由基能力增強。當質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時，清除能力最強為68%，說明續(xù)斷多糖具有較強的清除羥基自由基能力。

3 討論

張丹等[7]運用正交試驗設(shè)計提取渝產(chǎn)續(xù)斷中的多糖，結(jié)果表明在料液比為1∶20(g·mL-1),提取時間60 min，提取4次的最佳工藝條件下，續(xù)斷多糖的平均提取率為7.47%，但并沒有將試驗中的各因素與指標的相互關(guān)系進行擬合，建立數(shù)學模型。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，得出影響續(xù)斷多糖提取的因素順序為提取溫度﹥提取次數(shù)﹥提取時間﹥料液比，并建立提取續(xù)斷多糖的回歸模型方程為：

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

通過對提取工藝中的參數(shù)進行優(yōu)化得到最佳提取條件為：料液比1∶25( g·mL-1)、提取溫度91 ℃、提取時間90 min、提取3次，在該條件下續(xù)斷多糖提取率為4.74%。此法比正交試驗設(shè)計直觀，試驗精度高，還提高了試驗的預(yù)測性，具有較好的實用價值。

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，對DPPH自由基的清除率可以作為評價物質(zhì)抗氧化活性的指標之一[8]。羥基自由基毒性極強，可對生物膜造成損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，清除體內(nèi)羥基自由基是確保機體健康必不可少的需求[9]。將本試驗中最佳提取條件下的多糖提取液進行抗氧化試驗，發(fā)現(xiàn)其具有較強的清除DPPH自由基、羥基自由基的能力，說明續(xù)斷具有良好的體外抗氧化活性。因此，該研究為續(xù)斷資源在抗氧活性方面的研究提供理論參考依據(jù)。