李欣蔚

（遼寧省農(nóng)科院糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽 110032）

水稻是我國主要糧食作物。在我國每年都會有大量的稻谷進(jìn)入倉庫儲藏[1]。稻谷一般儲備輪換年限是3年[2]。在儲藏階段，當(dāng)儲藏條件（環(huán)境溫度、環(huán)境濕度）達(dá)到適合真菌生長的條件時，真菌便會利用稻谷中的碳源大量生長繁殖，而真菌的不斷繁殖又會使得環(huán)境溫度升高，真菌產(chǎn)生的真菌毒素[3]，食用后威脅人類健康[4]。稻谷在儲藏過程中脂肪酸值的變化最為敏感，因此可以通過測定脂肪酸值來判斷稻谷的脂質(zhì)陳化程度[5]。

傳統(tǒng)的平板分離法需要對樣品進(jìn)行微生物的分離、純化、接種再培養(yǎng)分析，其中可培養(yǎng)的微生物只占總微生物的不到10%。因此對于稻谷中的真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的探究，傳統(tǒng)的平板分離法不能夠?qū)崿F(xiàn)[6,7]。而以樣品中提取的全部微生物DNA 為研究對象的高通量測序技術(shù)可以提供更加可靠的技術(shù)支持[8]。高通量測序技術(shù)采用大量構(gòu)建宏基因文庫，利用分子生物學(xué)信息比對手段，研究樣品中宏基因組中所包含的全部微生物信息，如微生物的遺傳組成以及微生物的菌群結(jié)構(gòu)、群落功能等，因此可以全面反映微生物群落組成情況及多樣性。目前已廣泛應(yīng)用于海洋[9,10]、腸道[11,12]、土壤[13,14]、糧食作物[15]、食品飲料[16,17]，甚至動物表皮[18]等不同生態(tài)類型的微生物群落結(jié)構(gòu)剖析，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[19]。

稻谷脂質(zhì)的陳化和霉菌的生長是造成儲藏稻谷品質(zhì)劣變的重要因素，往往發(fā)生在新收獲稻谷儲藏前期[20]。因此，本研究將以東北新收獲早粳稻為研究對象，選取稻谷水分在14.50%～15.50%的稻谷HW 和水分含量在13.50%～14.50%稻谷樣品LW，雜質(zhì)≤0.30%，模擬實倉儲藏條件進(jìn)行模擬儲藏，跟蹤18 個月的儲藏期進(jìn)行定期取樣檢測。采用高通量測序技術(shù)分析不同初始水分含量的稻谷在模擬實倉儲藏條件下，不同儲藏時期稻谷真菌群落的演替變化。為儲藏期間特定霉菌的防霉體系建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

以東北早粳稻稻谷作為研究對象，對新收獲的高水分早粳稻進(jìn)行自然晾干，通過水分測定儀測定，選取稻谷水分在14.50%～15.50%的稻谷HW 和水分含量在13.50%～14.50%稻谷樣品LW，雜質(zhì)≤0.30%，進(jìn)入模擬倉進(jìn)行模擬儲藏，跟蹤18 個月的儲藏期進(jìn)行定期取樣檢測。

模擬倉長寬均為1.10 m，高1.80 m，利用通風(fēng)方式，將儲藏條件調(diào)節(jié)為實倉儲藏條件（溫度17 ℃～25℃，相對環(huán)境濕度Relative Humidity，RH：45%RH～75% RH），糧面高度為1.20 m。按照實倉條件進(jìn)行模擬儲藏，儲藏溫度、濕度及取樣時間如表1（儲藏條件為即時計數(shù)）。按照表中條件各取樣150.00 g，稱取50.00 g 于無菌均質(zhì)袋中作為3 個平行樣品，于實驗室中4 ℃保存。

表1 取樣表Table 1 The table of samples

1.1.2 儀器和設(shè)備

PH-240(A)鼓風(fēng)干燥箱，JXFM110 型錘式旋風(fēng)磨。

1.1.3 試驗試劑

無水乙醇、酚酞指示劑、0.025 mol/L 的氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定液。

1.2 試驗方法

1.2.1 水分的測定

參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》第一法直接干燥法測定樣品水分含量。

1.2.2 脂肪酸值的測定

參照GB/T 15684-2015《谷物碾磨制品脂肪酸值的測定》測定樣品脂肪酸值。

1.2.3 樣品基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

采用Miseq-PE250 測序平臺，利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫。將合格的各上機(jī)測序文庫梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH 變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

使用MiSeq 測序儀進(jìn)行雙端測序，利用QIIME2 dada2 分析軟件、Vsearch 軟件進(jìn)行序列去噪和OTU聚類，利用QIIME2、R 語言ggplot2 包進(jìn)行Alpha 多樣性、Beta 多樣性分析以及分類學(xué)組成分析，利用R腳本、VenDiagram 包、plotrix 包制作OTU 韋恩圖和PCA 主成分分析，利用R 腳本、pheatmap 包繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品水分、脂肪酸值變化情況

如圖1，兩組稻谷水分含量在儲藏第一、第二儲藏期均有所下降，直至第三儲藏期保持平穩(wěn)。其中，高水分稻谷HW 水分含量由15.50%降低至15.09%；低水分稻谷LW 水分含量由14.21%降低至13.59%，低水分稻谷LW 下降幅度更大（14.21%降至13.59%）。

兩組稻谷脂肪酸值的變化趨勢呈現(xiàn)差異。其中，高水分稻谷HW 脂肪酸值在第一儲藏期有所上升，由初始狀態(tài)13.61 mg KOH/100 g 升高至16.27 mg KOH/100 g，在第二儲藏期升高幅度有所減少，由16.20 mg KOH/100 g 升高至16.72 mg KOH/100 g，在第三儲藏期脂肪酸值趨于穩(wěn)定16.66 mg KOH/100 g。而低水分稻谷組LW 在第一儲藏期脂肪酸值保持穩(wěn)定趨勢（13.61～13.73 mg KOH/100 g），在第二儲藏期升幅劇烈（13.73～16.41 mg KOH/100 g），并在第三儲藏期趨于穩(wěn)定（16.27 mg KOH/100 g）。由此可見，兩組水分的稻谷的水分、脂肪酸值的變化均在第三儲藏期趨于穩(wěn)定，這意味著兩組稻谷中真菌群落所處的微生態(tài)環(huán)境趨于穩(wěn)定。因此選取原始狀態(tài)下的兩種水分稻谷（HW、LW），第一儲藏期和第二儲藏期結(jié)束后的稻谷（HWS1、HWS2、LWS1、LWS2）進(jìn)行宏基因組的提取和ITS 區(qū)的測序，進(jìn)而對其真菌群落的演替進(jìn)行分析。

2.2 樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Illumina 平臺對群落DNA 片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測序。18 份稻谷樣品所產(chǎn)生的有效序列數(shù)量通過分組求平均值，如表2 所示，其中HW 樣品獲得了較多的原始序列量179179 和高質(zhì)量序列量150293。18份樣品共有799295條有效序列長度為226，有412472 條有效序列長度為259，如圖2。

表2 稻谷的測序數(shù)據(jù)Table 2 High-throughput sequencing data of samples

樣品的豐度等級曲線是將樣本中的OTU 按其豐度大小沿橫坐標(biāo)依次排列，并以各自的豐度值為縱坐標(biāo)，從而反映各樣本中OTU 豐度的分布規(guī)律。如圖3，LW 曲線跨度最小，折線最陡峭，說明低水分稻谷進(jìn)入儲藏前OTU 數(shù)較少，且均勻度較低。而樣品HWS1，HWS2 跨度最大，折線平緩，說明高水分稻谷進(jìn)入儲藏后OTU 數(shù)量開始增多，且群落組成的均勻度較高，群落中的物種開始生長繁殖。這說明，原始水分含量和儲藏時間有助于稻谷真菌群落豐富度和均勻度的增長。

2.3 稻谷中真菌的分類單元統(tǒng)計

利用自編perl 腳本分析軟件，通過對抽平后的ASV/OTU 進(jìn)行統(tǒng)計，可以獲得每個樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成，可以計算不同樣本在各分類水平所含有的分類單元數(shù)目。依據(jù)序列物種分類學(xué)注釋的結(jié)果以及選擇的樣品，統(tǒng)計這些樣本的物種注釋結(jié)果中門、綱、目、科、屬、種六個分類水平各自含有的分類單元的數(shù)量。如圖4，不同的分類水平由不同顏色標(biāo)識，柱子高度對應(yīng)分類單元數(shù)量。兩種水分稻谷在門的水平下的分類單元數(shù)量隨著儲藏時間的延長均有所增加。

2.4 稻谷中真菌群落多樣性指數(shù)性分析

為了能夠較為全面的評估樣品中真菌菌群的Alpha 多樣性，本實驗以Chao1[21]和Observed species指數(shù)表征樣品真菌菌群豐富度，以Shannon[22]和Simpson[23]指數(shù)表征多樣性，以Pielou’s evenness[24]指數(shù)表征均勻度，以Good’s coverage[25]指數(shù)表征覆蓋度。如圖5 箱線圖中，18 份稻谷樣本的Coverage 指數(shù)均達(dá)到0.99，說明測序結(jié)果的覆蓋度符合要求。

Chao1，Simpson 指數(shù)，高水分組稻谷先下降，后上升，多樣性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，HWS2＞HW＞HWS1；而低水分組稻谷多樣性呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，LW＜LWS1＜LWS2。這說明與低水分稻谷相比，高水分稻谷進(jìn)入儲藏前已攜帶種類較多的真菌（HW＞LW），而進(jìn)入儲藏以后這部分真菌受到儲藏條件的限制而大量死亡，因此多樣性指數(shù)開始下降（HWS1＜HW）。由于稻谷本身水分偏高，這為儲藏真菌的生長繁殖提供了適宜環(huán)境，因此隨著儲藏時間的延長高水分稻谷的真菌多樣性指數(shù)開始升高（HWS2＞HW＞HWS1）。而低水分稻谷由于自身水分偏低，進(jìn)入儲藏前攜帶的真菌種類較少，進(jìn)入儲藏后儲藏真菌開始大量繁殖，因此隨著儲藏時間的延長，多樣性指數(shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢（LW＜LWS1＜LWS2）。由此可見，稻谷本身的水分含量越高越有利于真菌的生存。

2.5 稻谷中真菌在不同分類水平下的組成差異分析

如圖6，兩種水分稻谷在不同儲藏時期的真菌群落在門的水平上分類為5 個菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、羊肚菌門（Mortierellomyco）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）。其中子囊菌門（Basidiomycota）真菌在高水分稻谷（HW）中，隨著儲藏時間的延長，其數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢（HW，53.20%；HW1，74.60%；HW3，55.80%）。而在低水分稻谷（LW）中，隨著儲藏時間的延長，其數(shù)量表現(xiàn)為持續(xù)增加的趨勢（HW，44.60%；HW1，73.90%；HW2，85.40%）。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）真菌在高水分稻谷（HW）中隨儲藏時間的延長數(shù)量持續(xù)增加（HW，11.20%＜HWS1，2.40%＜HWS2，39.80%）；而在低水分稻谷（LW）中隨儲藏時間的延長數(shù)量先增加后減少（LW，3.20%＜LWS1，12.20%＞LWS2，8.60%）。

兩種水分稻谷在不同儲藏時期的真菌群落在種的水平上進(jìn)行分類統(tǒng)計，如圖7，選取相對豐度較高的10 個物種繪制成表，如表 3。其中稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、金黃色蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema_aurea）、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）在高水分稻谷HW 樣品中的相對豐度隨著儲藏時間的延長逐漸上升（HW＜HWS1＜HWS2）；黑粉菌（Filobasidium_magnum)、稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、Hannaella_zeae的相對豐度隨著儲藏時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（HW＜HWS1＞HWS2）；Papiliotrema_fuscus的相對豐度則是隨著儲藏時間的延長先降低后上升（HW＞HWS1＜HWS2）；彎孢菌（Curvularia_inaequalis）經(jīng)歷第一次儲藏期后相對豐度降為0，可以認(rèn)為該物種在高水分稻谷中幾乎消失。在低水分稻谷中，彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）、Hannaella_zeae在最初取樣時的相對豐度為0，而在經(jīng)歷兩個儲藏期后相對豐度有所上升（LW＜LWS1＜LWS2）；黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、黑粉菌（Filobasidium_magnum)、Mycosphaerella_tassiana、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）的相對豐度隨著儲藏時間的延長持續(xù)降低（LW＞LWS1＞LWS2）；稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、Papiliotrema_fuscus、金黃色蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema_aurea）的相對豐度先上升后降低（LW＜LWS1＞LWS2）。其中，稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、金黃色蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema_aurea）、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）在高水分稻谷中占有較大比例，且隨著儲藏期的延長，其豐度持續(xù)上升，這與徐園程[26]在20 ℃，43% RH 儲藏條件下稻谷的主要菌種是黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）的結(jié)果一致。其中黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）會引起一種癥狀與稻瘟病相似的新型葉斑病，其病原尚無鑒定報道，會嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量及品質(zhì)[27]。因此控制稻谷進(jìn)入儲藏前的水分含量來減少病原真菌的產(chǎn)生[28]，才能從源頭上保證稻谷品質(zhì)的品質(zhì)安全。而與此不同的是，有學(xué)者通過對安徽省國屬糧庫中秈稻樣品進(jìn)行優(yōu)勢菌種的分析發(fā)現(xiàn)，曲霉菌屬是儲藏期稻谷的優(yōu)勢菌屬之一[29]。微生物的群落變化是微生物本身與其所處環(huán)境（稻谷品質(zhì)、環(huán)境溫濕度）相互作用的結(jié)果，不同環(huán)境中的同種微生物或者同一環(huán)境中的不同微生物生長和代謝均存在著差異[30]。因此可以推測，稻谷的品種以及產(chǎn)地可能是影響儲藏期間優(yōu)勢菌種的原因之一。值得注意的是，兩種水分的稻谷在第二儲藏期結(jié)束時也存在共有的優(yōu)勢菌種，如彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）。其中彎孢菌（Curvularia_inaequalis）為過渡真菌，意味著隨后會向儲藏真菌演替[31]。

表3 各優(yōu)勢菌種在樣品中所占豐度Table 3 Abundances of dominant species in the samples

2.6 稻谷中真菌的物種組成及豐度熱圖

為了進(jìn)一步比較樣本間的物種組成差異，實現(xiàn)對各樣本的物種豐度分布趨勢的展示，可以使用熱圖進(jìn)行物種組成分析，默認(rèn)使用平均豐度前20 位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。如圖8。在高水分稻谷HW 中，隨著儲藏時間的延長，線黑粉酵母菌屬（Filobasidium）、曲霉菌屬（Aspergillus）、白布勒擔(dān)孢酵母菌屬（Bulleromyces）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、隱球菌屬（Cryptococcus）、Papiliotrema、漢納酵母菌屬（Hannaella）、Sporobolomyces、Symmetrospora的相對豐度增加，菌屬Didymella、Kondoa的相對豐度降低；在低水分稻谷LW 中，隨著儲藏時間的延長，菌屬Neosetophoma、Didymella的相對豐度降低，到第二儲藏期時相對豐度降為0；菌屬Magnaporthe、Curvularia、Coniothyrium、Neosetophoma的相對豐度增加。同時，在儲藏初期，高水分稻谷（HW）和低水分稻谷（LW）中真菌的群落組成具有相似性，其優(yōu)勢菌屬均為Neosetophoma、Didymella。到了第二儲藏期，高水分稻谷（HWS2）和低水分稻谷（LWS2）中真菌的群落組成在屬的水平上發(fā)生變化，優(yōu)勢菌屬發(fā)生了明顯的演替，有研究表明這是由于儲藏過程中稻谷的代謝產(chǎn)物累積后產(chǎn)生了相互抑制的作用[32,33]。

2.7 不同水分稻谷真菌群落差異分析

通過Ven 圖進(jìn)行群落分析，可以探究不同樣本間共有物種和獨有物種，如圖9。通過高水分稻谷（HW）和低水分稻谷（LW）進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，HW 與LW 共有的OTU 數(shù)量為71 個，HW 具有的特性O(shè)TU 數(shù)量較多為97個。隨著儲藏時間的延長，通過HWS2與LWS2對比發(fā)現(xiàn)，兩組樣品共有的OTU 數(shù)量增加至114，兩組樣品各自具有的特性O(shè)TU 增加至137 和145。在高水分稻谷HW 儲藏階段，三個儲藏期的樣品具有的共同OTU 數(shù)量為68 個，儲藏的時間越長，樣品具有的特性O(shè)TU 數(shù)量越多（HW＜HWS1＜HWS2）；在低水分稻谷LW 儲藏階段，三個儲藏期的樣品具有的共同OTU 數(shù)量為49 個，隨著儲藏時間的延長，樣品具有的特性O(shè)TU 數(shù)量越多（LW＜LWS1＜LWS2）。由此可見，在進(jìn)入儲藏前高水分稻谷的真菌群落豐富度高于低水分稻谷，而隨著儲藏的進(jìn)行，高水分稻谷的真菌群落豐富度依然高于低水分稻谷。而盡管是低水分稻谷，在儲藏階段其真菌群落物種豐富度也在增加。通過高通量測序技術(shù)可以獲取到很多真菌種類及其豐度方面的信息，但也只有一部分真菌會在儲藏條件下進(jìn)一步生長發(fā)育并且需要在一定條件下對稻谷產(chǎn)生不良影響[34]。

2.8 Beta 多樣性分析

依據(jù)Yurkov[35]的方法對兩種水分的稻谷進(jìn)行PCA 分析（Principal Component Analysis）。如圖10，圖中不同水分含量、不同儲藏期的稻谷中真菌群落距離越近，則表示群落相似度越高。其中，高水分稻谷和低水分稻谷在第一儲藏期（HWS1 和LWS1）位置相對較近，說明這兩種狀態(tài)下的稻谷樣品中真菌群落多樣性差異較?。坏退值竟仍谠紶顟B(tài)和第一儲藏期（LW 和LWS1）的位置相對較近，說明低水分稻谷在第一儲藏期內(nèi)的真菌群落多樣性變化較??；而低水分稻谷在第二儲藏期（LWS2）與低水分稻谷其他儲藏期的樣品位置較為分散，說明其真菌群落多樣性差異較大。而高水分稻谷（HW、HWS1、HWS2）在三個儲藏狀態(tài)下位置間均相對分散，說明稻谷樣品直接真菌群落物種多樣性差異較大。由此可見，低水分稻谷在第一儲藏期之前的真菌群落多樣性變化較小，進(jìn)入第二儲藏期后真菌群落多樣性增加；而高水分稻谷在每個儲藏期的真菌群落多樣性均有所增加，真菌群落發(fā)生明顯演替。

3 結(jié)論

本實驗通過測定不同初始水分含量的稻谷在不同儲藏期的水分、脂肪酸值的變化趨勢，確定了將第一、第二以及原始樣品作為高通量測序的研究對象來分析稻谷中真菌群落的演替變化。采用Illumina 平臺對18份稻谷樣品的DNA 片段進(jìn)行雙端測序后發(fā)現(xiàn)，高水分稻谷的多樣性先降低后升高；而低水分稻谷的多樣性持續(xù)升高。由此可見，水分仍是從儲藏源頭抑制真菌活動的關(guān)鍵因素。通過對OTU 進(jìn)行物種分類，結(jié)果表明，兩種水分的稻谷隨著儲藏時間的延長，其真菌群落經(jīng)歷了不同的演替變化，高水分稻谷在每個儲藏期，真菌群落都發(fā)生了明顯演替。到第二儲藏期時，稻瘟病菌（Magnaporthe_grisea）、金黃色蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema_aurea）、彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、黑孢霉（Neosetophoma_samararum）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）成為了高水分稻谷中的優(yōu)勢菌種。而低水分稻谷在第一儲藏期內(nèi)，真菌群落并沒有發(fā)生明顯的演替變化，但是真菌群落的組成和豐度持續(xù)增加，而在第二儲藏期結(jié)束后真菌群落才發(fā)生演替，到第二儲藏期時，彎孢菌（Curvularia_inaequalis）、漢納酵母菌（Hannaella_sinensis）、Hannaella_zeae成為了優(yōu)勢菌種。因為活躍的真菌活動會影響糧堆溫度甚至是儲藏溫度，因此在儲藏條件不受人工干預(yù)時，兩種水分的稻谷都會發(fā)生由田間真菌向儲藏真菌的演替。為了有效抑制演替現(xiàn)象的發(fā)生，在儲藏前期應(yīng)及時采取空調(diào)控溫或通風(fēng)措施來抑制微生物活動導(dǎo)致的持續(xù)高溫，以此來保證儲糧安全。