李真，姬生鑫，梁靜靜，索標(biāo)，范會平，艾志錄*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450002）

（2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點實驗室，河南鄭州 450002）

釀酒酵母是與人類關(guān)系最為密切一種酵母，釀酒酵母菌體中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)成分，是良好的膳食補(bǔ)充劑，這些營養(yǎng)成分經(jīng)過不斷的研究開發(fā)可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等領(lǐng)域[1]。但其在食品制造中最主要的應(yīng)用還是發(fā)酵，如釀酒工業(yè)[2]、奶制品行業(yè)[3]、調(diào)味品[4]以及發(fā)酵面食加工領(lǐng)域[5]等。與濕酵母相比，活性干酵母具有含水量低、復(fù)水快、性能穩(wěn)定、易于運(yùn)輸和使用方便等優(yōu)點。

目前，常用的酵母干燥保藏方法主要有：真空冷凍干燥、流化床干燥、噴霧干燥，相對于流化床干燥和噴霧干燥，真空冷凍干燥技術(shù)酵母的存活率較高，對于熱較為敏感的酵母菌有更大的優(yōu)勢，受到大家的青睞。但在實際干燥過程中依然會不可避免的出現(xiàn)細(xì)胞不可逆損傷，細(xì)胞死亡活力下降等問題。因此需要采取相應(yīng)的保護(hù)措施，其中凍干保護(hù)劑是比較常用的提高菌劑凍干存活率和穩(wěn)定性的有效方法，目前常用的保護(hù)劑主要有脫脂奶粉、山梨醇、甘油[6]、海藻糖、谷氨酸鈉[7]、蔗糖、乳糖、抗壞血酸、菊粉、甘露醇[8]等。宋志遠(yuǎn)[9]研究得出以脫脂乳粉5%、甘露醇4%、抗壞血酸3%比例作為果蔬生防酵母細(xì)胞的復(fù)合凍干保護(hù)劑，酵母細(xì)胞存活率可以達(dá)到83.64%。周秋陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)以海藻糖12.45 g/100 mL、谷氨酸鈉13.56 g/100 mL、山梨醇5.43 g/100 mL 作為酵母復(fù)合凍干保護(hù)劑時，酵母細(xì)胞凍干存活率達(dá)84.21%。王華等[11]采用聚乙二醇1.10 g/100 mL、L-谷氨酸鈉7.07 g/100 mL、蔗糖14.15 g/100 mL 作為熱帶假絲酵母菌復(fù)合凍干保護(hù)劑時，凍干存活率為82.73%。Han[12]研究表明以脫脂奶粉1.5%、聚乙二醇0.1875%、海藻糖5.25%配比的復(fù)合低溫保護(hù)劑，凍干海洋酵母Sporidiobolus pararoseusZMY-1 的存活率為93.9%。Zhang[13]研究表明以海藻糖20%、谷氨酸鈉2%、5%聚乙烯吡咯烷酮和20%脫脂牛奶配比的復(fù)合低溫保護(hù)劑，凍干畢赤酵母的存活率為79.4%。蔡孟軒等[14]優(yōu)化了橄欖假絲酵母的保護(hù)劑配方，最終配方為海藻糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉按15%、10%、2%的比例混合，所得酵母存活率為69.7%。然而，迄今為止國內(nèi)外將β-葡聚糖作為凍干保護(hù)劑的研究較少，以燕麥β-葡聚糖為主，與γ-聚谷氨酸和甘露醇復(fù)合作為酵母凍干保護(hù)劑的研究更是未見報道。燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸為不能自由通過細(xì)胞膜的大分子非滲透型保護(hù)劑。

不同類型保護(hù)劑的作用機(jī)制差異較大，復(fù)配使用不同類型保護(hù)劑相互協(xié)調(diào)更能效減小微生物在冷凍過程中的死亡率。燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸為不能自由通過細(xì)胞膜的大分子非滲透型保護(hù)劑；甘露醇是可以自由通過細(xì)胞膜的小分子滲透型保護(hù)劑，并且也可以在水中形成無定型結(jié)構(gòu)來維持蛋白的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞膜蛋白的聚集，保護(hù)細(xì)胞膜骨架不受損害。因此，為進(jìn)一步提高釀酒酵母在冷凍及干燥等各種不利環(huán)境下的存活率。本研究以燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇為凍干保護(hù)劑，并利用中心復(fù)合試驗設(shè)計（CCD）優(yōu)化得出酵母存活率最高時冷凍干燥保護(hù)劑最佳添加比，為后期釀酒酵母的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為新型酵母凍干保護(hù)劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種及培養(yǎng)基

本試驗所使用的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）從安琪高活性酵母中分離得到；YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨2.0%、酵母浸粉1%，121℃滅菌20 min。

1.1.2 主要試劑

燕麥β-葡聚糖（純度80%）由張家口一康生物科技有限公司提供；胰蛋白胨、酵母浸粉購于賽默飛世爾科技有限公司；γ-聚谷氨酸購于西安四季生物科技有限公司；甘露醇購于浙江一諾生物科技有限公司。燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇為食品級，其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

5430R 型離心機(jī)，eppendorf 有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；BPMJ-150F 型培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BTP.8XL型冷凍干燥機(jī)，德祥科技有限公司；SZCL-4A型智能磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TP614000A 型顯微鏡，杭州圖譜光電科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備與冷凍干燥

參照邵明倩[15]酵母凍干粉制備方法略作修改，將酵母菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，離心速度為6000 r/min，離心5 min，離心溫度為20 ℃，無菌水洗滌兩次。菌泥與保護(hù)劑質(zhì)量比為1:2，30 ℃恒溫箱中平衡60 min，之后于-18 ℃冰箱中預(yù)凍8 h，預(yù)凍結(jié)束后迅速放入真空冷凍干燥機(jī)中。凍干工藝：冷阱溫度-75 ℃，真空度145～155 mT，凍干時間20 h。

1.2.2 凍干存活率的計算

酵母凍干粉用0.85%的無菌生理鹽水復(fù)水至凍干前體積，溶解之后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化30 min，利用美蘭染色法測定酵母凍干存活率[16]，存活率計算見下式。

1.2.3 單因素輪換試驗

選取燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇作為凍干保護(hù)劑，首先固定γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量為0.167%、1.33%，燕麥β-葡聚糖添加量依次為4%、5%、6%、7%、8%，可以得到最優(yōu)燕麥β-葡聚糖添加量。固定最優(yōu)燕麥β-葡聚糖添加量和甘露醇添加量1.33%，γ-聚谷氨酸的添加量依次為0.033%、0.1%、0.167%、0.233%、0.3%，得到最優(yōu)γ-聚谷氨酸添加量。最后固定最優(yōu)燕麥β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸添加量，甘露醇的添加量依次為0.33%、0.67%、1%、1.33%、1.67%，得到最優(yōu)甘露醇添加量。上述保護(hù)劑的配置均用無菌水在恒溫75 ℃磁力攪拌器中溶解均勻，冷卻至室溫備用。

1.2.4 中心組合設(shè)計

根據(jù)單因素輪換試驗結(jié)果得到的燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇三個最優(yōu)的添加量，將這三個點作為中心組合設(shè)計的中心點進(jìn)行試驗設(shè)計，以酵母凍干存活率為響應(yīng)值，確定釀酒酵母冷凍干燥保護(hù)劑的最優(yōu)組合。試驗因素水平見表1。

表1 中心優(yōu)化組合試驗變量和水平Table 1 Test variables and levels of the centrally optimized combined design

1.2.5 掃描電鏡觀察

掃描電鏡樣品的處理參考張嗣萍等[17]的方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)3 次，結(jié)果用X±SD 表示。試驗數(shù)據(jù)全部采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗和單因素方差分析，利用Design-Expert 8.06 軟件的Central Composite Design 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素輪換試驗

2.1.1 燕麥β-葡聚糖對酵母凍干存活率的影響

在冷凍干燥過程中，以氫鍵形式與蛋白質(zhì)極性基團(tuán)連接的水分子逐漸被脫去，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，功能失調(diào)；但是含有多羥基結(jié)構(gòu)的保護(hù)劑能夠代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹蛋白表面，從而維持蛋白結(jié)構(gòu)和功能[18]。由表1 可知，隨著燕麥β-葡聚糖添加量的增大，酵母細(xì)胞的凍干存活率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。當(dāng)燕麥β-葡聚糖添加量為6%時，酵母細(xì)胞存活率達(dá)到最大，為80.57%?？赡苁且驗檠帑湨?葡聚糖作為大分子化合物能夠以“包裹”的方式來保護(hù)細(xì)胞也可能是大分子化合物在保護(hù)細(xì)胞的同時還可以促進(jìn)小分子化合物對細(xì)胞作用效果[19]。Crowe 等[20]研究發(fā)現(xiàn)糖能夠取代細(xì)胞膜表面的水分子，從而避免干燥引起的細(xì)胞膜的有害相變。Desmond等[21]發(fā)現(xiàn)凍干Lactobacillus paracaseiNFBC338 時，在脫脂乳保護(hù)劑基礎(chǔ)上，另外添加葡聚糖后菌體的貯藏穩(wěn)定性較單獨添加脫脂乳組顯著改善。試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)濃度越高β-葡聚糖（≥7%），冷卻時越易形成凝膠，不利于后期操作和酵母的均勻分散，也可能是此原因致使β-葡聚糖濃度過高時酵母活菌數(shù)反而降低。

2.1.2γ-聚谷氨酸對酵母凍干存活率的影響

由圖2 可知，隨著γ-聚谷氨酸添加量的增大，酵母細(xì)胞的凍干存活率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。當(dāng)γ-聚谷氨酸添加量為0.13%時，酵母細(xì)胞存活率達(dá)到最大，為80.57%；之后隨著γ-聚谷氨酸的添加量的升高，酵母細(xì)胞凍干存活率呈現(xiàn)出一個先下降后趨于平緩的趨勢。Bhat[22]通過透射電鏡觀察得到γ-聚谷氨酸作為凍干保護(hù)劑時，可以將細(xì)胞包裹起來從而減少細(xì)胞受到冷凍干燥的損傷。

2.1.3 甘露醇對酵母凍干存活率的影響

甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些保護(hù)劑配方中它能夠兼作蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑[23]。由圖3 可知，隨著甘露醇添加量的增大，酵母細(xì)胞的凍干存活率呈現(xiàn)先顯著上升，后顯著下降的趨勢。當(dāng)甘露醇添加量為1%時，酵母凍干存活率達(dá)到最大，為87.18%，并且隨著甘露醇添加量的升高，酵母細(xì)胞存活率呈現(xiàn)一個顯著下降的趨勢。可能是因為甘露醇對蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而濃度與結(jié)晶狀態(tài)有時又有一定的關(guān)聯(lián)性[24]。Izutsu[25]研究表明較低濃度（1%或更低）的甘露醇通過形成無定型結(jié)構(gòu)來保護(hù)蛋白質(zhì)免于聚集，但在更高濃度下，甘露醇通過形成晶體結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的聚集。無定型結(jié)構(gòu)的甘露醇會促進(jìn)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，而高濃度的甘露醇形成的晶體結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)沒有保護(hù)作用，甚至還會促進(jìn)水分子對細(xì)胞的破壞[26]。因此當(dāng)甘露醇濃度高于1%時酵母細(xì)胞存活率呈現(xiàn)一個顯著下降的趨勢。

2.2 酵母冷凍干燥保護(hù)劑的中心響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，以燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量為因素，由Design-Expert 8.06軟件設(shè)計3 因素3 水平的20 組響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案，結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)曲面二次回歸模型的建立及顯著性檢驗

采用中心響應(yīng)面法（CCD）研究了燕麥β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇水平對冷凍干燥后酵母細(xì)胞存活率的影響。這三個自變量的水平見表1。根據(jù)表2 可知，共進(jìn)行了20 次不同組合試驗。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，用二次多項式方程表示凍干后酵母細(xì)胞的存活率：

表2 Central Composite Design 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Central Composite Design response surface test design scheme and results

式中：

Y——凍干酵母細(xì)胞存活率，%；

A——燕麥β-葡聚糖；

B——γ-聚谷氨酸；

C——甘露醇。

為了評估擬合的二次多項式模型的顯著性和充分性，由表3 可知，Pmodel＞F 并小于0.0001，說明該模型非常顯著，表明建立的模型與試驗數(shù)據(jù)相符。失擬項可以反應(yīng)所建模型與試驗的擬合程度，p=0.4584＞0.05，不顯著，說明試驗點均能用模型進(jìn)行描述，且上述擬合的二次回歸方程能夠很好地預(yù)測酵母凍干后的存活率。多項式模型的擬合優(yōu)度可以通過決定系數(shù)R2和相關(guān)系數(shù)R 來檢驗。在這種情況下，得到的R2=0.9827 意味著只有1.73%的響應(yīng)的可變性不能被模型解釋。相關(guān)系數(shù)R=0.9672，表明試驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果吻合較好，模型具有較高的意義。

表3 酵母存活率響應(yīng)曲面二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance for yeast survival rate response surface quadratic regression model

2.3 響應(yīng)面圖及等高線圖分析

響應(yīng)面分析法不但能夠分析各反應(yīng)因素對目標(biāo)值的影響，還能對最佳反應(yīng)條件進(jìn)行預(yù)測優(yōu)化。由圖4、圖5、圖6 顯示了方程的三維響應(yīng)面，證實了擬合面有真實的最大值。當(dāng)其中一種物質(zhì)的濃度一定時，酵母凍干存活率隨著其他兩種物質(zhì)濃度的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，說明響應(yīng)曲面中存在極大值點，即存在保護(hù)劑最佳濃度。通過軟件計算得到方程的極值點，燕麥β-葡聚糖添加量為6.56%、γ-聚谷氨酸添加量為0.15%、甘露醇添加量為1.15%，此時通過響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測得到平均存活率為89.86%，最大時可達(dá)90.69%。

2.4 燕麥β-葡聚糖復(fù)合保護(hù)劑對菌體形態(tài)的影響

利用掃描電鏡對冷凍干燥后酵母細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行研究，由圖7a 可知，未添加燕麥β-葡聚糖復(fù)合保護(hù)劑部分酵母細(xì)胞出現(xiàn)較多的褶皺、破裂現(xiàn)象，說明在冷凍和冷凍干燥過程中會損傷酵母細(xì)胞。由圖7b，在添加燕麥β-葡聚糖復(fù)合保護(hù)劑后，未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞出現(xiàn)褶皺、破裂的現(xiàn)象，說明燕麥β-葡聚糖復(fù)合保護(hù)劑的添加可以維持酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)不被冷凍和冷凍干燥破壞，并且維持復(fù)水過程中酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究通過中心優(yōu)化響應(yīng)面法優(yōu)化了以燕麥β-葡聚糖為主的釀酒酵母細(xì)胞冷凍干燥保護(hù)劑配方，首先通過單因素試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后通過中心響應(yīng)面優(yōu)化試驗擬合出一個三元二次多項式方程，得到最佳配方：燕麥β-葡聚糖6.56%、γ-聚谷氨酸0.15%、甘露醇1.15%，酵母凍干存活率達(dá)到最高，為90.69%，與理論預(yù)測值酵母存活率89.86%接近。通過對釀酒酵母的凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化，可以為釀酒酵母凍干保護(hù)研究提供理論參考，該配方酵母細(xì)胞存活率可達(dá)90.69%，具有較高的市場應(yīng)用價值。