劉 建，吳華昌，鄧 靜，劉 陽

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510230；2.四川旅游學(xué)院，四川成都 610199）

耙柑學(xué)名春見柑橘，品皮薄，果皮與肉質(zhì)分離。川渝地區(qū)俗稱“軟”為“耙”，故稱耙耙柑，其果肉為橙色，肉質(zhì)脆嫩、多汁、囊壁薄、化渣，糖度高，風(fēng)味濃郁，清甜，少籽與無籽。柑橘果肉中含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素等多種健康因子，耙耙柑含糖在14 %以上，酸度為1 %左右，油富含人體所需的維C、鐵、鈣、磷、檸檬酸、維生素C、胡蘿卜素等，可溶性固形物14.5%，具有止咳化痰、潤腸去火、排毒養(yǎng)顏、疏肝健脾等多重功效。

耙耙柑作為四川特色水果，種植面積和種植量較大，但由于季節(jié)性成熟，耙耙柑滯銷嚴(yán)重，導(dǎo)致耙耙柑資源浪費嚴(yán)重。因此，本研究旨在利用耙耙柑發(fā)酵制作成果酒，既能增強口感，降低酒精度，滿足營養(yǎng)需求，又能增加耙耙柑加工途徑，豐富耙耙柑加工產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原料耗材及試劑

耙耙柑，產(chǎn)地為四川眉山；果膠酶，柚苷酶，蔗糖，活性炭，檸檬酸，氫氧化鈉，酚酞指示液，葡萄糖，購于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

BT42 超純水機，上海睿析科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C 型恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；EK328 香山電子稱，廣東山衡器集團股份有限公司；CJJ0003 電磁攪拌器，金壇新瑞有限公司；LC20012598 手持酸度計，上海力辰有限公司；H032333糖度儀，北京元速動力科技有限公司；ZL-511ATC 手持酒精折光儀，四川中浪科技有限公司；京制00000113 號紫外可見分光廣度計，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

耙耙柑→去皮核→榨汁→酶解→過濾→脫苦→裝瓶→發(fā)酵→取液→滅菌裝瓶

1.2.2 操作要點

原料的選取和處理：選用新鮮飽滿成熟的耙耙柑，人工剝皮，盡量去掉白色橘絡(luò)，以防止苦味物質(zhì)的增加。耙耙柑榨汁前加入0.1 %的檸檬酸，防止耙耙柑汁液變色。酶解時加入0.2%的果膠酶攪拌均勻，在燒杯口蓋上保鮮膜，放入45 ℃的水浴鍋內(nèi)靜置1 h。酶解后加入0.12 %的柚苷酶攪拌均勻，在燒杯口蓋上保鮮膜，放入50 ℃的水浴鍋內(nèi)靜置2 h。在發(fā)酵前，加入適量的蔗糖，調(diào)節(jié)糖度為一定值，再加入0.03 %活化好的干酵母，攪拌均勻。最后放入恒溫箱內(nèi)，調(diào)制一定的溫度，進行發(fā)酵。

1.2.3 前處理優(yōu)化工藝

目前柑橘果酒產(chǎn)業(yè)化加工較少，主要原因是柑橘加工后會產(chǎn)生苦味。這類苦味物質(zhì)嚴(yán)重影響了柑橘果酒的口感,給消費者帶來不愉快的體驗，對感官評分產(chǎn)生影響。榨汁后加入果膠酶，用柚苷酶或活性炭對果汁進行脫苦，以感官評定為依據(jù)判定最佳的果膠酶用量和脫苦方式。

1.2.4 發(fā)酵工藝條件單因素實驗

初始發(fā)酵條件：12 %蔗糖添加量，0.02 %酵母添加量，24 ℃發(fā)酵溫度，6 d 發(fā)酵天數(shù)，改變其中一個因素，固定其他工藝參數(shù)，最終以酒精度、感官評分、透光率、可溶性固形物、糖酸比、pH 值等數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析。其中發(fā)酵天數(shù)設(shè)置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d 共5 個梯度；糖度梯度設(shè)置4 %、8 %、12 %、16 %、20 %共5 個梯度，酵母量添加量0.01 %、0.02 %、0.03 %、0.04 %、0.05 %共5 個梯度；發(fā)酵溫度設(shè)置22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃共5 個梯度。

1.2.5 感官指標(biāo)

選十位經(jīng)過感官培訓(xùn)的專業(yè)感官評價人員對果酒進行評分，鑒評人員按照表1 的感官評分標(biāo)準(zhǔn)對樣品進行獨立評分并記錄。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 評定指標(biāo)測量方法

酒精度：酒精度折光儀檢測。

總糖的測定：按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規(guī)定測定。

透光率的測定：利用紫外可見分光光度計選擇透光率，波長設(shè)定為680 nm進行測定。

1.2.7 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、初始加糖量（C）和酵母接種量（D）為自變量，以耙耙柑果酒的酒精度（Y）、感官評分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進行優(yōu)化，篩選出果酒的最佳發(fā)酵工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前處理優(yōu)化

2.1.1 果膠酶酶解用量的優(yōu)化

當(dāng)不添加果膠酶時，耙耙柑果汁渾濁，含有大量的上層不溶性沉淀，影響果酒酒體的外觀。隨著果膠酶添加量的增加，果膠酶能分解細(xì)胞內(nèi)的果膠質(zhì)，液體逐漸澄清透明，上層的不溶性沉淀減少，有明顯的分層現(xiàn)象，有益于后期的過濾，增加出汁率。當(dāng)果膠酶添加量為0.3 %時，果汁變得澄清透明，分層明顯，因此選擇果膠酶含量在0.3 %最為合適。

2.1.2 脫苦方式的選擇

耙耙柑在加工生產(chǎn)的時候會出現(xiàn)苦味物質(zhì)加重的情況，這也是制作產(chǎn)品時一個比較重要的問題。新鮮成熟的耙耙柑鮮食并無明顯苦味，工業(yè)榨汁后，釋放出了柚體或者果皮內(nèi)的苦味物質(zhì)，使其帶有大多數(shù)人無法接受的苦味。通過查找資料得知，主要的苦味物質(zhì)為檸檬苦素和柚皮苷等物質(zhì)，除掉其中的苦味物質(zhì)，常用方法為吸附法和酶解法等。本實驗分別比較了物理法脫苦和酶法脫苦，實驗材料分別為活性炭和柚苷酶，通過感官評價比較，酶法脫苦優(yōu)于物理脫苦，所以脫苦方式選擇酶法脫苦。

表2 果膠酶用量對耙耙柑果酒的影響

表3 脫苦方法的比較

2.2 發(fā)酵時間對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

由表4可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著發(fā)酵時間的延長均在下降，發(fā)酵時料液中的酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精，可溶性固形物和總糖被消耗，同時料液中的微生物也在產(chǎn)酸。發(fā)酵時間越長酒體越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是評價發(fā)酵時間最重要的指標(biāo)，如圖1所示。

表4 發(fā)酵時間對各項理化指標(biāo)及感官評分的影響

圖1 發(fā)酵時間對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

酒體的酒精度、主體風(fēng)味及色澤的形成主要是在主發(fā)酵階段。由圖1 可以看出，2～6 d 發(fā)酵時，感官評分較低，酒精度數(shù)一直在上升，發(fā)酵天數(shù)不足還未發(fā)酵徹底；隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，耙耙柑果酒的酒精度以類似直線的增長率持續(xù)上升，可能是酵母一直在發(fā)酵，即便酒精度的增加會抑制酵母的發(fā)酵，但不會完全抑制，還是會有一部分酵母產(chǎn)出乙醇。發(fā)酵天數(shù)為6 d 時，耙耙柑果酒的感官評分最高，此時產(chǎn)品的品質(zhì)最好，并且酒精度也控制在一個合理的量，果酒的口感最好。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，在6～10 d 風(fēng)味逐漸下降，可能是出現(xiàn)了輕微的酸敗現(xiàn)象，抑制了果酒酵母產(chǎn)生酒精的能力，并且產(chǎn)酸使果酒感官品質(zhì)大大降低。綜合考慮選擇6 d 為最佳發(fā)酵時間，同時發(fā)酵時間對整個發(fā)酵過程影響并不明顯，所以不作為響應(yīng)面因素。

2.3 發(fā)酵溫度對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

由表5 可知，糖酸比、可溶性固形物、總酸，隨著發(fā)酵溫度的升高均在下降，發(fā)酵時料液中的酵母菌因為溫度升高將料液中的糖轉(zhuǎn)化為酒精的速率增加，可溶性固形物和總糖被消耗速率加快，料液中的微生物產(chǎn)酸速率也加快。發(fā)酵溫度越高酒體越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是評價發(fā)酵溫度最重要的指標(biāo)，如圖2所示。

表5 發(fā)酵溫度對各項理化指標(biāo)及感官評分的影響

圖2 不同發(fā)酵溫度對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

酵母菌之所以能夠正常繁殖生長發(fā)酵，適當(dāng)?shù)臏囟绕鹬艽蟮淖饔?。溫度太低，酵母幾乎不會發(fā)芽或者以十分緩慢的速度發(fā)芽繁殖；在適應(yīng)的溫度范圍內(nèi)，酵母能夠快速的發(fā)芽繁殖到最高細(xì)胞數(shù)，并且充分的進行發(fā)酵。由圖2 可以看出，發(fā)酵溫度對耙耙柑果酒酒精度和感官品質(zhì)的影響較顯著。當(dāng)發(fā)酵溫度為21～24 ℃時，果酒的品質(zhì)隨酒精度的上升而上升；24 ℃時果酒品質(zhì)、酒精度達(dá)到較好水平；24 ℃時酒精度的增長速度最快，但24～33 ℃品質(zhì)開始下降，可能是過低和過高的溫度，酵母的發(fā)酵減緩，低溫抑制酵母發(fā)芽數(shù)，高溫抑制酵母發(fā)酵。綜合考慮選擇24 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.4 酵母接種量對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

由表6可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著酵母接種量的增加均在增加。發(fā)酵時料液中的酵母菌接種量增加，料液中的糖轉(zhuǎn)化為酒精速率也增加，可溶性固形物和總糖被消耗速率加快，料液中的微生物產(chǎn)酸速率也加快。酵母接種量在0.03 %時透光率最高。酒精度和感官是評價酵母接種量最重要的指標(biāo)，如圖3所示。

表6 酵母接種量對各項理化指標(biāo)及感官評分的影響

圖3 酵母接種量對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

由圖3 可知，耙耙柑果酒的酒精度和感官評分都有明顯變化。在酵母接種量0.01 %時酒精度和感官評分都最低，說明此時酵母接種量過少發(fā)酵未徹底，酒精度和果酒品質(zhì)偏低；隨著酵母接種量的增加，在0.02 %時果酒品質(zhì)最好；繼續(xù)增加酵母接種量，酒溶液中含糖量下降，酸度上升，可能是接種密度過大，導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧不足，抑制了酵母的生長，不利于香氣物質(zhì)的形成，口感變差。添加0.03%酵母接種量時酒精度為最高，隨著添加量的增加酒精度減少，此時發(fā)酵液中糖含量最低，無法被酵母轉(zhuǎn)化成酒精。綜合考慮選擇0.02 %酵母接種量為最適酵母接種量。

2.5 初始加糖量對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

由表7可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物隨著糖度的增加均在增加。發(fā)酵時料液中初始加糖量增加，料液中更多的糖能轉(zhuǎn)化為酒精，酒精度也更高，可溶性固形物和總糖在發(fā)酵完成后殘留量也更多，料液中的微生物產(chǎn)酸速率也加快。初始加糖量在12%時透光率最高。酒精度和感官是評價初始加糖量最重要的指標(biāo)，如圖4所示。

表7 初始加糖量對各項理化指標(biāo)及感官評分的影響

圖4 不同初始加糖量對耙耙柑果酒品質(zhì)的影響

不同的初始加糖量會影響耙耙柑果酒的發(fā)酵和酒精度的含量，適當(dāng)濃度可以增強酵母的發(fā)酵，使果酒的風(fēng)味更好，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，初始加糖量對耙耙柑果酒的酒精度和品質(zhì)有明顯的影響，總體呈現(xiàn)上升的趨勢。在初始濃度為12%時，耙耙柑果酒的品質(zhì)達(dá)到最高值，酒精度也相對平穩(wěn)。繼續(xù)增加糖度，酒精度越來越高，高濃度的糖分和酒精度會抑制耙耙柑果酒酵母的發(fā)酵作用，并且過高的酒精度會影響果酒的風(fēng)味。因此，在12%～20%的糖度下，酒精度明顯加強，但果酒最終的品質(zhì)下降。因此調(diào)節(jié)耙耙柑汁的最佳糖度為12%。

2.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

根據(jù)據(jù)單因素試驗得出的結(jié)果，最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵溫度24 ℃，酵母接種量0.02%，初始加糖量12%。由于發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果影響不明顯，所以根據(jù)單因素試驗結(jié)果以酵母添加量（A），初始加糖量（B）及發(fā)酵溫度（C）為影響因素，以酒精度（Y）和感官評分（Y）為響應(yīng)值，利用DesignExpert8.06 響應(yīng)面軟件的Box-Behnken 試驗設(shè)計3因素3水平試驗，見表8。

表8 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

試驗設(shè)計結(jié)果與分析見表9，方差分析結(jié)果見表10、表11。對獲得的數(shù)據(jù)利用分析軟件Design-Expert 進行多元回歸方程擬合，得酒精度（Y）和感官評分（Y）二次多項回歸模型方程為：

表9 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果與分析

由表10 和表11 回歸模型方差分析結(jié)果可知，以響應(yīng)面法建立的二次回歸模型方程，兩個模型都為極顯著（P＜0.01），而且失擬項都為不顯著（P＞0.05），未知因素對試驗結(jié)果干擾不大。酒精度和感官評分的校正決定系數(shù)R為97.04%和99.29%，說明該模型的擬合程度比較好，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化建立的耙耙柑發(fā)酵工藝回歸方程（模型）是有效的，可以用來確定耙耙柑發(fā)酵果酒釀造的最佳發(fā)酵工藝。以酒精度（Y）為響應(yīng)值時，一次項C 和交互項AB 影響顯著，A、A、B、C影響都為極顯著，由F檢驗可以得到的因子貢獻率為A＞C＞B；以感官評分(Y)為響應(yīng)值時，一次項C、交互項AB、AC、BC 和二次項A、B、C影響極顯著，由F 檢驗可以得到因子貢獻率為C＞B＞A。

表10 回歸模型方差分析

表11 回歸模型方差分析

各因素對指標(biāo)影響的響應(yīng)面及等高線結(jié)果見圖5。由圖5 可知，在Y模型中BC、AC 交互作用不顯著，所以對AB 交互作用進行分析，在保持發(fā)酵溫度恒定的情況下，酒樣品中的酒精含量首先增加，隨著初始糖含量和酵母數(shù)量的增加而降低，且所述等高線為橢圓形，具有極端值，彎曲表面是相對陡峭的，交互顯著。在Y模型中等高線最小橢圓的中心點為響應(yīng)面的最高點，即感官評分最高，等高線的形狀為橢圓形，曲面傾斜度越高，坡度越陡，各因素對感官評分的影響越顯著，說明AC、BC、AB 交互作用顯著。使用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法分析回歸模型，選擇酒精含量和感官評分的重要性為5，分別選擇酒精含量和感官評分的最大響應(yīng)值。尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為酵母添加量0.022 %，初始加糖量12.20%，發(fā)酵溫度23.95℃。此優(yōu)化條件下發(fā)酵后果酒酒精度預(yù)測值為11.22%vol，感官評分預(yù)測值為83.27 分。為驗證試驗結(jié)果的真實性，考慮實際的操作情況，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為酵母添加量0.02%，初始加糖量12 %，發(fā)酵溫度24 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下，進行6 次驗證試驗，耙耙柑果酒的感官評分實際值為80.25 分，酒精度實際值為11.05 %vol，與預(yù)測值相差較小，證明該回歸模型可行，應(yīng)用響應(yīng)面得出的最佳耙耙柑果酒發(fā)酵工藝可行。

圖5 初始加糖量、酵母接種量、發(fā)酵溫度交互作用對耙耙柑果酒感官評分和酒精度的響應(yīng)面及等高線圖

2.7 耙耙柑果酒的最佳工藝品質(zhì)

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對耙耙柑果酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化處理，最終得到產(chǎn)品的感官指標(biāo)：澄清透亮、有光澤、橙黃色，香氣協(xié)調(diào)、優(yōu)雅，具有明顯的柑橘果香與酒香，酒體豐滿，醇厚協(xié)調(diào)，舒服爽口，回味延綿，有柑橘的風(fēng)格，典型性良好。理化數(shù)據(jù)見表12。

表12 耙耙柑果酒理化指標(biāo)

3 結(jié)論

以耙耙柑為主要原料，經(jīng)過榨汁、酶解、脫苦、發(fā)酵等步驟制作成耙耙柑果酒，前處理優(yōu)化使用柚苷酶脫苦。單因素實驗中，保持其他因素不變，最終得出調(diào)節(jié)耙耙柑汁的最佳糖度為12 %，最佳的發(fā)酵時間6 d，酵母量添加在0.02%為最佳，最佳發(fā)酵溫度為24 ℃；根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行響應(yīng)面試驗得出最佳發(fā)酵工藝：酵母量0.02 %、初始加糖量12%、發(fā)酵天數(shù)6 d、發(fā)酵溫度24 ℃下，果酒的品質(zhì)最好。通過本研究，為耙耙柑果酒的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定基礎(chǔ)。