陳 晗，吳嘉鑫，徐德峰，孫力軍，秦小明，范秀萍

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

南美白對(duì)蝦對(duì)外界環(huán)境脅迫反應(yīng)較為強(qiáng)烈，捕撈和運(yùn)輸過(guò)程中的不利因素常會(huì)造成其大量應(yīng)激性傷殘和死亡，因此降低應(yīng)激反應(yīng)從而提高存活質(zhì)量已成為南美白對(duì)蝦?；盍魍ǖ年P(guān)注熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的有水?；钸\(yùn)輸因需要大量水而成本高昂，運(yùn)輸途中的對(duì)蝦排泄物嚴(yán)重影響機(jī)體存活狀況。近年來(lái)快速發(fā)展的無(wú)水?；钸\(yùn)輸由于消除了運(yùn)輸過(guò)程對(duì)水的需求，且裝載量更大、綜合成本大幅縮減，因而受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。但對(duì)蝦生長(zhǎng)環(huán)境溫度通常在20 ℃以上，捕撈后短時(shí)間快速冷應(yīng)激和運(yùn)輸過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)水暴露會(huì)影響對(duì)蝦生理代謝和存活質(zhì)量。氧化應(yīng)激和免疫防御失衡通常是生物細(xì)胞在應(yīng)答極端環(huán)境脅迫時(shí)的基本表現(xiàn)，相關(guān)研究表明，魚(yú)、貝類在無(wú)水?；钸^(guò)程中不利環(huán)境因子可觸發(fā)其氧化應(yīng)激，使其先天免疫系統(tǒng)失衡，甚至造成組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，12 ℃低溫和空氣暴露3～5 min可顯著改變南美白對(duì)蝦的抗氧化防御系統(tǒng)，而關(guān)于產(chǎn)業(yè)運(yùn)輸實(shí)際中急冷并長(zhǎng)時(shí)間無(wú)水脅迫如何影響南美白對(duì)蝦氧化和免疫系統(tǒng)鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，有必要結(jié)合產(chǎn)業(yè)實(shí)際探究急冷及無(wú)水雙重脅迫誘導(dǎo)南美白對(duì)蝦死亡的氧化和免疫防御失衡機(jī)制。

此外，肝胰腺是對(duì)蝦生理代謝的重要器官之一，也是響應(yīng)外界脅迫的關(guān)鍵器官。鑒于肝胰腺組織在對(duì)蝦機(jī)體響應(yīng)環(huán)境脅迫中的作用，可將其作為無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中南美白對(duì)蝦冰溫?fù)p傷效應(yīng)評(píng)價(jià)的靶組織。無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中的低溫和空氣暴露聯(lián)合應(yīng)激對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺抗氧化和免疫系統(tǒng)的影響尚不清楚。因此，本研究通過(guò)模擬南美白對(duì)蝦無(wú)水?；钸\(yùn)輸條件，考察急冷及無(wú)水脅迫下對(duì)蝦肝胰腺氧化應(yīng)激和非特異性免疫指標(biāo)變化，解析雙重脅迫影響機(jī)體存活的生理防御基礎(chǔ)，以期為優(yōu)化對(duì)蝦保活運(yùn)輸條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 kg鮮活南美白對(duì)蝦（）購(gòu)自廣東省湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，質(zhì)量（16.23±2.12）g、體長(zhǎng)（7.36±1.42）cm，市場(chǎng)出售的對(duì)蝦均在凌晨4點(diǎn)左右起塘后快速放入盛有新鮮海水的運(yùn)輸容器內(nèi)，由裝有控溫和持續(xù)供氧裝置的配送車輛在4 h內(nèi)運(yùn)輸至批發(fā)市場(chǎng)，剔除死亡個(gè)體后放于盛有新鮮海水的水族缸或鐵盆內(nèi)持續(xù)泵入新鮮空氣。市場(chǎng)選購(gòu)實(shí)驗(yàn)用蝦時(shí)，用容積20 L的聚乙烯袋將10 kg對(duì)蝦均勻分成5 袋，袋中注入新鮮海水10 L，用氧泵充分打氧后扎緊袋口2 h內(nèi)運(yùn)送到廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品?；顚?shí)驗(yàn)室，之后迅速將對(duì)蝦放于溫度25 ℃、鹽度35‰的約1 m新鮮海水中暫養(yǎng)6 h，以緩解和消除捕撈和運(yùn)輸操作時(shí)蝦的應(yīng)激反應(yīng)，然后剔除死亡個(gè)體，挑選無(wú)機(jī)械傷、活動(dòng)正常、狀態(tài)良好的對(duì)蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

酚氧化酶（phenol oxidase，PO）試劑盒 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

S-20氧泵 中國(guó)浙江寧波塞爾電氣公司；HX-1508低溫冷卻循環(huán)泵 江蘇天翔儀器有限公司；25 cm×20 cm塑料自封袋 天津永業(yè)塑料制品有限公司；塑料周轉(zhuǎn)箱（490 mm×345 mm×285 mm）東莞市茶山中距塑膠卡板廠；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)艾本德有限公司；Varioskan全自動(dòng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。80i顯微鏡 日本尼康公司；RM2245半自動(dòng)轉(zhuǎn)輪切片機(jī) 德國(guó)徠卡儀器有限公司；JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；BCD-166TNA冰箱 青島海爾股份有限公司；DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA224S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南美白對(duì)蝦脅迫處理與存活率測(cè)定

參照徐德峰等的方法，取6個(gè)塑料周轉(zhuǎn)箱（490 mm×345 mm×285 mm），分別注入20 L新鮮海水，并連續(xù)編號(hào)，將暫養(yǎng)后挑選的300 尾對(duì)蝦隨機(jī)分成6 組，每組50 尾，1號(hào)箱中50 尾對(duì)蝦記為正常對(duì)照組（NC組），自然室溫觀察和取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。2～6號(hào)箱均先用低溫冷卻循環(huán)泵將室溫新鮮海水降至12 ℃，然后將50 尾對(duì)蝦轉(zhuǎn)移到該冷水箱進(jìn)行急性低溫30 min誘導(dǎo)休眠，2號(hào)箱中的對(duì)蝦不取出（放置12 h），記為單獨(dú)冷脅迫組（AC組）。剩余3～6號(hào)箱中的對(duì)蝦經(jīng)12 ℃冷休眠30 min后取出，隨機(jī)放入塑料自封袋，每袋10 尾，每組5 袋，共4 組，自封袋充分充入純氧氣后封口，將充氧后的4 組對(duì)蝦貯存在12 ℃的層析柜中，模擬對(duì)蝦無(wú)水運(yùn)輸?shù)蜏丨h(huán)境，3～5號(hào)箱中對(duì)蝦分別經(jīng)歷冷休眠和無(wú)水脅迫處理3、6、9 h時(shí)的聯(lián)合脅迫，相應(yīng)記為AC+WD3 h、AC+WD6 h、AC+WD9 h組。6號(hào)箱對(duì)蝦經(jīng)歷急冷和9 h無(wú)水聯(lián)合脅迫，之后于自然室溫海水中復(fù)蘇2 h，記為AC+WD9 h+R組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制對(duì)蝦個(gè)體差異，取各組大小、顏色、狀態(tài)基本一致的具有代表性的對(duì)蝦15 尾，測(cè)定集體防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)。在統(tǒng)計(jì)存活率時(shí)將雙重脅迫處理組均置于自然室溫海水中復(fù)蘇2 h。

1.3.2 樣品采集與生化指標(biāo)測(cè)定

樣品制備參照李曉麗等的實(shí)驗(yàn)方法，將各組對(duì)蝦置于冰盤(pán)上迅速解剖，由頭胸部取出肝胰腺，用預(yù)冷至4 ℃的無(wú)菌生理鹽水沖洗掉表面血跡并用吸水紙吸干表面水分，液氮速凍后放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。指?biāo)測(cè)定時(shí)取出冷凍肝胰腺在4 ℃解凍30 min，再次用4 ℃的無(wú)菌生理鹽水沖洗組織表面并吸干水分，切取2 g左右組織樣品，按1∶9（/）的比例加入4 ℃預(yù)冷后的無(wú)菌生理鹽水，冰浴條件下充分研磨6～8 min，之后3 000×冷凍離心10 min，取上清液測(cè)定相關(guān)生化指標(biāo)。ROS水平（以熒光強(qiáng)度表征）、MDA含量以及SOD、CAT、GSH-Px、PO、POD、ACP、AKP活力測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.3 肝胰腺組織樣品制備與觀察

取各組對(duì)蝦肝胰腺組織，超凈工作臺(tái)中的操作參照徐德峰等的實(shí)驗(yàn)方法，用手術(shù)解剖刀配合剃須刀片，從肝胰腺正中縱切剖開(kāi)，然后進(jìn)一步在縱切面的正中橫切，在橫切面部位切取5 mm×5 mm×5 mm組織塊，在Bouin’s固定液中進(jìn)行組織固定，固定結(jié)束后梯度乙醇脫水，組織透明后石蠟包埋，石蠟切片厚度6 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色程序染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（＝6），采用SPSS 19.0軟件中的最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用Origin Pro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦存活率的影響

由圖1可以看出，NC組和AC組在12 h的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均全部存活，存活率均為100%，雙重脅迫下無(wú)水脅迫時(shí)間控制在6 h內(nèi)均可全部復(fù)蘇，而無(wú)水脅迫9 h時(shí)部分對(duì)蝦不能復(fù)蘇而沉在水底，存活率為92.13%，表明對(duì)蝦存活率在無(wú)水脅迫9 h時(shí)開(kāi)始發(fā)生變化，提示機(jī)體內(nèi)部臟器組織可能因強(qiáng)烈生理應(yīng)激而發(fā)生不可逆損傷。

圖1 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦存活情況的影響Fig. 1 Effect of combined stress on the survival rate of L. vannamei

2.2 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺氧化應(yīng)激損傷的影響

由圖2A可知，與NC組相比，AC組對(duì)蝦肝胰腺ROS生成量顯著增加（＜0.05），原因可能是對(duì)蝦為應(yīng)對(duì)急性低溫脅迫需要迅速產(chǎn)生能量，因而呼吸速率增加，使ROS的生成速率大于清除速率。但隨后無(wú)水脅迫下ROS生成量顯著降低（＜0.05），雙重脅迫下無(wú)水脅迫9 h組在自然室溫海水中復(fù)蘇后ROS再次恢復(fù)至NC組水平。

圖2 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺ROS水平（A）和MDA含量（B）的影響Fig. 2 Effect of combined stress on ROS level (A) and MDA content (B)in hepatopancreas of L. vannamei

由圖2B可知，與NC組相比，AC組南美白對(duì)蝦肝胰腺M(fèi)DA含量顯著增加（＜0.05），且在進(jìn)一步的無(wú)水脅迫過(guò)程中，MDA含量呈先升后降的趨勢(shì)，但均顯著高于NC組（＜0.05），其中MDA含量在雙重脅迫3 h時(shí)達(dá)到9.23 nmol/mg，之后MDA含量逐漸下降，自然室溫海水中復(fù)蘇后（AC+WD9 h+R組）可基本恢復(fù)到初始水平。整體來(lái)看，在無(wú)水活運(yùn)雙重脅迫過(guò)程中，MDA含量相比ROS水平高峰出現(xiàn)的時(shí)間晚，表明體內(nèi)ROS積累后造成MDA含量隨之增加，無(wú)水脅迫后MDA含量下降可能緣于對(duì)蝦抗氧化系統(tǒng)被激活，加速清除過(guò)多MDA以維持體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡，提示機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)基本可以呈時(shí)間依賴性消除脂質(zhì)過(guò)氧化。

2.3 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺主要抗氧化酶活力的影響

抗氧化系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的適應(yīng)性系統(tǒng)，用于維持細(xì)胞功能和防止氧化應(yīng)激，SOD、CAT和GSH-Px是甲殼類動(dòng)物抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。由圖3A可以看出，AC組SOD活力（2.22 U/mg）相比NC組（1.69 U/mg）顯著上升（＜0.05），之后隨著無(wú)水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)略微上升，并在雙重脅迫3～6 h之間基本保持穩(wěn)定，但在9 h時(shí)再次顯著升高至2.82 U/mg（＜0.05），AC+WD9 h+R組在自然室溫海水中復(fù)蘇后SOD活力有所下降，但未恢復(fù)到初始水平，表明脅迫環(huán)境下機(jī)體可通過(guò)增加南美白對(duì)蝦肝胰腺SOD活力以減輕氧化應(yīng)激損傷。

圖3 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺SOD（A）、CAT（B）、GSH-Px（C）活力的影響Fig. 3 Effect of combined stress on the activities of SOD (A), CAT (B)and GSH-Px (C) in hepatopancreas of L. vannamei

CAT和GSH-Px能夠有效地清除過(guò)氧化氫，以維持動(dòng)物體內(nèi)的氧化應(yīng)激與抗氧化系統(tǒng)平衡。由圖3B可以看出，與NC組相比，急冷后對(duì)蝦肝胰腺CAT活力有所增加，但不顯著（＞0.05）。隨后在雙重脅迫下CAT活力隨無(wú)水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且均較NC組顯著提升，9 h時(shí)達(dá)到2.12 U/mg，AC+WD9 h+R組在自然室溫海水中復(fù)蘇后CAT活力與NC組無(wú)顯著差異，提示CAT對(duì)于對(duì)蝦抵抗無(wú)水暴露引起的不良影響有積極作用。由圖3C可以看出，急冷脅迫后對(duì)蝦肝胰腺GSH-Px活力較NC組顯著降低（＜0.05），之后隨著無(wú)水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，GSHPx活力逐漸上升，并在9 h時(shí)達(dá)到5.26 U/mg，AC+WD9 h+R組在自然室溫海水中復(fù)蘇后可基本恢復(fù)到NC組水平，提示對(duì)蝦可通過(guò)提升GSH-Px活性以抵抗氧化損傷。

2.4 雙重脅迫對(duì)肝胰腺主要非特異性免疫酶活力的影響

PO是一種金屬蛋白酶，動(dòng)物體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)被異物激活后，PO可將酚催化成黑色素，并將一些病原體殺死，在對(duì)蝦非特異性免疫中起重要作用。由圖4A可以看出，對(duì)蝦經(jīng)歷急冷脅迫后，肝胰腺PO活力基本沒(méi)有變化，但經(jīng)雙重脅迫后均較NC組顯著增加（＜0.05），其中3 h后PO活力最高，之后逐漸降低，直到復(fù)蘇后（AC+WD9 h+R組）仍未下降到初始水平，推測(cè)在雙重脅迫前期（3 h之前）可刺激機(jī)體表達(dá)PO，之后可能由于免疫系統(tǒng)受到不可逆損傷而使PO表達(dá)量下降。

圖4 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺PO（A）、POD（B）、ACP（C）、AKP（D）活力的影響Fig. 4 Effect of combined stress on the activities of PO (A), POD (B),ACP (C) and AKP (D) in hepatopancreas of L. vannamei

POD是與對(duì)蝦體液免疫相關(guān)的酶，可以將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的水和氧，以避免細(xì)胞損傷，POD水平可間接反映機(jī)體免疫水平。由圖4B可以看出，除了雙重脅迫6 h時(shí)POD活力略低于NC組之外（＞0.05），其他組POD活力均顯著低于NC組（＜0.05），且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈降低趨勢(shì)；復(fù)蘇后（AC+WD9 h+R組）POD活力也沒(méi)有恢復(fù)，仍顯著低于NC組（＜0.05）。ACP和AKP直接參與磷酸基團(tuán)的催化、代謝和水解，并能與其他酶類形成水解酶系消除異物，在對(duì)蝦免疫防御系統(tǒng)起關(guān)鍵作用，可作為生物抵抗環(huán)境脅迫評(píng)價(jià)的標(biāo)記物。由圖4C、D可以看出，ACP和AKP活力均隨無(wú)水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在9 h分別達(dá)到76.76 U/g和114.13 U/g，顯著高于NC組（＜0.05）。急冷脅迫后，ACP和AKP活力相比NC組有所上升，但變化不顯著（＞0.05），復(fù)蘇后（AC+WD9 h+R組）ACP和AKP活力均與初始水平無(wú)顯著差異。

2.5 重脅迫對(duì)肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的損傷效應(yīng)

環(huán)境脅迫下的機(jī)體應(yīng)激強(qiáng)度不僅可通過(guò)生理指標(biāo)進(jìn)行考察，還可通過(guò)組織病理改變進(jìn)行評(píng)價(jià)，雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的損傷效應(yīng)見(jiàn)圖5。

圖5 雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響（40×）Fig. 5 Effect of combined stress on histopathology of hepatopancreas of L. vannamei (40 ×)

由圖5可以看出，NC組肝胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰、成分完整、肝小管排列規(guī)則、細(xì)胞形態(tài)正常，AC組經(jīng)急冷脅迫后細(xì)胞形態(tài)整體無(wú)明顯變化，短期雙重脅迫也未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)變化（AC+WD3 h組），但雙重脅迫6 h和9 h時(shí)可見(jiàn)肝小管有輕微的破裂和內(nèi)壁細(xì)胞脫落，復(fù)蘇后（AC+WD9 h+R組）組織損傷有所減輕，表明長(zhǎng)時(shí)間的雙重脅迫對(duì)肝胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成了明顯的損傷，而復(fù)蘇后可在一定程度上修復(fù)細(xì)胞損傷。

3 討 論

ROS的來(lái)源主要是線粒體，細(xì)胞呼吸代謝產(chǎn)生能量的過(guò)程中，約0.1%～0.2%的O可轉(zhuǎn)化為ROS，引起細(xì)胞代謝的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激被定義為ROS產(chǎn)生和消除之間的不平衡，可引起典型的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜系統(tǒng)，其標(biāo)志性表現(xiàn)就是MDA水平的顯著增加。溫度脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大幅增加，產(chǎn)生大量ROS，使細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，從而對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成一系列生理和病理?yè)p傷，為緩解和消除氧化應(yīng)激，機(jī)體必然會(huì)調(diào)動(dòng)自身抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)消減ROS和MDA。研究表明，在急性冷應(yīng)激或熱應(yīng)激后，南美白對(duì)蝦抗氧化酶基因表達(dá)均上調(diào)，由此推測(cè)環(huán)境突然改變可誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化酶系激活，加速分解體內(nèi)累積的ROS，本研究中雙重脅迫9 h復(fù)蘇后ROS水平恢復(fù)到初始水平，其原因可能在于常溫水體中機(jī)體細(xì)胞代謝逐漸恢復(fù)至正常水平，ROS因機(jī)體代謝活動(dòng)的應(yīng)激性增強(qiáng)而積累，因此ROS水平再次上升。研究發(fā)現(xiàn)，空氣暴露時(shí)間的長(zhǎng)短不僅影響南美白對(duì)蝦的存活率，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致肌肉和肝胰腺中MDA含量有所升高，且空氣暴露3 h可使日本囊對(duì)蝦肝胰腺中的MDA含量顯著增加，放回水中恢復(fù)至正常值，此研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

SOD是一種胞質(zhì)酶，催化兩分子ROS生成一分子過(guò)氧化氫和一分子氧氣，在自衛(wèi)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。南美白對(duì)蝦經(jīng)歷低鹽和亞硝酸鹽聯(lián)合脅迫24 h和48 h后，肝胰腺SOD活力顯著上升，此外，南美白對(duì)蝦遭受持續(xù)應(yīng)激時(shí)SOD活力上升，可見(jiàn)不良環(huán)境脅迫會(huì)誘導(dǎo)南美白對(duì)蝦體內(nèi)SOD活力增加。南美白對(duì)蝦在氨氮或硫化物脅迫的過(guò)程中，體內(nèi)SOD和CAT活力顯著上調(diào)，與本研究結(jié)果相符。將南美白對(duì)蝦從鹽度30‰水體轉(zhuǎn)移到鹽度15‰的水體時(shí)GSH-Px活力上升，提示對(duì)蝦可通過(guò)提升GSH-Px活力以抵抗氧化損傷。另外，劉曉云等的研究中中國(guó)對(duì)蝦在持續(xù)環(huán)境應(yīng)激下PO活力的變化與本研究結(jié)果相似，表明南美白對(duì)蝦免疫能力總是隨其自身狀態(tài)和外界環(huán)境的改變而發(fā)生改變。徐子涵研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)水低溫脅迫下南美白對(duì)蝦血淋巴和肝胰腺POD活力在保活6 h內(nèi)較高，隨后POD活力顯著降低，且基因表達(dá)量也顯著下降。以上研究結(jié)果提示，長(zhǎng)時(shí)間低溫和無(wú)水脅迫抑制了對(duì)蝦免疫功能。

吳萌探討了低溫對(duì)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦呼吸性能及抗氧化能力的影響，表明在水溫由20 ℃降至10 ℃的過(guò)程中，肝胰腺M(fèi)DA含量先降低后升高，總抗氧化能力呈下降趨勢(shì)，其中抗氧化酶CAT活力呈上升趨勢(shì)，并在溫度降至10 ℃時(shí)最高；此外，鰓組織結(jié)構(gòu)損傷加重，角質(zhì)層及上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死脫落，血細(xì)胞出現(xiàn)破裂。賈旭穎模擬環(huán)境溫度突變系統(tǒng)研究了溫度脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活和生理代謝的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度由22 ℃驟降到12 ℃時(shí)，對(duì)蝦存活率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量顯著下降，肝胰腺M(fèi)DA含量在3～6 h增加，隨后逐漸恢復(fù)到溫度突變前的水平，PO、活性氮和SOD水平均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。在本研究中，急冷后ROS水平較NC組顯著增加，而急冷與無(wú)水聯(lián)合脅迫下ROS水平下降；MDA水平在急冷和雙重脅迫前3 h均較NC組顯著增加，而后顯著降低，可能在于酶促抗氧化系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶SOD和CAT快速清除體內(nèi)過(guò)多的ROS，使脅迫中后期機(jī)體MDA水平相應(yīng)降低。同時(shí)，伴隨著抗氧化系統(tǒng)的激活，機(jī)體免疫防御系統(tǒng)被激活，體內(nèi)典型非特異性免疫相關(guān)酶除POD外，PO、ACP和AKP活力均有不同程度的提升。長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激必然造成不同程度的細(xì)胞損傷，AC+WD9 h組中肝小管的輕微破裂和內(nèi)壁細(xì)胞脫落解釋了為何此時(shí)對(duì)蝦存活率會(huì)突然下降。因此可以推測(cè)，雙重脅迫觸發(fā)了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，激活了抗氧化和非特異性免疫系統(tǒng)，在6～8 h的時(shí)間內(nèi)機(jī)體可以適應(yīng)上述環(huán)境改變，可一旦超過(guò)9 h，細(xì)胞因累積性氧化損傷而造成組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致存活率降低，研究結(jié)果證實(shí)了氧化和免疫系統(tǒng)參與了無(wú)水?；盍魍ㄟ^(guò)程中急冷及無(wú)水聯(lián)合脅迫誘導(dǎo)的對(duì)蝦死亡，提示后續(xù)研究可進(jìn)一步考察不同冰溫參數(shù)對(duì)存活率影響的氧化和免疫響應(yīng)生化基礎(chǔ)，進(jìn)而靶向優(yōu)化?；盍魍▍?shù)。