張慧玲，鐘丹妮，李 燕

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科，廣西 南寧 530021； 2.廣西羅城仫佬族自治縣人民醫(yī)院新生兒科，廣西 羅城 546400)

高膽紅素血癥是新生兒中發(fā)病率較高的疾病，是新生兒返院的最常見原因之一[1]。雖然大多數(shù)情況下不會造成嚴(yán)重后果，但仍有患兒因膽紅素值達(dá)到甚至超過危險(xiǎn)水平，導(dǎo)致膽紅素腦病，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、聽力、視覺、牙齒、運(yùn)動等方面的發(fā)育造成永久性損傷[2-3]。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶是人體內(nèi)一類重要的Ⅱ相代謝酶，在人體中發(fā)揮著不可或缺的作用[4]。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1)是參與膽紅素結(jié)合和代謝唯一的關(guān)鍵酶[5-7]。UGT1A1基因變異和轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變，都會對酶的表達(dá)產(chǎn)生破壞性影響，使膽紅素代謝發(fā)生異常，蓄積在血液中，從而出現(xiàn)不同程度的高膽紅素血癥，如Crigler-Najjar綜合征和Gilbert綜合征等[8-9]。UGT1A1基因的多態(tài)性因種族和地區(qū)而異，如在高加索人群中，最常見的突變類型為啟動子的TATA box重復(fù)多態(tài)性突變；而G71R基因突變，也就是c.211G>A錯(cuò)義突變是亞洲人群最常見的突變類型[10-11]。廣西羅城仫佬族自治縣是一個(gè)多民族的地區(qū)，UGT1A1基因突變是否影響該地區(qū)高膽紅素血癥的發(fā)生，究竟是哪種突變導(dǎo)致了該病，目前尚無報(bào)道。本文將探討UGT1A1基因的TATA box突變和G71R突變與廣西羅城仫佬族自治縣新生兒高膽紅素血癥之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2021年1月至12月在羅城仫佬族自治縣人民醫(yī)院確診為高膽紅素血癥的100例患兒作為病例組。高膽紅素血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)為：時(shí)齡膽紅素達(dá)到或者超過新生兒小時(shí)膽紅素列線圖第95百分位[12]。選取同一時(shí)期在我院婦產(chǎn)科出生，且隨訪2周無黃疸的足月新生兒100例為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：葡萄糖六磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)缺乏癥、敗血癥、母嬰血型不合型溶血病、巨大兒、早產(chǎn)兒、低出生體重兒、頭顱血腫、紅細(xì)胞增多癥等。

200例新生兒日齡1～14天，體重在2.5～4.0kg，收集患兒的性別、民族、膽紅素值等基本信息。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并征得患者家屬知情同意。

1.2方法

采集新生兒外周血2mL，用血液基因組DNA分離試劑盒(北京天根公司)分離DNA，儲存于-20℃的冰箱中。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)第一外顯子引物，引物序列為F引物：5′-GTCACGTGACACAGTCAAAC-3′，R引物：5′-GTCCCACTCCAATACACAC-3′，產(chǎn)物片段長度999bp[13]。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系(總體積為50μL)：上下游引物各2μL，DNA模板質(zhì)量為500ng(根據(jù)公式：體積=質(zhì)量/濃度，計(jì)算出所需的DNA體積)，2×Taq MasterMix(康為世紀(jì)公司)25μL，用去離子水補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次，72℃終延伸2min，置于-20℃保存，并送往上海生工生物工程公司直接測序，所得結(jié)果與Gene Bank中UGT1A1的基因序列比較，應(yīng)用Chromas軟件判斷基因突變位點(diǎn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組一般資料比較

病例組男53例，女47例；平均胎齡(272.51±9.33)天；平均出生體重(3 168.90±440.67)g；漢族31例，壯族29例，仫佬族35例，其他民族5例。對照組男48例，女52例；平均胎齡(274.64±7.07)天；平均出生體重(3 228.50±313.44)g；漢族24例，壯族39例，仫佬族35例，其他民族2例。兩組胎齡、出生體重、性別、民族等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組UGT1A1 G71R 基因型分布及等位基因突變率

兩組均未檢測到啟動子TATA box突變。病例組中，純合G71R突變4例，雜合突變37例，突變率為41.00%(41/100)；對照組中G71R雜合突變9例，未檢出純合G71R突變，突變率為9.00%(9/100)，見圖1。G71R基因突變頻率和A等位基因頻率在病例組和對照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為28.390、27.746，P<0.05)，見表1。

表1 兩組G71R 基因型分布及等位基因頻率的比較[n(%)]

2.3病例組不同民族 G71R 等位基因頻率的比較

比較病例組中漢族、壯族、仫佬族的G71R 等位基因頻率， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。因其他民族人數(shù)較少，不納入統(tǒng)計(jì)范圍。

表2 病例組不同民族間 UGT1A1 G71R等位基因頻率的比較

3討論

3.1新生兒高膽紅素血癥的病因

新生兒高膽紅素血癥是臨床上常見的疾病，經(jīng)過多年的研究，部分病因已被人們所知，然而，在一些患兒中，尚未明確病因。近年來，許多學(xué)者將探究的目光投向膽紅素代謝過程中的代謝酶——UGT1A1酶[14]，它可催化膽紅素與葡萄糖醛酸的結(jié)合反應(yīng)，促使膽紅素排出體外，成為膽紅素代謝中唯一的關(guān)鍵酶[5-7]。當(dāng)UGT1A1基因啟動子序列和編碼位點(diǎn)發(fā)生了突變，將導(dǎo)致不同類型的高膽紅素血癥[8-9]。UGT1A1基因最常見的突變?yōu)閱幼?TATA box 突變與第一外顯子 G71R突變。啟動子TATA box的TA重復(fù)序列增加，使TATA box與TATAA結(jié)合蛋白的親和力下降，造成UGT1A1酶活性降低，影響膽紅素的結(jié)合能力。第一外顯子區(qū)域 G71R 基因突變是指UGT1A1 酶第71位的Gly變?yōu)锳rg，酶活性下降。

3.2 UGT1A1基因多態(tài)性的種族和地域差異

在不同的種族和地域之間，UGT1A1基因多態(tài)性存在差異。在高加索人群中，最常見的突變類型為(TA)7/(TA)7，發(fā)病率為9.7%～13.6%；在亞洲人群中發(fā)病率為1%～2%[10-11]；Akaba等[15]1998年報(bào)道亞洲人群中最常見的是G71R突變，在中國、日本、韓國尤其普遍。本研究病例組UGT1A1 G71R 基因突變頻率為 41.00%，遠(yuǎn)高于高加索人群，略低于日本的Akaba等[16]學(xué)者報(bào)道的G71R突變頻率47%，也低于韓國學(xué)者Kim等[17]在81名高膽紅素血癥患者中檢測到的G71R突變頻率50.62%。在本研究中，G71R等位基因頻率在對照組和病例組間存在明顯差異，該突變可能是廣西羅城仫佬族自治縣新生兒高膽紅素血癥的主要類型。病例組的G71R等位基因頻率為22.50%，與廣西其他地區(qū)相似[13,18]，低于上海地區(qū)[19]，也低于其他國家如韓國[15]和越南[20]的報(bào)道。這可能意味著地域環(huán)境、種族等因素導(dǎo)致這種基因的差異性。

在此前的許多研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1啟動子TATA box突變在亞洲地區(qū)發(fā)病率較低，且大多發(fā)現(xiàn)該突變與亞洲人群高膽紅素血癥風(fēng)險(xiǎn)增加無明顯相關(guān)性[21-23]。本研究人群中未檢測到TATA box突變，說明廣西仫佬族自治縣高膽紅素血癥可能與TATA box突變無關(guān)。

不同民族UGT1A1基因譜可能有所不同[24]?？蛟降萚25]研究表明，云南漢族嬰兒主要與G71R、Y486D、c.1061C>T這3個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合雜合突變，而Y486D純合突變則多存在于少數(shù)民族嬰兒中。吳曉靜等[26]、鐘勇等[13]發(fā)現(xiàn)G71R突變是廣西黑衣壯族、來賓壯族及漢族人群中最常見的突變類型，G71R等位基因頻率在黑衣壯族和漢族之間具有民族差異性，但來賓壯族、漢族的G71R基因頻率無明顯差異。本研究中不同民族患兒G71R 基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在羅城仫佬族自治縣患兒中，G71R突變基因頻率可能無民族性差異。

本研究局限性在于納入人數(shù)較少，僅3個(gè)民族進(jìn)行比較，且只對TATA box和G71R基因進(jìn)行檢測，仍有部分患兒未出現(xiàn)該突變，說明還存在著其他的致病因素。今后還應(yīng)增加研究人數(shù)，深入研究除以上兩種基因突變類型外的其他基因多態(tài)性。

3.3小結(jié)

綜上所述，UGT1A1 G71R突變是廣西羅城仫佬族自治縣高膽紅素血癥的主要突變類型，羅城仫佬族自治縣漢族、壯族、仫佬族人群之間的G71R突變基因頻率無明顯差異。本研究結(jié)果對該地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的診治具有一定的意義。此外，識別個(gè)人的遺傳綜合征可對家庭成員產(chǎn)生一定的影響，有助于為家庭和產(chǎn)前遺傳咨詢及基因檢測鋪設(shè)道路。