陳嘉彤 金鼎 杜旸 王雪松

吸煙的人群常常面臨許多困擾,人們生活中常見(jiàn)的例如：口腔異味、牙面煙斑煙漬等。然而現(xiàn)代研究明確證實(shí),吸煙后口腔清潔不凈產(chǎn)生的煙斑可加重牙周疾病。吸煙也會(huì)促進(jìn)口腔中白色念珠菌從芽孢到菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)變,從而加重口腔念珠菌病的程度［1］。吸煙量與口腔白斑的關(guān)系緊密,是口腔癌發(fā)病的高危因素。中國(guó)疾控中心也發(fā)布過(guò),嬰幼兒4個(gè)月暴露于二手煙環(huán)境中,會(huì)增加齲齒患病的風(fēng)險(xiǎn)。另外,吸煙對(duì)嬰幼兒唇腭裂的發(fā)生、吸煙者齲病的發(fā)病、種植牙能否長(zhǎng)期成功等問(wèn)題都有緊密的聯(lián)系［2-4］。有一些研究也證實(shí),有長(zhǎng)期吸煙史的患者比無(wú)吸煙史者更易有口腔科的相關(guān)疾?。?,6］。每支香煙經(jīng)過(guò)燃燒可產(chǎn)生上千余種化合物,而口腔是人體眾多器官中最早接觸到煙草煙霧的,從前大多數(shù)研究報(bào)告中報(bào)道過(guò)尼古丁對(duì)HGF有不利影響,而在此次實(shí)驗(yàn)研究中作者保全完整的煙草煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE),充分檢測(cè)其中的完整成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此次通過(guò)體外傳代培育人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblast,HGF),并用CSE作用于細(xì)胞上,從而觀察煙草煙霧對(duì)HGF增殖的影響。通過(guò)觀察CSE影響HGF傳代增殖討論CSE對(duì)于牙周病愈合過(guò)程中產(chǎn)生的不利影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 煙草(盒式香煙)；DMSO(二甲基亞砜,Sigma公司)；四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,Sigma 公司)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；胰蛋白酶(Gibco)；抗波形絲蛋白和抗角蛋白抗體(邁新公司,河南),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司,德國(guó))；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Spectra Ⅲ,奧地利)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；人骨保護(hù)蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海瑞齊生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織塊法原代培養(yǎng)HGF［7］收集健康成人因種植修復(fù)牙齦成形術(shù)棄除的健康無(wú)炎癥牙齦組織,分成大小約1 mm的組織塊,并用含胎牛血清(FBS)的DMEM確保組織塊不干燥,取得的牙齦組織塊單層鋪于25 ml大小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,隨后將其翻轉(zhuǎn)加入含15%FBS的培養(yǎng)基10 ml,置5%濃度CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保持37℃約2 h,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶接著培養(yǎng)［8］。每間隔5 d察看牙齦成纖維細(xì)胞繁育狀況。若細(xì)胞生長(zhǎng)后次日更換培養(yǎng)基,細(xì)胞繁育達(dá)瓶底一半后可加入0.25%的胰酶進(jìn)行消散,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)若HGF由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變成圓球狀時(shí),馬上棄除胰蛋白酶,重新加含15%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培育,當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底3/5后再進(jìn)行第1次傳代,當(dāng)細(xì)胞形成單層后再次傳代(為1∶2)。

1.2.2 HGF形態(tài)觀察 HGF培養(yǎng)到第5天,顯微鏡下可見(jiàn)：有少許長(zhǎng)梭形細(xì)胞由組織塊周?chē)派錉铍x散出來(lái),漸漸成暈狀。牙齦成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形或者放射星形,細(xì)胞胞漿豐滿,有2～4個(gè)不等的胞漿突,細(xì)胞核大多為一個(gè)且為橢圓形,細(xì)胞緊貼培養(yǎng)瓶壁爬行生長(zhǎng)。細(xì)胞較少密度低時(shí)細(xì)胞間呈網(wǎng)狀,細(xì)胞密度高時(shí)則排成旋渦狀或者呈束(見(jiàn)圖1)。

圖1 HGF細(xì)胞形態(tài)(×100)

1.2.3 傳代細(xì)胞來(lái)源鑒定 選取第4代培養(yǎng)細(xì)胞至于載玻片上作為細(xì)胞的來(lái)源鑒定,采用丙酮溶液固定,吹干,用進(jìn)行抗波形絲蛋白(1∶100)及細(xì)胞抗角蛋白(1∶100)免疫組化染色。顯示抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性,抗細(xì)胞角蛋白染色陰性,從而判定傳代的細(xì)胞來(lái)自中胚層(圖2,圖3)。

圖2 抗角蛋白陰性表達(dá)(×400)

圖3 抗波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)(×400)

1.2.4 CSE 依據(jù)Oltmanm方法,燃燒一根香煙,過(guò)濾嘴的一側(cè)運(yùn)用纖維過(guò)濾器連接到橡膠導(dǎo)管上,導(dǎo)管的另一側(cè)接含10 ml培養(yǎng)基的有塞試管,同時(shí)在試管塞接50 ml注射器抽吸CSE,8次,50 ml/次,用時(shí)30 s,隨后去除過(guò)濾端。將總400 ml煙霧試管放置2 h,用濃度1 mol/L的氫氧化鈉將其酸堿值調(diào)至中性,用纖維濾膜過(guò)濾從而得到純的煙霧提取物原液,將原液按照2.5%、5.0%、10.0%、20.0%的濃度比例稀釋成實(shí)驗(yàn)用液,并在0.5 h內(nèi)應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CSE對(duì)HGF增殖的影響 用第5代的健康細(xì)胞,含3×104/ml的細(xì)胞培養(yǎng)基接種于各96孔板內(nèi),各組8孔共計(jì)5組,100 μl/孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含15%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,再更換為10%FBS的培養(yǎng)液,加入稀釋成不同濃度梯度的CSE,使其最終濃度依次為2.5%、5.0%、10.0%、20.0%,空白對(duì)照。培養(yǎng)5 d后,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl,4 h后終止培養(yǎng),移棄孔內(nèi)液體,加入150 μl二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶物15 min,酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)490 nm的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

作用24、48、72 h時(shí),空白對(duì)照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐漸降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白對(duì)照,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CSE對(duì)HGF增殖的影響()

表1 CSE對(duì)HGF增殖的影響()

注：與空白對(duì)照比較,aP＜0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HGF被不同濃度(2.5%、5.0%、10.0%、20.0%)CSE的培養(yǎng)液作用,其細(xì)胞增殖受到明顯抑制,空白對(duì)照、2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均逐漸降低,且2.5%CSE、5.0%CSE、10.0%CSE、20.0%CSE的OD值均低于空白對(duì)照,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),且細(xì)胞增殖的抑制作用隨CSE濃度的升高明顯增強(qiáng)。當(dāng)CSE濃度達(dá)到20.0%以上時(shí),實(shí)驗(yàn)受到CSE中色素成分的干擾無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行。但實(shí)驗(yàn)中證實(shí),CSE能夠抑制HGF的增殖,抑制了骨保護(hù)蛋白的表達(dá),從而影響HGF的數(shù)目甚至功能。

Tipton等［9］曾經(jīng)提出過(guò),煙草中的尼古丁可以明顯的使HGF增殖受到抑制,當(dāng)尼古丁的濃度達(dá)到0.05%的時(shí)候,會(huì)抑制細(xì)胞產(chǎn)生纖維連接蛋白以及Ⅰ型膠原；煙冷凝物能夠通過(guò)影響金屬基質(zhì)蛋白酶從而增加HGF中Ⅰ型膠原的降解［10］；Eduardo等［11］提出煙草中的有害成分可阻止HGF對(duì)無(wú)病變牙根以及玻璃的粘附；煙草燃燒產(chǎn)物里面的有害物通過(guò)對(duì)細(xì)胞的附著、增殖、分泌等過(guò)程產(chǎn)生干預(yù)［12］；Cattaneo等［13］研究認(rèn)為,燃燒的煙草會(huì)散發(fā)出丙稀等物質(zhì),通過(guò)影響細(xì)胞的附著和增殖抑制其在體外培養(yǎng)的過(guò)程。β1-integrin是HGF粘附因子之一,暴露于香煙煙霧中會(huì)抑制β1整合素的產(chǎn)生從而影響牙齦成纖維細(xì)胞的粘附［14］。高濃度的煙草冷凝物還會(huì)通過(guò)抑制細(xì)胞白介素6和8的分泌從而改變牙齦成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)周期,抑制其生長(zhǎng)［15］。本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致,可能是由于CSE會(huì)通過(guò)影響HFG生長(zhǎng)使其失去粘附力；HGF的細(xì)胞蛋白質(zhì)合成能力減弱；進(jìn)而影響牙齦細(xì)胞的附著；并且HGF對(duì)膠原纖維束的調(diào)節(jié)能力遭到破壞,給外界有害侵犯物質(zhì)以可乘之機(jī)；通過(guò)使底物表面產(chǎn)生電荷變化,從而使HGF的粘附得到干擾；細(xì)胞自身吞噬功能減弱,使得不良的膠原纖維不能有效的被排出,牙周支持織不能及時(shí)有效恢復(fù),說(shuō)明了吸煙不但使牙周病繼續(xù)進(jìn)展［16］,更不利于牙周治療,不利于治療創(chuàng)傷的恢復(fù)［17］,提示其在牙周病病理中的作用。

研究表明,吸煙可能通過(guò)對(duì)牙齦膠原纖維及牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的損傷,使牙齒周?chē)С纸M織的自我修復(fù)能力減弱。吸煙也可以通過(guò)促進(jìn)牙周袋內(nèi)壁上皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)角化,從而阻止結(jié)合上皮的重新附著,使牙周袋更深;牙周支持組織部分血供減少,進(jìn)而使得自身修復(fù)力及防御力均降低［18］?？偨Y(jié)過(guò)去他人和本次的研究發(fā)現(xiàn),煙草煙霧提取液對(duì)牙周病病情的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生了十分重要的影響,本實(shí)驗(yàn)中高濃度CSE對(duì)HGF增殖起到顯著的抑制作用。因此,煙草與牙周病的相關(guān)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。