程剛 鄭金紅 李國臣 劉陽 張華妮 曹賢達(dá) 殷莉

隨著人口老齡化的趨勢及快節(jié)奏生活方式的改變,諸如精神分裂癥、抑郁癥、阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢,嚴(yán)重威脅著人們生命健康和生活質(zhì)量,已成為醫(yī)藥領(lǐng)域及社會(huì)各界都高度關(guān)注的焦點(diǎn)。但血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)功能性濾過機(jī)制使得幾乎全部大分子和98%的小分子物質(zhì)難以從血液進(jìn)入腦組織［1］。BBB的這種低通透性是藥物滲透進(jìn)入CNS的主要限速因素［2］,給CNS疾病的治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于傳統(tǒng)動(dòng)物模型種屬差異與影響因素的多重性(如實(shí)時(shí)藥物穩(wěn)態(tài)的血藥濃度、給藥途徑、劑型、劑量、藥物在腦內(nèi)代謝情況及與血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)等),導(dǎo)致各藥物穿透BBB的參數(shù)差異很大,無法實(shí)現(xiàn)真實(shí)模擬人體BBB的目的。所以,研究人員亟需建立能準(zhǔn)確預(yù)測和評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)穿透BBB能力的高仿真體外模型,以此為載體促進(jìn)CNS藥物的篩查。本文對(duì)BBB的生理結(jié)構(gòu)及功能、體外細(xì)胞模型的構(gòu)建以及藥物BBB通透性評(píng)價(jià)方法等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述,以期能為后續(xù)穿透BBB的靶向制劑開發(fā)提供參考。

1 BBB的生理學(xué)基礎(chǔ)

BBB的相關(guān)研究已有近百年歷史,得益于現(xiàn)代生物膜理論與神經(jīng)生理學(xué)科的迅速發(fā)展,極大加深了人們對(duì)這一機(jī)能現(xiàn)象的再認(rèn)識(shí)。BBB系一層介于外周血液與腦、脊髓神經(jīng)元細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)界面,其低通透性、高選擇性阻礙能力對(duì)維護(hù)CNS的穩(wěn)態(tài)至為關(guān)鍵。BBB主要結(jié)構(gòu)可分為三部分：最內(nèi)層為腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)及其之間的緊密連接(tight junction,TJ)；中間層為基膜(basement membrane,BM)和周細(xì)胞(Pericyte)；外層為星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)和細(xì)胞外基質(zhì)。解剖生理結(jié)構(gòu)見圖1［3］,其各主要結(jié)構(gòu)的功能特點(diǎn)見表1。

表1 BBB主要結(jié)構(gòu)的功能特點(diǎn)

圖1 BBB解剖生理圖

BBB的屏障效應(yīng)除了受其機(jī)械結(jié)構(gòu)和物理電荷的影響也與功能方面息息相關(guān)。在BBB上與毛細(xì)血管結(jié)合的高活性神經(jīng)肽降解酶(胺肽酶、內(nèi)肽酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等)組成的“酶化屏障”可進(jìn)一步限制特異性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。如治療CNS疾病的藥物常因其代謝基團(tuán)與神經(jīng)肽耦聯(lián)時(shí),受到“酶化屏障”的干擾使得不穩(wěn)定而影響療效。此外,BBB還存在著“免疫屏障”,即BMECs上大量與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的內(nèi)源性受體及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)［7］,如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、胰島素受體、P-糖蛋白(P-gp,又稱MDR逆轉(zhuǎn)劑)［9］及多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)受體通過吸收周圍循環(huán)系統(tǒng)中的營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、己糖、維生素、膽堿、低密度脂蛋白、神經(jīng)肽及核酸等)并克隆出對(duì)應(yīng)的特異性抗體,若在主動(dòng)腦靶向遞藥系統(tǒng)中能利用該克隆抗體作為藥物前體,將對(duì)CNS新藥研發(fā)大有裨益。另外,小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)和Astrocyte分別充當(dāng)腦內(nèi)巨噬細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞參與免疫反應(yīng)［10］。

2 BBB體外模型的建立

2.1 單層BMECs模型 建立單層內(nèi)皮細(xì)胞模型的核心在于腦微血管的分離和獲取的BMECs純性。常采取機(jī)械分散或膠原酶消化及密度梯度離心法將腦微血管與其他雜質(zhì)細(xì)胞(如周皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)分離,降低污染程度。一般多使用牛腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BBMVEC)和豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PBMVEC)進(jìn)行原代培養(yǎng),但這些大型動(dòng)物細(xì)胞因?yàn)槿〔碾y度較大也會(huì)用大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞替代培養(yǎng)。盡管各研究者培養(yǎng)的單層BMECs模型在相差顯微鏡下存在部分形態(tài)學(xué)差別,但在超微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞特征性抗原表達(dá)上仍表現(xiàn)出較好的一致性,保持了BBB典型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶的表達(dá)。如可對(duì)體內(nèi)激素和生理刺激產(chǎn)生反應(yīng),保證血管的完整性和張力；表達(dá)外周血管內(nèi)皮細(xì)胞膜標(biāo)志物Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWF)；與植物血凝素特異性結(jié)合,吸收低密度脂蛋白等［11］。而由于單層細(xì)胞模型的分離、培養(yǎng)方法較繁瑣、純化不夠以及離體培養(yǎng)的BMECs忽略了真實(shí)在體BBB微環(huán)境,通常表現(xiàn)出緊密連接的通透性增高、低至中等的跨膜電阻值(TEER)、特異性酶和功能性蛋白表達(dá)減弱等特征。這種重要特性喪失的“表型漂移”(Phenotypic drift)現(xiàn)象隨細(xì)胞培養(yǎng)的傳代而加重,往往因缺失關(guān)鍵的BBB結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá),不能充分發(fā)揮其屏障功能［12］,因此單獨(dú)用內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建BBB模型有其自身的局限性。

2.2 BMECs與Astrocyte共培養(yǎng)模型 實(shí)踐證明將BEMCs與Astrocyte共培養(yǎng)可以克服單層細(xì)胞模型中的“表型漂移”,保留住BBB完整特性來更好地模擬BEMCs的微環(huán)境。該模型借助Transwell系統(tǒng)將BEMCs接種在上室,Astrocyte接種在微孔膜下方或小室底壁,多室微孔膜(0.4 μm)使得兩種細(xì)胞彼此間隙2～3 nm,既能透過各種小分子及生長因子相互作用而又阻止細(xì)胞直接接觸［13］。不過Astrocyte誘導(dǎo)BEMCs增強(qiáng)屏障特性的機(jī)制尚未完全闡明,學(xué)界普遍認(rèn)為可能與其分泌的活性細(xì)胞因子有關(guān),如膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)誘導(dǎo)細(xì)胞極性的產(chǎn)生使胞間緊密連接更嚴(yán)實(shí)［14］。在實(shí)踐中多以BEMCs同種屬和原代培養(yǎng)的Astrocyte共培養(yǎng)的表現(xiàn)型最為接近在體狀態(tài)［15］,形成的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶的表達(dá)更具活性。陳雪等［16］使用大鼠原代BEMCs和Astrocyte在Transwell小室中建立共培養(yǎng)BBB模型,用免疫熒光檢測各細(xì)胞特征標(biāo)記物并觀察跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻TEER的動(dòng)態(tài)變化。研究顯示：共培養(yǎng)生長后的原代BEMCs具有典型的梭形“鋪路石”樣形態(tài),內(nèi)皮細(xì)胞間形成緊密連接,而Astrocyte則表現(xiàn)出多個(gè)突起的典型外觀；免疫組化鑒定BEMCs和Astrocyte分別表達(dá)vWF抗原與神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP),且細(xì)胞純度均達(dá)到95%以上；共培養(yǎng)BBB模型的TEER為(65±1.42)Ω·cm2較單獨(dú)BEMCs培養(yǎng)模型顯著升高,以上表明通過共培養(yǎng)融合使模型結(jié)構(gòu)更具真實(shí)模擬在體BBB特性的能力。於曉東等［17］利用小鼠BEMCs和Astrocyte建立共培養(yǎng)BBB模型,進(jìn)一步研究來源于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的外泌體對(duì)其功能的影響。分別于共培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行TEER檢測及48 h辣根過氧化物酶滲透試驗(yàn),結(jié)果顯示共培養(yǎng)48 h及72 h后接種外泌體實(shí)驗(yàn)組TEER較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01),表明人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞外泌體可使BBB通透性增加。

2.3 三維BBB模型 為了最大限度地模擬在體BBB微環(huán)境,目前,有研究者［18,19］構(gòu)建出BMECs-周細(xì)胞-Astrocyte或神經(jīng)元等在同一Transwell中培養(yǎng)出三維BBB模型,充分發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用。三維培養(yǎng)模型中一些BBB大分子標(biāo)記物(如Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、Claudin-12、ZO-1及ZO-2)在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量均不同程度上調(diào),同時(shí)跨膜電阻明顯增強(qiáng),滲透率降低,結(jié)構(gòu)與體內(nèi)環(huán)境最相似［20］,具有較高的研究價(jià)值。曲園［8］將人體原代BMECs-周細(xì)胞-Astrocyte在低粘附瓊脂糖凝膠培養(yǎng)板內(nèi)建立新一代3D-BBB體外模型,分別采用細(xì)胞示蹤技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù),對(duì)模型內(nèi)細(xì)胞分布及模型表面具有的功能蛋白(如緊密連接和P-gp等)進(jìn)行鑒定,證實(shí)該模型內(nèi)細(xì)胞排列及表征與人體內(nèi)BBB結(jié)構(gòu)高度擬合,特異性蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)模型。

2.4 動(dòng)態(tài)BBB模型 隨著研究表明,血流剪切力會(huì)對(duì)BEMCs的分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生影響,從而改變其屏障能力。近年來出現(xiàn)的微流控芯片BBB模型發(fā)展十分迅速,在體內(nèi)BEMCs與膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用暴露于血流的剪切作用力之下,將生化信息和幾何性綜合起來,更好地模擬體內(nèi)組織的動(dòng)態(tài),并可實(shí)時(shí)監(jiān)控分子轉(zhuǎn)運(yùn)遷移［21］。微流體BBB代表最現(xiàn)實(shí)的體外系統(tǒng)來研究血流動(dòng)力學(xué)變化和誘導(dǎo)炎癥是如何影響大腦微血管的完整性。通過引入改性后具有較大透孔的中空纖維,既能克服模型不允許免疫細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的問題,而不損害系統(tǒng)的模仿阻隔性的能力。實(shí)踐中可通過對(duì)血流進(jìn)行干擾等方式降低切應(yīng)力模擬BBB損害狀態(tài),可以極大地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞相互作用(釋放活性氧和細(xì)胞因子)及各種導(dǎo)致免疫細(xì)胞外滲進(jìn)入腦基質(zhì)的研究。微流體BBB可廣泛應(yīng)用于各種CNS疾病的分子病理學(xué)研究如腦缺血再灌注損傷和癲癇等改變。Cucullo等［22］利用中空纖維技術(shù)設(shè)計(jì)出具有體外BBB人性化動(dòng)態(tài)的毛細(xì)管系統(tǒng)(DIV-BBB),即在三維流動(dòng)環(huán)境中使BEMCs與Astrocyte共同培養(yǎng)發(fā)育,形成一個(gè)功能性BBB。1周后,通過對(duì)14C-蔗糖、TEER及乳酸生產(chǎn)/葡萄糖消耗率等通透性功能測定,證明了此模型良好的再現(xiàn)了一個(gè)體內(nèi)有氧代謝模式下的生理環(huán)境。

2.5 永生型細(xì)胞株模型 鑒于原代BEMCs的分離、純化技術(shù)繁瑣且難以定期獲取等不足,而永生型細(xì)胞株表型比較穩(wěn)定、易傳代和大量增殖的特點(diǎn)恰是復(fù)制BBB體外模型理想的材料。目前開發(fā)最普遍的永生細(xì)胞系有hCMEC/D3、大鼠RBE4、小鼠bEnd.3等,而尤以大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系RBE4建立的模型最具代表性。雖永生細(xì)胞有望克服不同轉(zhuǎn)運(yùn)子的底物和抑制劑的重復(fù)交叉影響［23］,但RBE4往往不能形成緊密連接結(jié)構(gòu),不具備限制小分子通透的性能,導(dǎo)致該模型不適用于滲透性的研究［24］。hCMEC/D3細(xì)胞系則會(huì)表達(dá)具有連接性的結(jié)構(gòu)蛋白,主要作用于BBB物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。另外,人多能干細(xì)胞(human placental stem cells,hPSC)可通過誘導(dǎo)分化提供可再生、可持續(xù)的腦內(nèi)皮細(xì)胞,很好地復(fù)制出相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和屏障性能［25］,在干細(xì)胞治療腦系疾病研究中前景深遠(yuǎn)。

3 藥物BBB通透性評(píng)價(jià)方法

3.1 體內(nèi)評(píng)價(jià) 藥物BBB通透性的體內(nèi)評(píng)價(jià)主要指測定腦血比lg(Cbr/Cbl),即計(jì)算穩(wěn)態(tài)下的藥物透過BBB的量與血液中的化合物濃度的比值,常有腦組織勻漿法、微透析法等技術(shù)方法［26］。原梅等［27］建立大鼠穩(wěn)態(tài)腦分布模型后,LC-MS/MS定量分析安替比林、阿替洛爾和ZZB系列新藥候選化合物的血漿和腦組織藥物濃度,測出安替比林、阿替洛爾的腦血比KP值與Caco-2細(xì)胞跨膜表觀滲透系數(shù)Papp值均符合已知透腦性質(zhì),表明測定穩(wěn)態(tài)藥物腦血比適用于藥物BBB通透程度的評(píng)價(jià)。腦組織勻漿法優(yōu)勢在于樣品采集操作性高、提取量大,可對(duì)微量成分進(jìn)行濃縮測定,但采集的腦組織樣品并非來自活體動(dòng)物,因此并不完全真實(shí)。

腦微透析則結(jié)合灌流取樣和透析技術(shù)以此實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測活體腦內(nèi)完整細(xì)胞外液物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化。葉勇等［28］經(jīng)大鼠鼻腔或靜脈注射給予芎冰噴霧劑后,利用微透析技術(shù)進(jìn)行腦內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究,HPLC法測定透析液樣品中磷酸川芎嗪(TMPP)的濃度,經(jīng)鼻和靜注給藥后TMPP都能快速進(jìn)入腦內(nèi)達(dá)到峰濃度,且吸收均符合一室模型,經(jīng)鼻給藥TMPP在腦內(nèi)保留時(shí)間更長。表明微透析法能實(shí)現(xiàn)芎冰噴霧劑鼻腔給藥后TMPP的藥動(dòng)學(xué)研究。此法可多次多部分同時(shí)取樣,取樣量少對(duì)體內(nèi)平衡干擾小,保持穩(wěn)定生理狀態(tài)。不可避免的是腦部探針的埋植對(duì)腦組織有一定損傷,而且透析結(jié)果只能反映特定時(shí)間范圍內(nèi)突觸間隙的遞質(zhì)濃度變化,還要考慮透析膜回收率對(duì)測定數(shù)據(jù)的影響。

3.2 體外評(píng)價(jià) 由于BBB的生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜使得體內(nèi)評(píng)價(jià)受限于多種因素影響(如實(shí)時(shí)藥物穩(wěn)態(tài)的血藥濃度、給藥途徑、劑型、劑量、藥物在腦內(nèi)代謝分布及與血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)等),而通過臨床直接考察藥物跨BBB更不現(xiàn)實(shí)。因此,藥物BBB通透性評(píng)價(jià)更多是借助高效簡便的體外細(xì)胞模型來完成。理想的體外模型在研究BBB的生理病理改變、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)及篩選潛在腦靶向藥物方面優(yōu)勢顯著。體外評(píng)價(jià)的關(guān)鍵要素不僅應(yīng)考察模型的細(xì)胞形態(tài)、TEER、內(nèi)皮滲透系數(shù)、緊密連接(如Claudin、Occludin、ZO-1和ZO-2等特異性蛋白)等生理結(jié)構(gòu)和基本參數(shù),還要具備諸如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、胰島素受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及外排泵(如P-gp及MRP)等功能性轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)作用。另外,良好的模型更要從藥物體內(nèi)外代謝與活體BBB的相關(guān)性進(jìn)行分析,同時(shí)兼顧模型的簡單性、實(shí)用性和可及性。常見BBB模型體內(nèi)外相關(guān)性的檢測見表2［29］。

表2 BBB模型標(biāo)記物與檢測方法

張水華等［30］采用大鼠原代BCEC細(xì)胞與Astrocyte建立體外BBB模型并評(píng)價(jià)藥物滲透能力。非接觸式培養(yǎng)后可見到典型的細(xì)胞形態(tài)(短梭形BCEC細(xì)胞和分枝狀突起Astrocyte)；免疫組化分別檢測出高表達(dá)因子Ⅷ抗原和膠質(zhì)纖維酸性蛋白,TEER及熒光素鈉的通透性符合建模要求；LC-MS檢測西咪替丁等6個(gè)化合物體內(nèi)外透過BBB模型滲透系數(shù)具有一定相關(guān)性(R2=0.7679)。查雨鋒等［31］則建立大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞、Astrocyte三重培養(yǎng)體外BBB模型,各細(xì)胞均呈現(xiàn)出典型形態(tài)(BMECs鋪石路樣、BMPC胞體較大且呈分枝狀,AS細(xì)長突觸)；TEER及熒光素鈉滲透系數(shù)及對(duì)堿性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶1(γ-GT1)的表達(dá)測定滿足模型要求；測定計(jì)算出阿替洛爾等5個(gè)陽性藥通過BBB模型的滲透量Papp與已知體內(nèi)數(shù)據(jù)具有較高擬合度(R2=0.92)。以上研究表明通過對(duì)特征性標(biāo)記物評(píng)價(jià)BBB模型體內(nèi)外的相關(guān)性有利于準(zhǔn)確、快速地篩察各藥物跨BBB的通透性。

3.3 其他方法 近年來同位素標(biāo)記法也應(yīng)用于藥物BBB通透性的評(píng)價(jià)。如給藥后跟蹤腦部14C、3H標(biāo)記物發(fā)射的β射線和125I標(biāo)記物γ射線,無須組織勻漿后繁瑣的藥物提取操作就能開展藥動(dòng)學(xué)研究,且檢測靈敏性高、特異性強(qiáng)。姜國華等［32］為了解鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基(CNB)的BBB通透性,采用Iodogen法進(jìn)行125I標(biāo)記,標(biāo)記率高達(dá)85%,產(chǎn)物125I-CNB放化純度為95.7%。小鼠靜脈注射125I-CNB結(jié)果顯示完整的CNB分子未能穿透BBB,而其降解肽段卻能透過BBB進(jìn)入腦組織。

此外,也有通過一定精確度的數(shù)學(xué)模型及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)來評(píng)價(jià)藥物穿透BBB的研究報(bào)道［33-36］。隨著生物信息技術(shù)發(fā)展,直接在體內(nèi)成像的納米材料也是一個(gè)令人激動(dòng)的領(lǐng)域［37］,提供實(shí)時(shí)跟蹤這些內(nèi)在和外源性生物標(biāo)記的納米載體,利用正電子發(fā)射斷層掃描(PET),單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT),磁共振成像(MRI),以及各種基于光學(xué)對(duì)比度的成像方法,如生物發(fā)光成像,熒光分子斷層和光聲斷層成像(FMT),可以實(shí)現(xiàn)定量監(jiān)測結(jié)構(gòu)、功能和CNS疾病的分子通路。高分辨率的實(shí)時(shí)性能范式轉(zhuǎn)移可視化成像平臺(tái)的構(gòu)建必將給評(píng)價(jià)指標(biāo)提供最直接有效的證明。

4 結(jié)語與展望

BBB是保護(hù)CNS的天然屏障,可防止病原體及神經(jīng)毒性物質(zhì)影響大腦功能,同時(shí)也是CNS疾病中重要的病理損傷所在,在維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有重要作用。目前通過多種分離培養(yǎng)方法,從許多物種中進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng),甚至開展多重細(xì)胞立體培養(yǎng),而動(dòng)物的腦容量、腦組織分布、血液流速、微血管彈性及張力等因素都與人體有差異,導(dǎo)致數(shù)據(jù)相關(guān)性評(píng)價(jià)存在一定缺陷。然而,當(dāng)前許多藥物的CNS轉(zhuǎn)運(yùn)均采用正常的組織或動(dòng)物作為BBB模型進(jìn)行評(píng)價(jià),忽視了CNS病理損傷狀態(tài)時(shí)BBB通透性的變化,得出偏頗性結(jié)論。但在篩選CNS藥物研發(fā)［38］、探究病原體感染機(jī)制［39,40］和干細(xì)胞個(gè)體化治療［41］等應(yīng)用中,構(gòu)建高性價(jià)的體外BBB模型仍是不可或缺的研究工具。據(jù)報(bào)道［42］,以人干細(xì)胞培養(yǎng)的3D模型分化出的內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接及外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能表達(dá)是目前最契合人體解剖生理的模型。雖然體外細(xì)胞模型的建立途徑有多種,但二元共培養(yǎng)模型在體內(nèi)外相關(guān)性上優(yōu)于單一模型,三元模型在多細(xì)胞的協(xié)同促進(jìn)下整體又優(yōu)于二元模型。不過每種模型都有其自身缺點(diǎn)和優(yōu)勢,需要研究者選擇更符合自己研究目的、藥性及可行條件的模型,并建立更為合理嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u(píng)價(jià)方法。

現(xiàn)已表明在不破壞BBB生理結(jié)構(gòu)的情況下,通過結(jié)構(gòu)修飾、制劑改造及聯(lián)合用藥等途徑可不同程度改善藥物BBB通透性［43］。如脂質(zhì)體、納米粒等新型遞藥系統(tǒng)能夠靶向穿透BBB直達(dá)中樞神經(jīng)病灶［44,45］,被視為治療CNS疾病領(lǐng)域的戰(zhàn)略方向。另一方面,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦為奇恒之府、元神之官,所謂《靈樞·邪氣臟腑病形》載：“十二經(jīng)脈之三百六十五絡(luò),其血?dú)饨陨嫌诿娑呖崭[”,《靈樞·海論》載:“人始生,先成精,精成而腦髓生”,而傳統(tǒng)中藥的多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)使其在腦系疾病的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢。如薄荷、冰片、麝香、川芎、石菖蒲等芳香類中藥具有“醒腦開竅,引藥上行”的功效,研究表明它們能不同程度上提高BBB的通透性［46-50］,其作用可能與中藥有效成分能促進(jìn)穿透BBB或改善BBB的超微結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)有關(guān)［51］。若利用納米技術(shù)通過包封中藥有效成分或在其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表面靶向修飾制成中藥納米制劑,促進(jìn)藥物透過BBB,以此提高腦內(nèi)藥物濃度蓄積,發(fā)揮中藥減毒增效的效果［52,53］,無疑將為開發(fā)CNS疾病藥物創(chuàng)造巨大潛力。本課題組目前已初步開展相關(guān)中藥與新劑型有機(jī)結(jié)合在治療腦卒中方面的研究。雖然制備工藝、藥效等方面處于探索階段,但隨著對(duì)BBB的生理機(jī)制以及CNS病理認(rèn)識(shí)的深入,并借助生物信息技術(shù)的高新發(fā)展,建立更為科學(xué)理想的BBB模型與評(píng)價(jià)體系,必定能推動(dòng)新型中藥納米腦靶向制劑的突破。