原佳慧，張鵬翔，吉樹(shù)森，盧嘉茵，羅小毛，閆 藝，王海東

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

肌內(nèi)脂肪是反映動(dòng)物肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，其含量直接影響動(dòng)物肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性及大理石花紋的分布[1]。脂肪組織是動(dòng)物體內(nèi)重要的分泌組織，脂肪細(xì)胞會(huì)分泌瘦素、脂聯(lián)素等[2-3]。哺乳動(dòng)物脂肪組織主要分為白色脂肪組織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織。3種脂肪組織來(lái)源不同，功能也各不相同。白色脂肪組織內(nèi)含有較多的甘油三酯，可以儲(chǔ)存機(jī)體多余的能量。由于白色脂肪細(xì)胞中線粒體含量較低，所以其雖儲(chǔ)存能量能力較強(qiáng)，但脂肪消耗能量的能力較差[4-5]。因此，脂肪干細(xì)胞的形成及代謝過(guò)程的直接或間接調(diào)控因子已成為研究熱點(diǎn)。

多種miRNA可直接或間接參與脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程，且其可通過(guò)與下游靶基因結(jié)合的方式參與調(diào)控脂肪干細(xì)胞的分化及發(fā)育[6]。研究表明，內(nèi)源性miR-140-5p在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)分化過(guò)程中表達(dá)較高，miR-140-5p可靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅰ(TGFBR1)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[7]，miR-140-5p能夠靶向且正調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA 核副斑點(diǎn)裝配轉(zhuǎn)錄物1(LnoRNA NEAT1)促進(jìn)脂肪衍生干細(xì)胞(ADSCs)成脂分化[8]。此外，研究表明，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)與miR-140-5p的近端啟動(dòng)子結(jié)合正調(diào)控miR-140-5p的表達(dá)[7]，表明miR-140-5p與C/EBPs可能是正反饋模式，miR-140-5p可能在脂肪分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。通過(guò)查找miRBase等網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)了可能靶向miR-140-5p的基因，一部分已經(jīng)被驗(yàn)證參與脂肪干細(xì)胞的分化過(guò)程，其中P300/CBP相關(guān)因子(PCAF)又名KAT2B，是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，具有乙酰轉(zhuǎn)移活性，能通過(guò)乙?；M蛋白和非組蛋白的方式參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。P300/CBP與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和癌癥的發(fā)生有著直接的關(guān)系[10]。研究表明，PCAF基因在3T3-L1細(xì)胞成脂分化過(guò)程中具有重要作用[11]，同時(shí)關(guān)于PCAF基因在成脂分化方面相關(guān)文獻(xiàn)較少，PCAF基因影響成脂分化的具體機(jī)制還不清晰。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。PPAR可分為α、β(或δ)和γ 3種類型，其中PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng)，與脂肪細(xì)胞分化、機(jī)體免疫及胰島素抵抗關(guān)系密切，是一種可由多種脂肪酸及其衍生物激活的核轉(zhuǎn)錄因子[12]。PPARγ參與脂肪細(xì)胞分化，并與肥胖密切相關(guān)，是公認(rèn)的脂肪分化的標(biāo)志因子[13]。C/EBPs家族是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個(gè)亞家族，具有多種功能，在細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生及機(jī)體的免疫、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、血液生成等方面發(fā)揮著重要的作用[14-15]。目前發(fā)現(xiàn)的C/EBPs家族有C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPζ 6類，且C/EBPs家族是第一個(gè)被證明在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的家族[16]。研究表明，在前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化過(guò)程中C/EBPβ的表達(dá)在脂肪分化初期瞬時(shí)增強(qiáng)，而后C/EBPα與PPARγ轉(zhuǎn)錄激活[17]?；赑PARs與C/EBPs家族互相影響且在細(xì)胞成脂分化中起到重要的作用，本試驗(yàn)選擇C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ作為3T3-L1細(xì)胞成脂分化機(jī)制的下游基因進(jìn)行深入研究，探索miR-140-5p對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖DMEM購(gòu)自上海帝博思生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Sciencell公司；Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910購(gòu)自Abcam公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒中提試劑盒均購(gòu)自Thermo公司；PGLO載體、PGLO-PCAF 3′-UTR載體、PEGFP-N1載體、PEGFP-N1-PCAF載體均購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司；RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR?Primix ExTaqⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、Adipogenesis Assay試劑盒均購(gòu)自Abcam公司；PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ抗體購(gòu)自Proteintech Group公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ、NheⅠ均購(gòu)自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自深圳康體生命科技有限公司。

1.2 分子材料的設(shè)計(jì)及合成

1.2.1 miR-140-5p模擬物、抑制物的合成 根據(jù)miRBase網(wǎng)站miR-140-5p全序列(登錄號(hào)：KT921569.1)，由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成miR-140-5p的模擬物、抑制物及對(duì)照序列(miR-140-5p mimics、inhibitor、NC)(表1)。

表1 模擬物、抑制物及siRNA信息

1.2.2 siRNA設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中PCAF基因完整CDS區(qū)序列(登錄號(hào)：NM_001190846.1)，由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成PCAF基因的3條siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)(表1)。

1.2.3 載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中PCAF基因完整CDS區(qū)序列(登錄號(hào)：NM_001190846.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCAF過(guò)表達(dá)引物，以3T3-L1細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA 5 μL，2×TaqMasterMix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，與PEGFP-N1空載體同時(shí)使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切，將二者雙酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行搖菌、涂板、挑單克隆菌、搖菌，將得到的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功后對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，重組質(zhì)粒命名為PEGFP-N1-PCAF。

根據(jù)miRDB網(wǎng)站得到PCAF基因的3′-UTR序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCAF 3′-UTR引物(表2)，其中包含miR-140-5p與PCAF基因預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，使用上述方法構(gòu)建PGLO-PCAF 3′-UTR載體。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)miRBase、GenBank中miR-140-5p、PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物信息見(jiàn)表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物信息

1.3 miR-140-5p對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

1.3.1 3T3-L1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分化 3T3-L1細(xì)胞解凍后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照2×105/mL接種到6孔板中，待匯合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用250 μL DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)分別稀釋miR-140-5p mimics(mimics)、NC和Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置5 min，將NC與miR-140-5p mimics分別與轉(zhuǎn)染試劑混勻后靜置20 min；靜置期間，將6孔板里的舊培養(yǎng)基棄掉，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入800 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)；靜置結(jié)束后將500 μL轉(zhuǎn)染混合液均勻滴加到培養(yǎng)板中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使溶液混合均勻；培養(yǎng)箱中靜置6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，將完全培養(yǎng)基換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基(將胰島素、IBMX、地塞米松試劑按照說(shuō)明書1 000倍稀釋，1 mL完全培養(yǎng)基加入1 μL各試劑配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，誘導(dǎo)3 d后換為分化培養(yǎng)基(將胰島素試劑按照說(shuō)明書1 000倍稀釋，1 mL完全培養(yǎng)基加入1 μL配制分化培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換1次分化液。

1.3.2 油紅O染色鑒定 在誘導(dǎo)分化第7天進(jìn)行油紅O染色。將3T3-L1細(xì)胞每孔加入100 μL稀釋的脂滴分析固定劑，并孵育15 min；用100 μL洗滌液洗2次，每次5 min；干燥培養(yǎng)板；將75 μL油紅O工作液添加到所有孔中，包括不含細(xì)胞的空白孔，并孵育20 min；移除所有油紅O溶液，用蒸餾水清洗細(xì)胞數(shù)次，至蒸餾水清澈；用100 μL洗滌液洗2次，每次5 min。顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá) 在誘導(dǎo)分化的第―1(分化前1 d)、0、1、2、3、5、7天收集3T3-L1細(xì)胞，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-140-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量；在誘導(dǎo)分化第7天收集細(xì)胞進(jìn)行C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。用TRIzol提取誘導(dǎo)分化第―1、0、1、2、3、5、7天的3T3-L1細(xì)胞、轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics和NC組誘導(dǎo)分化7 d的3T3-L1細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 200 ng，ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4 miR-140-5p靶基因篩選及靶基因序列保守性分析

采用miRandn(http:∥mirdb.org/)和TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_70/)2個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-140-5p的靶基因，在數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選與脂肪分化相關(guān)的靶基因作為潛在靶基因。通過(guò)在miRBase(https:∥www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)得到小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負(fù)鼠、金剛鸚鵡和雞的miR-140-5p及其靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列，通過(guò)比對(duì)各物種miRNA序列，分析其結(jié)合位點(diǎn)序列的保守性。

1.5 miR-140-5p對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)的影響

1.5.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分化 將miR-140-5p mimics(mimics)、miR-140-5p inhibitor(inhibitor)與NC按照1.3.1方法轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方式同1.3.1。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá) 在誘導(dǎo)的第2天收集1.5.1各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。試驗(yàn)方法同1.3.3，檢測(cè)mimics、inhibitor與mimics NC組的miR-140-5p的靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.3 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá) 在誘導(dǎo)的第2天收集1.5.1各組細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。用蛋白裂解液收集mimics、inhibitor與mimics NC組的細(xì)胞后，冰上裂解40 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清液，檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、室溫封閉1 h、孵育一抗(4 ℃孵育過(guò)夜)、洗膜、孵育二抗(37 ℃孵育1 h)、洗膜后，涂抹發(fā)光液后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。檢測(cè)miR-140-5p靶基因的蛋白表達(dá)水平。

1.6 過(guò)表達(dá)或敲低PCAF對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

1.6.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分化 將PEGFP-N1-PCAF載體、PEGFP-N1載體、NC、PCAF siRNA1、PCAF siRNA2和PCAF siRNA3、PCAF NC與PCAF siRNA3按照1.3.1的方法轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方式同1.3.1。在誘導(dǎo)第2天時(shí)收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)，在誘導(dǎo)分化第7天進(jìn)行油紅O染色鑒定。

1.6.2 油紅O染色 試驗(yàn)方法同1.3.2，觀察PEGFP-N1-PCAF與PEGFP-N1組及PCAF siRNA與NC組細(xì)胞中脂滴的染色情況。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá) 試驗(yàn)方法同1.3.3，檢測(cè)PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細(xì)胞PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因的相對(duì)表達(dá)水平；檢測(cè)PCAF siRNA、NC組PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6.4 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá) 試驗(yàn)方法同1.5.3，檢測(cè)PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細(xì)胞C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ與GAPDH蛋白表達(dá)水平；檢測(cè)PCAF siRNA1、PCAF siRNA2、PCAF siRNA3和NC組細(xì)胞中PCAF蛋白表達(dá)水平；檢測(cè)PCAF siRNA組與NC組C/EBPβ、PPARγ與GAPDH蛋白表達(dá)水平。

1.7 miR-140-5p與PCAF靶向關(guān)系驗(yàn)證

將293T細(xì)胞分為mimics+PCAF 3′-UTR、NC+PCAF 3′-UTR、mimics+PGLO空載(mimics+vehicle)和空白+PCAF 3′-UTR(Blank+3′-UTR PCAF)4組，待293T細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用125 μL DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)分別稀釋PCAF 3′-UTR質(zhì)粒、mimics，用250 μL DMEM培養(yǎng)基稀釋Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(6 μL/孔)，室溫靜置5 min，將質(zhì)粒和mimics與轉(zhuǎn)染試劑分別混勻再靜置20 min，按照1.3.1的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，用于雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)。試驗(yàn)前需按照Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910試劑盒說(shuō)明書制備裂解液1×PLB、LAR Ⅱ、Stop & Glo試劑、1×Stop & Glo Raegent。除去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞后，將1×PLB加入到培養(yǎng)孔中。在室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15 min，將裂解液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板中，加入20 μL PLB裂解液/孔，加入100 μL LAR Ⅱ，檢測(cè)樣本熒火蟲(chóng)熒光素酶活性；加入100 μL Stop & Glo試劑，檢測(cè)樣本海腎熒光素酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用2-△△Ct法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，采用ImageJ 1.48軟件計(jì)算蛋白灰度值，用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 miR-140-5p對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

在3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-140-5p的表達(dá)量有明顯變化趨勢(shì)。與誘導(dǎo)分化前1 d(-1 d)相比，在細(xì)胞匯合至100%時(shí)miR-140-5p表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，在添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基第1天時(shí)，miR-140-5p表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，而后在分化過(guò)程中下降，分化至第3天miR-140-5p表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，分化至第5天后miR-140-5p表達(dá)水平已降低到未分化之前的水平(圖1A)。油紅O染色發(fā)現(xiàn)，mimics組脂滴明顯多于NC組(圖1B)。與NC組相比，mimics組成脂標(biāo)志性基因C/EBPδ、PPARγ轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)，C/EBPβ基因的轉(zhuǎn)錄水平有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)(圖1C～1E)。

①A，3T3-L1細(xì)胞分化第-1、0、1、2、3、5、7天miR-140-5p表達(dá)水平；B，miR-140-5p NC組與mimics組油紅O染色結(jié)果(40×)；C～E，C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量。②與―1 d相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)；無(wú)#，差異不顯著(P>0.05)。③與NC/PEGFP-N1組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 miR-140-5p靶基因預(yù)測(cè)及PCAF序列保守性分析

利用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p與PCAF 3′-UTR區(qū)含有預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，在674-681 bp處(圖2A)。預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)在小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負(fù)鼠、金剛鸚鵡和雞物種間的保守性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在不同物種間此結(jié)合位點(diǎn)保守性較高(圖2B)。

A，miR-140-5p和PCAF 3′-UTR區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)；B，PCAF 3′-UTR區(qū)序列保守性分析

2.3 miR-140-5p對(duì)PCAF表達(dá)的影響

由圖3可知，與NC組相比，mimics組miR-140-5p、PCAF的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，inhibitor組miR-140-5p的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)、PCAF的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。由圖4可知，與NC組相比，mimics組PCAF蛋白的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，inhibitor組PCAF蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

圖3 各組miR-140-5p(A)與PCAF(B)基因的相對(duì)表達(dá)量

圖4 各組PCAF蛋白表達(dá)量

2.4 過(guò)表達(dá)PCAF對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

由圖5可知，與PEGFP-N1組相比，PEGFP-N1-PCAF組細(xì)胞脂滴明顯增加。由圖6可知，與PEGFP-N1組相比，PCAF、PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，C/EBPδ基因相對(duì)表達(dá)量有上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。由圖7可知，與PEGFP-N1組相比，PEGFP-N1-PCAF組C/EBPβ、C/EBPδ蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。

圖5 油紅O染色結(jié)果(40×)

圖6 各組PCAF(A)、C/EBPδ(B)和PPARγ(C)基因相對(duì)表達(dá)量

A，C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白Western blotting條帶；B～D，C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白灰度值

2.5 敲低PCAF基因?qū)?T3-L1細(xì)胞成脂分化的影響

由圖8可知，與NC組相比，3條siRNA均極顯著抑制PCAF蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，由于siRNA3組PCAF蛋白水平降低最顯著，所以選用siRNA3進(jìn)行后續(xù)PCAF敲低試驗(yàn)。由圖9可知，siRNA3組脂滴明顯少于NC照組。與NC組相比，siRNA3組C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)(圖10)；與NC組相比，siRNA3組C/EBPβ蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，PPARγ蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)(圖11)。

A、B，在3T3-L1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染3條PCAF siRNA后PCAF蛋白的表達(dá)水平

圖9 油紅O染色結(jié)果(40×)

2.5 miR-140-5p與PCAF基因靶向關(guān)系驗(yàn)證

雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank+PCAF 3′-UTR、mimics+vehicle和NC+PCAF 3′-UTR相比較，mimics+PCAF 3′-UTR組中雙熒光素酶活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖12)，說(shuō)明miR-140-5p與PCAF基因無(wú)靶標(biāo)關(guān)系。

圖12 各組雙熒光素酶相對(duì)活性

3 討 論

脂肪代謝及分化與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)，miRNA在脂肪分化過(guò)程中的作用與功能具有重要意義。研究表明，在ST2細(xì)胞成脂分化過(guò)程中，在細(xì)胞匯合至100%的第2天添加誘導(dǎo)分化液，miR-140-5p的表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化前1 d升高，在誘導(dǎo)分化后第1天達(dá)到最高值[7]。本研究在細(xì)胞匯合至100%當(dāng)天添加誘導(dǎo)分化液，結(jié)果顯示，3T3-L1細(xì)胞在誘導(dǎo)分化當(dāng)天miR-140-5p表達(dá)水平極顯著升高，在誘導(dǎo)后第1天miR-140-5p表達(dá)量達(dá)到峰值，與ST2細(xì)胞的研究結(jié)果基本一致。其原因可能在于：當(dāng)細(xì)胞匯合100%時(shí)，3T3-L1細(xì)胞達(dá)到了細(xì)胞接觸抑制時(shí)期，這時(shí)期為前體脂肪細(xì)胞分化第一階段(克隆增殖階段)，且細(xì)胞在接觸抑制后很快進(jìn)入第二階段(終末分化階段)，為了避免錯(cuò)過(guò)分化第一階段，所以本研究中誘導(dǎo)分化時(shí)間選擇在這一時(shí)期。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化后第1天miR-140-5p水平達(dá)到峰值，與上述文獻(xiàn)一致，這個(gè)峰值可能代表著細(xì)胞進(jìn)入了分化的第二階段，而造成細(xì)胞分化第一階段到第二階段的原因可能是添加誘導(dǎo)分化試劑引起的。miR-140-5p在細(xì)胞分化第一階段與第二階段均顯著增高，這說(shuō)明miR-140-5p在3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程中扮演重要角色。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-140-5p，發(fā)現(xiàn)miR-140-5p能夠促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的成脂分化，并且上調(diào)成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ的表達(dá)。

為了探究miR-140-5p的成脂調(diào)控作用，利用TargetScan與miRBase等靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-140-5p的下游靶基因，從中選擇與脂肪分化相關(guān)的PCAF基因作為研究對(duì)象。有研究表明，PCAF基因在3T3-L1細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[11]。本研究結(jié)果證明，與NC組相比，miR-140-5p mimics組PCAF基因的表達(dá)量上調(diào)，miR-140-5p inhibitor組PCAF基因表達(dá)量下降，說(shuō)明miR-140-5p可影響PCAF基因的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組相比，PCAF基因高表達(dá)后脂滴明顯增多，且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平均上升；相反，敲低PCAF抑制3T3-L1細(xì)胞分化為脂滴，且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平均不同程度地下降，說(shuō)明PCAF是通過(guò)正調(diào)控C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的。盡管組蛋白乙?；瘜?duì)脂肪細(xì)胞分化調(diào)控的研究較少，但目前的文章顯示組蛋白乙?；揎椝脚c成脂分化水平呈正相關(guān)[18]。Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PCAF通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪的發(fā)生，并通過(guò)影響Prdm16的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)棕色脂肪的發(fā)生。除此之外，C/EBPβ轉(zhuǎn)錄活性也受PCAF的調(diào)節(jié)，PCAF可促進(jìn)前脂肪細(xì)胞中C/EBPβ乙酰化[20]，且增強(qiáng)前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中C/EBPα的轉(zhuǎn)錄激活，從而提高分化效率[21]。以上結(jié)果說(shuō)明，PCAF在細(xì)胞分化過(guò)程中的功能是通過(guò)調(diào)控PPARγ與C/EBPs來(lái)實(shí)現(xiàn)的，由此可得，miR-140-5p可通過(guò)miR-140-5p/PCAF/C/EBPs、PPARγ促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。

由于miR-140-5p和PCAF的正相關(guān)關(guān)系與miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用機(jī)制不一致，PCAF 3′-UTR與miR-140-5p的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)序列比對(duì)結(jié)果顯示，其預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)在多物種間序列保守性較高，但雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果卻顯示二者并無(wú)靶標(biāo)關(guān)系。因此，miR-140-5p可能是通過(guò)靶向其他基因間接影響了PCAF的表達(dá)，但具體通路并不清晰。利用TargetScan與miRBase等預(yù)測(cè)靶基因的網(wǎng)站，預(yù)測(cè)miR-140-5p的其他靶基因，其中一些靶基因可能在miR-140-5p與PCAF基因之間具有一些作用，如E3泛素蛋白連接酶-1(siah E3 ubiquitin protein ligase 1，Siah1)、E3泛素蛋白連接酶UBR5(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5，UBR5)、組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)、組蛋白脫乙酰酶7(histone deacetylase7，HDAC7)等基因。Siah1是一種泛素連接酶，通過(guò)降解蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白平衡，且是miR-140-5p的預(yù)測(cè)靶基因，如若Siah1可泛素化PCAF使其降解，而miR-140-5p又成功靶向且負(fù)調(diào)控Siah1，這時(shí)Siah1就具有了在miR-140-5p與PCAF之間發(fā)揮作用的潛質(zhì)。而UBR5也是泛素蛋白連接酶之一，可能與Siah1具有類似功能。HDAC4和HDAC7是組蛋白脫乙酰酶，其作用與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶PCAF相反，且在細(xì)胞核內(nèi)組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；^(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡，并由這2種酶共同調(diào)控。miR-140-5p的預(yù)測(cè)靶基因中有HDAC4和HDAC7，所以miR-140-5p極有可能通過(guò)負(fù)調(diào)控HDAC4或HDAC7的表達(dá)而間接影響了PCAF基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性miR-140-5p在成脂分化的克隆增殖階段與終末分化階段都明顯升高，miR-140-5p通過(guò)上調(diào)PCAF的表達(dá)促進(jìn)PPARγ和C/EBPs表達(dá)而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞成脂分化。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-140-5p與PCAF之間無(wú)靶標(biāo)關(guān)系，說(shuō)明miR-140-5p可能通過(guò)間接作用于PCAF而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化。