潘建秋，劉付穗，吳曼莉，江丹莉，歐陽宏佳，沈 栩，許丹寧，賀建華，黃運茂

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.仲愷農業(yè)工程學院動物科技學院，廣州 510225；3.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510225)

RF酰胺相關肽(RF-amide-related peptide,RFRP)是繼鳥類促性腺激素抑制激素(gonadotrophin inhibitory hormone,GnIH)被發(fā)現(xiàn)以后在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的GnIH的同源物[1-3]。RFRP是目前哺乳動物中主要的繁殖活動負向調控因子，盡管不同物種中的RFRP分布有所不同，但其神經元多數(shù)集中投射到與繁殖調控、攝食有關的區(qū)域，可能參與繁殖行為與攝食行為調控[4-5]。研究顯示，RFRP-3可引起大鼠附睪管的劑量依賴性組織學改變，如精子數(shù)量下降及退化和空泡化的附睪上皮細胞增加[6]；生長期大鼠注射RFRP-3可顯著降低血清黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平，睪丸重量也受到顯著抑制，但生長激素(growth hormone，GH)水平提高，小鼠體重增長[7]；在成年雄性大鼠中，給予RFRP-3也可抑制LH分泌和雄性性行為，并刺激GH釋放[8]；大鼠腹腔注射RFRP-3后體重顯著增加，采食次數(shù)增加，但采食量無顯著性差異[9]；而對大鼠腦內注射RFRP-3發(fā)現(xiàn)，50和100 ng劑量的RFRP-3顯著降低了采食量，25和200 ng對其沒有影響[10]。由此可見，RFRP-3在動物生長發(fā)育及繁殖活動調控中均發(fā)揮著重要作用，但發(fā)揮作用的具體途徑仍有待探索。

褪黑素(melatonin,MLT)是一種吲哚類神經內分泌激素，其分泌具有晝夜節(jié)律性，參與調控機體生殖節(jié)律、代謝活動、免疫功能等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，注射外源性MLT可促進大鼠體重增長[12]，斷奶后綿羊埋植或飼喂MLT均可顯著提高其平均日增重，促進其生長性能[13]。另外，MLT可通過下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic pituitary gonadal axis,HPG)軸，在下丘腦水平上調節(jié)促性腺激素的分泌，進而影響生殖系統(tǒng)功能[14]；而MLT對生殖系統(tǒng)的影響是可變的，主要取決于動物的生理條件和物種；給敘利亞倉鼠睪丸注射MLT，可顯著降低睪酮含量，降低睪丸體積，降低雄激素合成[15]；但長期使用MLT可誘導梅花鹿的睪丸早期發(fā)育[16]；埋植MLT可促進銀狐的精子生成[17]；皮下注射褪黑激素可增加山羊睪酮分泌[18]；綿羊褪黑激素處理組的生育能力也較對照組高[19]。

研究表明，松果體分泌的MLT對RFRP-3的生成具有調控作用[20]。在哺乳動物上，光信號主要通過影響松果體MLT的生產和分泌來調控動物繁殖活動變化。在敘利亞倉鼠上，短光照下會降低下丘腦RFRP表達，切除松果體后RFRP的光周期變化會消失，而長日照下注射MLT可使倉鼠RFRP的表達受到抑制[14]；在西伯利亞倉鼠上，GnIH的表達和釋放受光周期和MLT調節(jié)[21]。表明MLT和RFRP-3均會影響到哺乳動物的生長與繁殖，且MLT可能參與RFRP-3分泌調控，但兩者之間的關系如何？尤其是在哺乳動物初情期對生長與繁殖性能有什么影響？目前并不清楚。鑒于此，本試驗以初情期雄性昆明小鼠為對象，研究單獨給予雄鼠外源性RFRP-3、MLT及混合給予RFRP-3和MLT對初情期雄鼠體重增長、飼料轉化、激素生成及睪丸發(fā)育的影響，以期揭示RFRP-3和MLT對初情期昆明小鼠生長、繁殖性能的影響及兩者間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

促黃體生成激素ELISA試劑盒、睪酮激素(TESTO)ELISA試劑盒均購自上海博谷生物科技有限公司；鼠RFRP-3多肽(SVTFQELKDWGAKK-DIKMSPAPANKVPHSAANLPLRF)由上海強耀生物科技有限公司化學合成，純度≥98%；MLT購自Sigma公司；ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol、PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix均購自Applied Biosystems公司。

低溫高速離心機(ST8R)購自Thermo公司；全自動酶標儀(ELX800)購自伯騰儀器公司；PCR擴增儀、實時熒光定量儀均購自ABI公司；勻漿機購自IKA公司。

1.2 樣品采集

45只體重均一、健康的42日齡昆明小鼠雄鼠SPF級，購自廣州中醫(yī)藥大學試驗動物中心，動物許可證：SCXK(粵)2018-0034。小鼠飼養(yǎng)于同一房間內，給予12 h人工光照(12L∶12D)，單籠飼養(yǎng)(1只/籠)，飼養(yǎng)環(huán)境均處于同一水平：溫度25 ℃±3 ℃；相對濕度40%～70%，氨濃度≤15 mg/m3，每天定時更換墊料，并提供充足的飼糧和飲用水。

小鼠預飼7 d后，正式試驗開始時(第0天(d0)),隨機選取5只小鼠屠宰，采集睪丸檢查發(fā)育情況，并留做組織切片觀察；剩余40只小鼠隨機分為4組(n=10)，分別為RFRP-3組、MLT組、RFRP-3和MLT混合組、對照組。試驗第0～10(d10)天每天對雄鼠進行肌肉注射，RFRP-3組注射1.5 mg/kg RFRP-3溶液；MLT組注射1.5 mg/kg MLT溶液；RFRP-3和MLT混合組同時注射1.5 mg/kg RFRP-3和1.5 mg/kg MLT溶液；對照組注射等量生理鹽水。在第0和10天對每組小鼠進行稱重，并記錄其在整個試驗期的采食量；在第10天注射完藥物30 min后開始采樣(n=10)，用乙醚麻醉小鼠，然后對雄鼠進行眼球摘除采血，分離血清，―20 ℃保存用于激素檢測。采血后，屠宰小鼠采集小鼠下丘腦和垂體組織，―80 ℃保存，用于檢測生長和生殖相關基因表達。采集睪丸，稱量睪丸重并留做組織切片觀察。

1.3 方法

1.3.1 小鼠生長性能相關指標計算 小鼠增重、平均采食量、料重比(F/G)及睪丸性腺指數(shù)(gonado somatic index,GSI)均按以下公式計算：

小鼠增重(g)=小鼠終末體重-小鼠初始體重

平均采食量(g/只)=總采食量/小鼠數(shù)量

料重比=平均采食量/小鼠增重

GSI(%)=睪丸重量/小鼠體重×100%

1.3.2 石蠟切片制作及分析 ①小鼠睪丸置于福爾馬林固定液中固定；②將固定好后的睪丸放進包埋框中，流水沖洗，至少2 h；③脫水、透明：50%酒精2 h；70%酒精2 h；80%酒精2 h或過夜；90%酒精2 h；95%酒精2 h；無水酒精Ⅰ 1 h；無水酒精Ⅱ 1 h；二甲苯Ⅰ 30 min；二甲苯Ⅱ 30 min；二甲苯∶石蠟為1∶1，15 min；石蠟溶液Ⅰ 1 h；石蠟溶液Ⅱ 1 h；④石蠟包埋；⑤5 μm切片；⑥40 ℃水浴展片，撈片于載玻片上，于45 ℃烘干8 h以上；⑦HE染色：二甲苯Ⅰ 5 min；二甲苯Ⅱ 5 min；95%酒精2 min；90%酒精2 min；80%酒精2 min；70%酒精2 min；50%酒精2 min；蒸餾水2 min；蘇木素18 min；流水沖洗15 min；1%鹽酸酒精5 s；流水沖洗30 min；伊紅溶液1 min；80%酒精2 min；90%酒精2 min；95%酒精2 min；無水酒精Ⅰ 2 min；無水酒精Ⅱ 2 min；二甲苯Ⅰ 5 min；二甲苯Ⅱ 5 min；⑧中性樹膠封片。

1.3.3 睪丸組織切片觀察及分析 在CaseViewer看圖軟件上截取睪丸切片5×、10×、20×和40×的截圖，應用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統(tǒng)一以毫米(mm)作為標準單位，在每張切片5×截圖中測量5個曲精小管面積(mm2)；計算每張切片3個10×截圖中曲精小管數(shù)量(個)，求出單位面積曲精小管數(shù)量(個/mm2)，測量生精上皮厚度，其為視野內圓形曲精小管內各階段生精細胞及支持細胞組成的生精上皮厚度(μm)；計算每張切片3個20×截圖中間質細胞數(shù)量(個)，計算出視野面積(mm2)，求出間質細胞密度(個/mm2)；計數(shù)每張切片3個40×截圖中曲精小管內各級生精細胞數(shù)量(個)。

1.3.4 生殖激素水平測定 血清中睪酮和LH的測定方法按照試劑盒說明書進行操作。①取出試劑盒室溫(20～25 ℃)放置30 min；②分組：取出96孔板，分別設標準品組(6個濃度)、空白孔、待測樣品，均設2個重復；③加樣：依照標準品的順序分別加入100 μL的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入100 μL蒸餾水；其余微孔中加入100 μL的待測樣本；④加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入50 μL酶標溶液(空白對照孔除外)；⑤溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內于37 ℃恒溫孵育1 h；⑥洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15～30 s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙徹底拍干；⑦顯色：各孔加入顯色劑A液50 μL后，再加入顯色劑B液50 μL；⑧終止：37 ℃下避光反應10～15 min，加入50 μL終止液；⑨讀板：在450 nm波長讀取各孔的D值。

1.3.5 基因相對表達量測定 采用Trizol方法提取下丘腦和垂體組織RNA，并用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，采用實時熒光定量PCR測定下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、RFRP-3、褪黑素受體1A(melatonin receptor 1A，Mtnr1A)及垂體LH、GH基因mRNA的相對表達水平。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中參考序列，利用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計以上基因的定量引物和內參基因β-actin引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系20 μL：PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.6 μL。PCR反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，退火(退火溫度見表1)1 min，共40個循環(huán)。每個樣品3個重復，用β-actin基因進行校正。結果采用2―ΔΔCt法進行處理。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 小鼠生長性能

由表2可知，RFRP-3和MLT混合組及MLT組小鼠平均增重極顯著或顯著高于RFRP-3組(P<0.01；P<0.05)；料重比極顯著低于RFRP-3組(P<0.01)；其余指標各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表2 小鼠生長性能

2.2 小鼠睪丸組織發(fā)育

由表3可知，試驗第0天小鼠GSI較高，且極顯著高于第10天的各組GSI(P<0.01)；第10天MLT組小鼠睪丸生精細胞數(shù)量最多，顯著或極顯著高于其余各組(P<0.05；P<0.01)，RFRP-3組生精細胞數(shù)量最少；第10天MLT組小鼠睪丸間質細胞密度極顯著高于對照組(P<0.01)；第0天對照組小鼠睪丸單位面積曲精小管數(shù)量最多，顯著高于第10天對照組(P<0.05)，與第10天MLT組較為接近，第10天RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組小鼠睪丸曲精小管數(shù)量極顯著低于其他3組(P<0.01)；第10天MLT組小鼠睪丸生精上皮厚度與對照組接近，且極顯著高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組(P<0.01)；第0天小鼠睪丸曲精小管面積極顯著低于第10天MLT組(P<0.01)。

由圖1可知，第0天小鼠睪丸曲精小管內精原細胞較多，但仍無精子生成；第10天對照組睪丸曲精小管內管腔擴張，可見少量精子細胞，而MLT組睪丸曲精小管之間的間隙變小，曲精小管內精原細胞增多，初級精母細胞增多，精子細胞增多，支持細胞增多；RFRP-3組睪丸曲精小管之間的間隙明顯增寬，曲精小管內各級生精細胞明顯減少，小管中央處精子細胞數(shù)量減少，睪丸間質細胞數(shù)量減少；RFRP-3和MLT混合組睪丸曲細精小管之間的間隙增寬，部分曲精小管管腔擴張，小管內支持細胞數(shù)量減少，小管邊界模糊，其曲精小管內各級生精細胞數(shù)量減少。

A，對照組(d0)；B，對照組(d10)；C，MLT組(d10)；D，RFRP-3組(d10)；E，RFRP-3和MLT混合組(d10)

2.3 血漿生殖激素水平

由表4可知，MLT組小鼠血漿LH水平最高，顯著高于RFRP-3和MLT混合組(P<0.05)，與對照組和RFRP-3組均無顯著差異(P>0.05)；MLT組睪酮濃度最高，顯著或極顯著高于另外3組(P<0.05；P<0.01)。

表4 外源性MLT和RFRP-3對小鼠血漿生殖激素水平的影響

2.4 生長和生殖相關基因表達

由表5可知，在下丘腦中，MLT組小鼠GnRH基因mRNA相對表達量最高，其余3組相對表達量接近，各組間不存在顯著性差異(P>0.05)；RFRP-3組小鼠RFRP-3基因表達量最高，顯著高于MLT和對照組(P<0.05)，其余各組間均無顯著差異(P>0.05)；MLT組小鼠Mtnr1A基因表達量最高，極顯著高于RFRP-3組(P<0.01)。在垂體中，MLT組小鼠LH基因mRNA表達量最高，極顯著或顯著高于其余3組(P<0.01；P<0.05)，RFRP-3和MLT混合組LH基因表達量高于RFRP-3組和對照組，但差異不顯著(P>0.05)；MLT組GH基因表達量最高，極顯著高于對照組和RFRP-3組(P<0.01)。

表5 外源性MLT和RFRP-3對小鼠生長和生殖相關基因表達的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，對Zucker大鼠和Sprague Dawley大鼠灌服10 mg/kg MLT可促進2種大鼠的體重增長，且Sprague Dawley大鼠料重比顯著增加[12]；MLT可與其受體結合，促進雞GH分泌，從而促進生長[22]；綠光刺激可增強雞胚MLT的分泌和GH-IGF-1軸的上調[23]；大鼠腦室內注射RFRP-3抑制大鼠體重增長，但其GH分泌顯著增加[24]；RFRP-3可顯著抑制羊垂體促性腺激素的分泌，但對GH無顯著性影響[25]；順氯氨鉑(cisplatin,CP)和MLT共同處理下MLT可顯著緩解CP對小鼠食物攝入量、體重、尿液和糞便排出量等的抑制作用[26]。本研究中，MLT及RFRP-3和MLT混合組平均增重顯著高于RFRP-3組，RFRP-3組略低于對照組，但無顯著性差異；比較雄鼠料重比則發(fā)現(xiàn)RFRP-3組最高，顯著高于MLT及RFRP-3和MLT混合組，對照組料重比則與MLT及RFRP-3和MLT混合組接近；檢測垂體GH基因的相對表達量發(fā)現(xiàn)，給予外源性MLT的MLT組及RFRP-3和MLT混合組GH基因表達量均高于對照組，而給予了RFRP-3的RFRP-3組GH基因表達量與對照組接近，但略高于對照組。本研究結果與以上研究結果一致，MLT可通過促進GH的表達降低小鼠料重比和提高小鼠增重，而RFRP-3通過提高小鼠料重比來抑制其增重；當同時給予MLT和RFRP-3時，依然能一定程度促進小鼠增重，提示MLT可在一定程度上緩解RFRP-3對小鼠生長性能的抑制作用。

研究表明，給小鼠腹腔注射20 mg/kg MLT可促進睪丸體積增大，且顯著增加曲細精管面積、精母細胞和精子細胞數(shù)量[27]；MLT可保護小鼠睪丸熱應激損傷[28]，其對糖尿病大鼠睪丸的細胞、睪酮激素也具有保護作用[29]。RFRP-3對小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生具有抑制作用。Sumit等[30]研究發(fā)現(xiàn)，每8 h對小鼠注射血清素和多巴胺前體，其RFRP-3神經元數(shù)量極顯著增加，小鼠睪丸生精上皮層減少，間質細胞數(shù)量減少，曲細精管管腔擴張。本研究檢測雄性小鼠的睪丸發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，MLT組GSI略高于第10天對照組，RFRP-3組GSI略低于第10天對照組，RFRP-3和MLT混合組GSI與第10天對照組接近。觀察睪丸組織切片發(fā)現(xiàn)，MLT組各級生精細胞及間質細胞數(shù)量均高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組，兩組睪丸單位面積內曲精小管數(shù)量減少，且曲精小管管腔擴張，各級生精細胞數(shù)量減少。本試驗結果與以上研究結果一致。表明外源性MLT可促進雄鼠睪丸發(fā)育，外源性RFRP-3則抑制睪丸發(fā)育；當同時給予MLT和RFRP-3時，睪丸發(fā)育仍受到一定抑制。研究發(fā)現(xiàn)，切除松果體倉鼠注射MLT可抑制RFRP-3表達[20]；MLT能調控季節(jié)性繁殖倉鼠RFRP-3基因的表達及其與GnRH系統(tǒng)的相互作用[20-21]；RFRP-3可通過下丘腦或垂體水平抑制促性腺激素LH基因的表達和分泌，在大鼠、小鼠相關研究中發(fā)現(xiàn)RFRP-3可顯著抑制LH分泌[31-33]。通過檢測血清激素水平發(fā)現(xiàn)，MLT和RFRP-3對LH分泌的影響無統(tǒng)計學意義，但顯著影響睪酮分泌，MLT組睪酮水平極顯著高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組，對照組睪酮水平居中。在基因表達層面，MLT和RFRP-3對下丘腦RFRP-3、Mtnr1A基因和垂體LH基因表達的影響較為顯著，其中RFRP-3組RFRP-3基因表達量最高，RFRP-3和MLT混合組次之，而MLT組RFRP-3基因表達量最低，顯著低于RFRP-3組；MLT組Mtnr1A、LH基因表達量最高，均極顯著高于RFRP-3組；RFRP-3組Mtnr1A、LH基因表達量最低，RFRP-3和MLT混合組和對照組Mtnr1A、LH基因表達量接近。表明外源性MLT可抑制RFRP-3基因表達并調節(jié)LH基因的表達和分泌；外源性RFRP-3可調節(jié)LH基因的表達和分泌，進而抑制睪酮分泌。綜上，外源性RFRP-3可通過抑制LH基因表達和睪酮分泌進而影響小鼠睪丸的發(fā)育，最終抑制小鼠的繁殖性能；而外源性MLT可通過抑制RFRP-3基因的表達促進Mtnr1A和LH基因的表達，從而促進睪酮的分泌，且MLT也可能直接作用于睪丸促進睪丸精子的發(fā)生，從整體上提高小鼠的繁殖性能；當同時給予外源性RFRP-3和MLT時，MLT可在一定程度上緩解RFRP-3的抑制作用，促進LH基因表達及睪丸發(fā)育。

松果體分泌的MLT除通過在生殖軸上游的下丘腦-腺垂層面調節(jié)睪丸功能外，也可直接在睪丸中發(fā)揮調節(jié)作用。研究表明，MLT可在睪丸中合成，其可能通過調節(jié)睪丸激素分泌、FSH作用及睪丸體細胞(支持細胞、間質細胞、免疫細胞)和生殖細胞的增殖和分化來促進睪丸發(fā)育[27,34-36]。RFRP-3作為生殖軸上游的主要抑制因子，可抑制性腺激素生成和交配行為[5]，同時RFRP-3在睪丸中也有表達，且在間質細胞中表達量最高，提示其可能在睪丸中直接發(fā)揮調控作用[37]。結合本研究結果，提示MLT和RFRP-3既可以通過下丘腦-垂體-性腺軸參與調控小鼠繁殖性能，也可直接在睪丸中發(fā)揮作用，但具體機制仍有待進一步研究。

4 結 論

外源性MLT可通過促進GH表達提高小鼠增重并降低料重比，通過促進Mtnr1A和LH表達抑制RFRP-3表達，促進睪酮分泌和睪丸發(fā)育；外源性RFRP-3則降低小鼠增重和提高料重比，并通過抑制LH表達和睪酮分泌，對小鼠睪丸發(fā)育產生抑制作用。