袁富歡，藍妙傳,付余，戴宏杰，朱瀚昆，馮鑫，張宇昊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 生物學研究中心，重慶，400715)

油菜是重要的油料作物，主要分布在加拿大、印度、中國，在國內種植面積超過億畝，種植面積在主要油料作物中位居第2[1]。據(jù)統(tǒng)計，2018年度我國菜籽油的消費量約742.1萬 t，占全球菜籽油消費量25.9%[2]。菜籽粕為油菜籽榨油后的主要加工副產物，富含菜籽蛋白，粗蛋白含量為35%～45%，營養(yǎng)價值較高，具有較高的市場價值和潛力。但是，菜籽粕中含有的一系列“抗營養(yǎng)化合物”，降低了其利用價值。為提高菜籽粕的生物利用率和油菜籽副產物的價值，可將菜籽粕進行酶解得到菜籽多肽(rapeseed peptides，RPs)。通常，RPs可由菜籽粕經酶法水解、化學法和固態(tài)發(fā)酵[3]等方法制得。由于酶法水解的條件溫和，對蛋白質營養(yǎng)價值破壞較小以及利于小分子活性肽的產生[4]，被廣泛應用于食品領域中RPs的制備。

β-胡蘿卜素是廣泛存在于自然界中的天然色素，其能降低心血管疾病、皮膚病、癌癥和眼病等的風險[5]。由于β-胡蘿卜素屬于脂溶性物質，人體直接攝入通常會造成吸收性差，生物利用率低等不良影響。既往研究表明，蛋白或多肽可作為有效的包封載體，進而提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性和生物可及性[6]。ZHANG等[7]研究表明乳清蛋白原纖維是一種有效的脂溶性活性化合物的遞送系統(tǒng)，并且能顯著增加β-胡蘿卜素的包封效率和保護作用。因此，利用RPs對β-胡蘿卜素進行包封具有一定理論依據(jù)。

在生物活性成分的包封過程中，包封載體的理化性質(如分子質量、兩親性、pH、溫度)都會對包封效果造成影響，其中分子質量和兩親性的影響最為顯著。包封載體的分子質量會影響包封結構的形態(tài)以及生物活性成分的保留、保護和釋放。STLOUKAL等[8]研究表明與低分子質量的包封載體相比，高分子質量可以形成粒徑更小且均勻的顆粒，有較高的包封率，在水中的分散性較好。此外，包封載體的極性會影響其親疏水性，進而影響生物活性成分的相互作用，從而影響包封效果。MOHAN等[9]探究了乳清肽的疏水性對大豆卵磷脂脂質體包封的潛在影響，研究表明，與未分離的肽水解物相比，疏水肽的包封率顯著更高，并且形成的顆粒粒徑也較小且均勻。因此，基于包封材料結構特性，對包封材料進行分離純化，可對具有良好包封能力的材料進行富集，從而能更好地制備包封復合物[10]，這對RPs包封β-胡蘿卜素具有十分重要的意義。

因此，本研究以堿性蛋白酶酶解后的RPs為原料，探究了超濾和極性分離純化處理(乙醇、乙腈、異丙醇)對RPs包封能力的影響。通過測定表面疏水性(S0)、接觸角、包封率、負載量確立最佳的分子質量和極性溶劑，然后將最佳分子質量和極性溶劑聯(lián)合處理后的RPs進行傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)、透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)和激光共聚焦(laser scanning confocal microscopy，CLSM)等結構表征，以期為不同分子質量和極性的多肽包封β-胡蘿卜素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕，西南大學農學與生物技術學院；β-胡蘿卜素，北京索拉寶生物科技有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，諾維信公司(丹麥)；乙醇，重慶市川東化工有限公司；乙腈、異丙醇、NaOH、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、正己烷，成都科隆化學品有限公司試劑廠；人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、8-苯胺基-1-萘磺酸鹽(8-aniline-1-naphthalene sulfonate，ANS)，Sigma；源自牛心臟的細胞色素C，上海阿拉丁生化技術有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg，上海源葉生物技術有限公司；其余試劑均為分析純。另外，實驗用水均為通過Milli-Q系統(tǒng)(美國密理博公司)的純水。

1.2 儀器與設備

BNGM2097有機膜分離實驗機，濟南博納生物技術有限公司；XD-52AA旋轉蒸發(fā)器，上海賢德實驗儀器有限公司；DSA100接觸角測量儀，德國Kruss公司；PE20實驗室pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；BSA124S-CW電子天平，德國賽多利斯生物技術公司；CJ-78-1磁力攪拌器，上海將任實驗設備有限公司；Spectrun100 FTIR儀，美國PerkinElmer公司；HT7800透射電鏡，日本日立儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋，上海新諾儀器設備有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 RPs的制備

菜籽粕打粉后過100目篩，以料液比1∶25(g∶mL)將其分散在純水中，在堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L的最佳反應溫度下(55 ℃)預孵育10 min。用1 mol/L NaOH溶液將菜籽粕溶液調至堿性蛋白酶最佳pH 8.5，將酶加入菜籽粕溶液中(酶與底物體積比為1∶100)，在酶解過程中使用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH穩(wěn)定在8.5，水解60 min后得到菜籽粕酶解液，置于沸水中15 min以終止酶解反應。冷卻至室溫后，將酶解液在5 000 r/min下離心10 min，上清液過0.22 μm的水相膜，凍干后獲得RPs干粉。

1.4 基于分子質量差異多肽的分離制備

根據(jù)HE等[11]的方法制備不同分子質量的肽組分。將制備得到的多肽酶解液，使用有機膜分離實驗機在40 psi的恒定壓力下，通過分子質量阻隔為1 kDa的超濾膜，收集生成的滲透液(即分子質量<1 kDa肽組分)，并將截留液(>1 kDa肽)在同樣的條件下通過3 kDa分子質量阻隔超濾膜，以回收其中的1～3 kDa肽組分，3～5 kDa的肽組分用相同的步驟獲得。最終將得到的肽組分溶液冷凍干燥得到多肽粉末并保存在干燥皿中備用。

1.5 多肽平均分子質量的測定

采用高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱：BioBasic SEC120(7.8 mm×300 mm，5 μm)；檢測波長214 nm；樣品質量濃度1 mg/mL；柱溫25 ℃；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸= 30∶70∶0.1(體積比)；流速0.5 mL/min；進樣量20 μL；所選用的分子質量標準品包括HSA(66 000 Da)，細胞色素C(12 500 Da)，桿菌肽(6 511.51 Da)和Gly-Gly-Tyr-Arg(451.48 Da)，將標準品的保留時間(retention time，RT)和分子質量log(MW)繪制標準曲線，以獲得回歸方程y=-0.207 6x+7.007 8，再根據(jù)分子質量標準曲線方程計算樣品的MW。多肽的平均分子質量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Mrn,色譜圖中第n個峰的分子質量，Da；an色譜圖中總峰面積中第N個峰的百分比，%。

1.6 表面疏水性的測定

根據(jù)LAN等[6]的方法，使用疏水熒光探針ANS測定了多肽的S0。將多肽溶液(4 mL)與在DMSO中制備的20 μL、16 mmol/L ANS混合，并在室溫條件下避光放置15 min。使用熒光分光光度計在390 nm的激發(fā)波長和470 nm的發(fā)射波長下測量混合物的熒光強度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm。最終，以蛋白質質量濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mg/mL)為橫坐標，對應的熒光強度為縱坐標所得到的直線，其斜率即為多肽的S0(R2≥0.991)。

1.7 基于極性差異多肽的分離制備

將1.3制備的多肽酶解液，在磁力攪拌下分別加入不同極性的溶液(乙醇、乙腈、異丙醇)(1∶3，體積比)，并在4 ℃的冰箱中放置一段時間，使其充分混合。然后，將得到的混合溶液離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液在50 ℃的條件下旋轉蒸發(fā)除去其中所含有的有機試劑。最后，將不同極性的多肽溶液冷凍干燥備用。

1.8 靜態(tài)三相接觸角的測量

根據(jù)FENG等[12]的方法進行不同極性多肽接觸角的測量。首先使用紅外壓片機將冷凍干燥的RPs粉末以2 MPa的壓力壓制成型，然后使用高精度注射器將1滴去離子水(5 μL)沉積在顆粒表面上。通過使用電荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)照相機和圖像分析系統(tǒng)，記錄吸水過程并在4 min后對其進行定量以達到平衡。接觸角的值是3個重復的平均值。

1.9 多肽分離純化對β-胡蘿卜素的包封

1.9.1 多肽超濾后對β-胡蘿卜素的包封

配制5 mL(6 mmol/mL)不同分子質量(<1、1～3、3～5 kDa)的RPs溶液，并將pH調節(jié)至7.0，加入15 mg β-胡蘿卜素粉末，然后在25 ℃條件下磁力攪拌12 h。測量包封率(encapsulation efficiency，EE)和負載量(loading amount，LA)。

1.9.2 多肽極性處理后對β-胡蘿卜素的包封

配制5 mL不同極性(乙醇、乙腈、異丙醇)處理后的多肽溶液(5 mg/mL)，加入15 mg β-胡蘿卜素粉末，然后在25 ℃條件下磁力攪拌12 h。測量包封率和LA。

1.10 包封率和LA的測定

包封率定義為捕獲在載體核心中或表面的生物活性物質的量與生物活性物質的初始量相比的值。根據(jù)LIU等[13]的方法測定包封率。為使游離的β-胡蘿卜素分離出來，將包封后的多肽溶液加入一定量(10 mL)的正己烷，渦旋振蕩3 min，重復數(shù)次，直到正己烷層變?yōu)闊o色，進一步測量正己烷中未被包封的β-胡蘿卜素的含量。首先制作標準曲線，配制質量濃度為0.001～0.005 mg/mL 5個梯度的溶液，用酶標儀測量450 nm處的吸光度，得到其標準曲線為y=0.843 5x-0.000 2，R2=0.998 7。以正己烷溶液為空白，根據(jù)標準曲線測量游離β-胡蘿卜素的含量。包封率和LA計算如公式(2)(3)所示：

EE/%=[1-β-c(free)]/[β-c(total)]×100

(2)

LA/(mg·mg-1)=[1-β-c(free)]/m(RPs)

(3)

式中：EE,包封率；LA,負載量；β-c(free),游離β-胡蘿卜素的含量，mg；β-c(total),添加的β-胡蘿卜素的總含量，mg；m(RPs),添加的RPs的質量，mg。

1.11 微觀結構表征

1.11.1 FTIR

稱取適量的KBr，分別與RPs、β-胡蘿卜素，RPs包封β-胡蘿卜素形成的復合物RPs(β-c)混合并研磨壓制成薄片。通過比較4 000～400 cm-1化合物的吸光度獲得光譜信息，以探究復合物價鍵的變化[14]。

1.11.2 TEM

將樣品分散在水中，然后將液滴滴加在由碳支撐膜覆蓋的銅柵上。5 min后用1張濾紙吸走多余的液體。隨后，將0.01 mg/mL的磷鎢酸液體滴放在銅柵上，在室溫下稍微干燥，并在1 min后再次用濾紙除去。最終，使用TEM在100 kV的電壓下觀察銅柵。

1.11.3 CLSM

使用CLSM表征RPs(β-c)的微觀結構。將多肽和β-胡蘿卜素分別用0.001 mg/mL的尼羅藍(溶劑為水)和0.001 mg/mL尼羅紅(溶劑為異丙醇)染色。觀察時使用10×目鏡和40×物鏡的放大倍數(shù)。尼羅紅和尼羅藍分別由488 nm的氬激光和633 nm的He-Ne激光激發(fā)[15]。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，選擇的顯著性差異為P<0.05。每個實驗重復3次，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 RPs平均分子質量的分析

表1 不同組分的平均分子質量Table 1 Average molecular weight of different components

2.2 分子質量分布對多肽包封能力的影響

不同分子質量的多肽在肽鏈長度和摩爾質量方面存在差異，為消除由于分子質量引起的肽鏈摩爾數(shù)的不同對多肽包封能力的影響，根據(jù)表1測得的對應的平均分子質量，各組分稱取濃度為6 mmol/mL的多肽進行包封實驗。根據(jù)公式(2)計算得到包封率，并測定各組分S0(圖1)。在相同摩爾質量的情況下，3個組分(<1、1～3、3～5 kDa)的包封率分別為85.71%、89.66%、85.82%，S0分別是360.15、501.50、385.77。相較于其他2個組分，組分2(1～3 kDa)多肽包封率和S0最高，說明在此分子質量條件下的多肽表面暴露了更多的疏水基團，有利于β-胡蘿卜素的包封[16]。由此表明，經過超濾分離純化得到的分子質量1～3 kDa的多肽包封β-胡蘿卜素能力最佳。

圖1 不同分子質量(<1、1～ 3、3～5 kDa)多肽的包封及表面疏水性Fig.1 Encapsulation and surface hydrophobicity of peptides with different molecular weights (<1,1～ 3,3～5 kDa)

2.3 極性對多肽包封能力的影響

不同極性溶劑對多肽包封能力的影響如圖2-a所示。選用的溶劑極性大小順序為乙醇(6.8)>乙腈(6.2)>異丙醇(4.3)，經異丙醇處理后的接觸角最大(61.05°)，乙腈(51.20°)和乙醇(49.30°)次之，接觸角越大，表明樣品的兩親性越強，得到的接觸角結果與溶劑極性規(guī)律相符[17]。

a-接觸角；b-包封率和負載量圖2 不同極性溶劑處理后的多肽三相接觸角和包封率及負載量Fig.2 Three-phase contact angle, encapsulation efficiency and loading capacity of peptides treated with different polar solvents

極性影響著多肽的兩親性，并可能進一步影響多肽對疏水性物質β-胡蘿卜素的包封。圖2-b為不同極性多肽包封β-胡蘿卜素的結果。隨著處理溶劑的極性減小，用乙醇和乙腈分離純化后的多肽包封β-胡蘿卜素，包封率從85.49%提高到89.62%，而由異丙醇處理后的多肽包封率發(fā)生下降，僅為87.41%，在乙腈到異丙醇處理多肽組包封結果出現(xiàn)了拐點，可能的原因是在經過異丙醇的處理后多肽本身的極性過小，在包封的過程中多肽容易自身先發(fā)生聚集，從而對β-胡蘿卜素的包封能力會有所下降，最終導致包封率顯著降低(P<0.05)[18]。另一方面，乙醇、乙腈、異丙醇處理后的多肽的LA分別為0.51、0.54、0.52 mg/mg，其中乙腈處理后的LA最高。因此，經過乙腈分離純化處理后多肽包封β-胡蘿卜素的能力最佳。

2.4 包封復合物的結構表征

2.4.1 FTIR分析

RPs包封β-胡蘿卜素前后的FTIR如圖3-a所示。透射率在3 200～3 500 cm-1反映的是氫鍵的變化[19]，而在這個區(qū)域未發(fā)生明顯變化，說明在此實驗過程中沒有氫鍵參與反應，而根據(jù)β-胡蘿卜素的結構(圖3-b)分析可得，其不含有O原子等能提供電子的元素，與多肽之間也不能形成氫鍵。通過比較RPs(β-c)和RPs-A(β-c)在區(qū)域1 200～1 600 cm-1的變化，RPs包封后在此區(qū)域的峰朝著高波方向移動，說明RPs經超濾和極性分離純化處理后，與β-胡蘿卜素的相互作用效果較好[20-21]，包封率和LA有較大程度的提升。

a-RPs包封β-胡蘿卜素前后FTIR圖譜；b-β-胡蘿卜素二維結構圖圖3 β-c、RPs-A、RPs-A(β-c)的FTIR圖譜和β-胡蘿卜素的二維結構圖Fig.3 The FTIR spectra of β-c, RPs-A, RPs-A(β-c) and two-dimensional structure diagram of β-carotene

2.4.2 微觀結構表征分析

RPs、β-胡蘿卜素、RPs-A(β-c)的CLSM結果如圖4所示。圖4-C中大部分的圖像顏色都呈現(xiàn)為橙黃色，說明絕大多數(shù)的RPs與β-胡蘿卜素形成了包封復合物，這與較高包封率的結果相符[22]。同時，經過一系列分離純化后，用于包封β-胡蘿卜素所形成復合物的結構粒徑明顯變小很多，說明多肽分子質量會對復合物的粒徑產生明顯的影響。此外，觀察圖中熒光顏色的分布可知，大部分形成的復合物顆粒分布都比較均勻，只有少量復合物形成了聚集體，可能是經過極性分級處理后，在此條件下不容易聚集形成大顆粒[23]。因此，對多肽進行超濾和極性的分離純化處理，不僅能提高包封率，而且有利于形成分布均勻且易消化吸收的包封復合物。

圖4 RPs-A(A)、β-胡蘿卜素(B)和RPs-A(β-c)(C)的CLSM圖像以及RPs-A(a)、RPs-A(β-c)(b)的TEM圖像Fig.4 The CLSM images of RPs-A(A), β-carotene(B), RPs-A(β-c)(C) and the TEM images of RPs-A(a) and RPs-A(β-c)(b)

RPs-A和RPs-A(β-c)的TEM結果如圖4所示。由圖4-a可知，RPs-A為實心顆粒狀，顆粒大小和分布都較為均勻，粒徑為200～300 nm。圖4-b中的圓圈部分，可以看到RPs-A(β-c)，形成了明顯的空心狀顆粒且具有明顯的外殼，同時也觀察到形成的RPs-A顆粒內部包封有β-胡蘿卜素[13]。再縱觀整個的TEM視野，RPs-A(β-c)雖伴有少量的聚集但形成的顆粒也都分散均勻且外形大致為球狀。

綜上，對包封前后的多肽進行FTIR、CLSM、TEM等一系列結構表征，表明RPs經超濾和極性處理后，與β-胡蘿卜素的相互作用進一步增強，并且在經分離純化處理后，聚集現(xiàn)象有明顯的改善，整體分布也較為均勻，所形成的包封復合物大致為球狀。但是，RPs包封形成的復合物顆粒粒徑大小不均勻，可能與所用多肽的氨基酸序列和相互作用位點的不同有關，這個方向有待進一步探究。

3 結論

本研究以酶解60 min的RPs為原料，探究不同分子質量和兩親性對β-胡蘿卜素包封的影響。研究結果表明，分子質量為1～3 kDa的RPs對β-胡蘿卜素的包封能力最佳。不同極性溶劑處理下，經乙腈處理后的RPs包封β-胡蘿卜素的效果最佳。將超濾和極性溶劑聯(lián)合分離純化后的多肽用于包封β-胡蘿卜素，包封率由單獨處理的89.66%和89.62%，顯著提升到95.79%。FTIR結果表明，聯(lián)合處理后的多肽與β-胡蘿卜素的相互作用效果較好，使得包封率和LA有較大程度的提升。進一步分析包封體系CLSM和TEM的變化，與未經過分離處理的多肽包封電鏡圖相比，形成的包封復合物結構粒徑有明顯變小。因此，多肽分子質量和兩親性不僅影響其對β-胡蘿卜素的包封能力，而且對包封所形成的復合物粒徑也有較大的影響。