張蕾蕾，吳劍榮，張洪濤，高敏杰，詹曉北

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

郫縣豆瓣醬作為中國著名的地理標志產(chǎn)品，具有“口感香辣、酯香濃郁、色澤油亮”的特點[1]。根據(jù)豆瓣醬發(fā)酵的時間，可將其分為紅油郫縣豆瓣醬和傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬(特級、一級、二級)。一般來講，紅油郫縣豆瓣醬的發(fā)酵周期為3～6個月，傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬的發(fā)酵周期為6個月～5年。二級豆瓣醬發(fā)酵6個月以上，一級豆瓣醬發(fā)酵1年以上，特級豆瓣醬在3～5年。紅油郫縣豆瓣醬與傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬除了發(fā)酵周期不同以外，其形態(tài)、色澤以及生產(chǎn)方式也有很大區(qū)別。紅油郫縣豆瓣醬形態(tài)稀薄，呈半流動狀態(tài)，色澤紅亮油潤，生產(chǎn)過程中還添加植物油、香料和防腐劑。傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬的形態(tài)黏稠絨實，呈半固態(tài)，色澤為紅褐色，隨著發(fā)酵時間的延長顏色也會加深，在生產(chǎn)過程中不另外添加油脂和香料。氨基酸態(tài)氮是評價郫縣豆瓣醬質(zhì)量的重要指標之一。隨著發(fā)酵時間的增加，蛋白酶的持續(xù)分解作用使豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，豆瓣醬品質(zhì)也因氨基酸態(tài)氮含量增加而提升[2]。豆瓣醬在后熟過程中，水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基與還原糖的羰基發(fā)生美拉德反應(yīng)，賦予長時間發(fā)酵豆瓣醬獨特的風味與顏色[3]。

由于豆瓣醬要經(jīng)過長時間日曬夜露的發(fā)酵過程，發(fā)酵條件、原料選取及環(huán)境微生物的差異都對于豆瓣醬最終形成的風味具有重要影響，因此不同產(chǎn)地的豆瓣醬在風味組成上都具有獨特之處[2,4-5]。賈洪峰等[6]利用電子鼻對7個不同豆瓣樣品進行檢測，對獲得的數(shù)據(jù)進行主成分分析和統(tǒng)計質(zhì)量控制分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣和其他豆瓣樣品在氣味指紋上存在差異性，但對于造成風味差異的物質(zhì)并沒有進一步的研究，且樣本偏少。近年來基于礦物元素、化學組分和揮發(fā)性物質(zhì)的分析方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對大米[7-8]、茶葉[9-10]、食醋[11]、白酒[12]等食品產(chǎn)地溯源的研究中。因此，本研究利用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)結(jié)合GC-MS對郫縣和非郫縣產(chǎn)區(qū)的傳統(tǒng)豆瓣醬和紅油豆瓣醬樣品的揮發(fā)性組成進行檢測，構(gòu)建不同產(chǎn)地豆瓣醬的指紋圖譜。結(jié)合Fisher判別分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)研究不同產(chǎn)地的豆瓣醬在香氣組成方面的差異，以期能夠通過揮發(fā)性呈香物質(zhì)對不同豆瓣醬樣品進行產(chǎn)地溯源識別，為郫縣豆瓣醬的品質(zhì)鑒別和產(chǎn)品溯源提供一定的參考價值和借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豆瓣醬，無錫市場。具體樣品信息如表1所示。

表1 不同豆瓣醬樣品產(chǎn)地信息Table 1 Information on broad bean pastes investigated in this study

1.2 實驗儀器與設(shè)備

TSQ8000三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、TG-WAXMS A石英毛細管柱，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 揮發(fā)性組分檢測與鑒定

1.3.1 SPME法萃取過程

使用三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測豆瓣醬中的揮發(fā)性組分，準確稱取研磨后的豆瓣醬樣品5.00 g于15 mL樣品瓶中，添加10 μL規(guī)格為50 mg/L的2-辛醇作為內(nèi)標，加蓋密封待檢。置于60 ℃恒溫中預平衡15 min。將CAR/PDMS萃取頭插入頂部空間(離樣品高度20 mm)萃取30 min，完成后退回萃取頭，插入GC-MS進樣品口，解吸4 min。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為TG-WAXMS A石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度270 ℃。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持2 min后，以5 ℃/min升至230 ℃，230 ℃保持8 min。其中載氣(He)為恒流模式，流速1.2 mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

以EI為離子源，電子能量和溫度分別為70 eV和200 ℃；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)為45～400 amu；氣相色譜與質(zhì)譜連接口溫度為200 ℃，采用不分流模式。

1.3.4 揮發(fā)性化合物鑒定

檢出組分的譜圖與標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST 2014)比對，結(jié)合相同分析條件下正構(gòu)烷烴標準品的出峰情況計算出各個峰的相對保留指數(shù)(retention index，RI)，與文獻報道的保留指數(shù)進行對比綜合定性，當且僅當匹配度大于700(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果才予以報道；某些具有多環(huán)或復雜結(jié)構(gòu)的化合物，僅作試驗性的鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Xcalibur軟件對GC-MS的結(jié)果進行處理，根據(jù)峰面積歸一化法確定各化合物相對含量。采用SPSS Statistics 26.0對不同豆瓣醬樣品進行主成分分析和Fisher判別分析。采用SIMCA 14.0進行OPLS-DA。應(yīng)用Origin 2020軟件進行數(shù)據(jù)圖形化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品牌豆瓣醬中揮發(fā)性成分分析

為了探究以辣椒和蠶豆為原料的郫縣豆瓣醬和非郫縣豆瓣醬的區(qū)別，一共選取105種豆瓣醬樣品，包括郫縣地區(qū)的24種傳統(tǒng)豆瓣醬和30種紅油豆瓣醬，非郫縣地區(qū)的33種傳統(tǒng)豆瓣醬和18種紅油豆瓣醬。將所有豆瓣醬樣品的色譜峰面積歸一化后，以相對峰面積>0.1%為限定值挑選用于判別分析的風味化合物，篩選結(jié)果見表2，一共篩選到87種風味化合物，圖1為各樣本中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量歸一化后繪制的熱圖。

圖1 105種豆瓣醬樣品中的87種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量熱圖Fig.1 Heat map of relative content of 87 volatile substances in 105 kinds of broad bean paste samples

表2 105種豆瓣醬樣品中的87種揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Eighty-seven volatile compounds in 105 broad bean paste samples

酯類主要為山梨酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯等27種物質(zhì)。在豆瓣醬樣品中，酯類化合物的檢出種類是最多的。酯類即使在很低的濃度條件下也對食品的香味起著非常重要的作用。山梨酸乙酯的平均相對含量最高(5.02%)，這是因為豆瓣醬中添加了食品添加劑山梨酸鉀，造成山梨酸乙酯相對含量較高，但是山梨酸乙酯是一種被國際公認的低毒高效食品防腐劑，可以防止豆瓣醬腐敗變質(zhì)。月桂酸乙酯、十四酸乙酯和棕櫚酸乙酯的平均相對含量為1.19%～2.58%，分別為豆瓣醬貢獻花果香、椰子香和奶油香氣。這3種酯類物質(zhì)在郫縣產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)豆瓣醬中的平均相對含量明顯比非郫縣產(chǎn)區(qū)高，可能是郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬重要的標志性物質(zhì)。

醇類主要為乙醇、 β-苯乙醇、芳樟醇等18種物質(zhì)。醇類是酯化反應(yīng)的重要前體，也是構(gòu)成郫縣豆瓣特征風味的一類重要化合物，通常呈現(xiàn)出令人愉快的香味及甜味，比如β-苯乙醇具有花果香；芳樟醇具有甜嫩新鮮的花香，似鈴蘭香氣。乙醇是豆瓣醬中含量最高的醇類物質(zhì)，平均相對含量為21.46%，但在不同產(chǎn)地之間沒有明顯區(qū)別。β-苯乙醇在郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬之間有明顯差異，郫縣產(chǎn)區(qū)的傳統(tǒng)豆瓣醬和紅油豆瓣醬中β-苯乙醇平均相對含量分別為5.07%和0.92%。

醛類主要為苯乙醛、2-甲基丁醛等12種物質(zhì)。酮類主要為丙酮、香葉基丙酮等6種物質(zhì)。醛類和酮類都是羰基類化合物，它們均屬不穩(wěn)定的中間體化合物，易被還原成相應(yīng)的醇[13]。醛酮類物質(zhì)主要經(jīng)過脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，也可能是用于豆瓣發(fā)酵的微生物的生長代謝產(chǎn)物，主要以花果香貢獻于郫縣豆瓣的風味。醛酮類物質(zhì)在豆瓣醬中的含量比醇類和酯類低。苯乙醛是醛類物質(zhì)中平均相對含量最高的(1.33%)，郫縣產(chǎn)區(qū)紅油豆瓣醬苯乙醛的平均相對含量比非郫縣產(chǎn)區(qū)紅油豆瓣醬的高，但在不同產(chǎn)地的傳統(tǒng)豆瓣醬中的區(qū)別不大。酮類物質(zhì)的相對含量都較低，丙酮是酮類物質(zhì)中相對含量最高的物質(zhì)，其最大的相對含量僅為0.88%。郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬的香葉基丙酮的平均相對含量為0.19%，而非郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬的香葉基丙酮的平均相對含量僅為0.04%，香葉基丙酮有可能是郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬的標志性物質(zhì)。

酸類主要為山梨酸、苯甲酸等6種物質(zhì)。大多數(shù)豆瓣醬中會添加山梨酸鉀作為防腐劑使山梨酸的相對含量偏高(2.53%～47.98%)，其中傳統(tǒng)豆瓣醬的山梨酸含量相對較低，為2.53%～21.66%，紅油豆瓣醬的山梨酸含量相對較高，為19.86%～47.98%。苯甲酸的平均相對含量僅次于山梨酸，達到5.58%。郫縣產(chǎn)區(qū)的紅油豆瓣醬中苯甲酸的平均相對含量較高(9.42%)，其他豆瓣醬樣品中苯甲酸的相對含量比較相近。

4種酚類物質(zhì)中，4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基-苯酚的平均相對含量較高，分別為2.00%和1.17%。郫縣產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)豆瓣醬中這2種酚類物質(zhì)的平均相對含量達到4.36%和2.71%，明顯高于其他豆瓣醬。4-乙基-2-甲氧基苯酚具有典型的醬香和煙熏氣味，也被鑒定是醬油香氣的主要成分之一；4-乙基-苯酚具有木質(zhì)香、酚香和甜香，可以認為它們是賦予郫縣豆瓣特征風味的代表性化合物之一。多項研究表明這2種酚類物質(zhì)是郫縣豆瓣醬的主體揮發(fā)性成分[2,14-15]。

烯類為D-檸檬烯和α-姜烯等5種物質(zhì)。D-檸檬烯具有檸檬果香及新鮮橙子的香氣，同時具有消炎、預防和治療癌癥的作用[16]。D-檸檬烯主要存在于郫縣產(chǎn)區(qū)的紅油豆瓣醬和非郫縣產(chǎn)區(qū)的傳統(tǒng)豆瓣醬中，前者的最高相對含量達到13.92%，后者的最高相對含量達到8.15%。部分非郫縣產(chǎn)區(qū)的傳統(tǒng)豆瓣醬添加生姜作為輔料，α-姜烯是生姜中主要活性成分之一，具有鮮花的香氣特征，同時具有抗病毒、抗氧化的特性[17]。生姜的添加使α-姜烯的含量也較高，最高相對含量達到20.10%。

雜環(huán)類為2-乙?；量?、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪。2-乙?；量┑钠骄鄬孔罡?1.03%)，其余3種雜環(huán)類物質(zhì)最高的相對含量均在0.60%左右。豆瓣醬中鑒定的雜環(huán)類物質(zhì)主要是吡嗪類化合物。吡嗪類物質(zhì)一般具有烤香、堅果香，主要在后發(fā)酵過程中由Maillard反應(yīng)和Strecker降解產(chǎn)生的氨基酮經(jīng)縮合反應(yīng)生成[18]。羅靜等[19]發(fā)現(xiàn)2-乙酰基吡咯是郫縣豆瓣中相對含量最高的雜環(huán)類物質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。2-乙?；量┛赡苁嵌拱赆u所用辣椒原料中含有的[4,20]。除此之外，王雪梅等[4]在生產(chǎn)豆瓣醬的5種辣椒原料中還檢測到2,5-二甲基吡嗪，為郫縣豆瓣醬提供醬香味。

2.2 基于OPLS-DA方法的豆瓣醬產(chǎn)地區(qū)分模型

圖2為OPLS-DA模型得分散點圖。可以看出各個產(chǎn)區(qū)樣品群體內(nèi)有明顯的聚集趨勢，僅有2個非郫縣紅油樣本完全落在Hotelline’T2橢圓圖外，4種類型豆瓣醬樣品均較好的分離。

圖2 OPLS-DA 模型得分散點圖Fig.2 OPLS-DA scoring plot

載荷圖表示各指標與不同產(chǎn)區(qū)不同工藝的相關(guān)性大小，即圖中X變量與Y變量越靠近，其相關(guān)性越高。如圖3所示，異丁醛(C2)和2-乙基吡咯(C71)與FC的相關(guān)性較高；十四酸乙酯(C74)和月桂酸乙酯(C63)與PC的相關(guān)性較高；山梨酸乙酯(C40)與FH的相關(guān)性較高；甲醇(C6)與PH的相關(guān)性較高。

圖3 OPLS-DA模型載荷散點圖Fig.3 Loading plot of OPLS-DA model

變量權(quán)重系數(shù)(variable importance for the projection, VIP)值可以量化由OPLS-DA的每個變量對樣品分類的貢獻，VIP>1的變量被認為是貢獻較大的變量。如圖4所示，45個變量的VIP>1(圖4中前45種物質(zhì))，VIP值越大，變量對分類的貢獻度越高。其中變量對分類貢獻最高的5種物質(zhì)依次為月桂酸乙酯(C63)、十四酸乙酯(C74)、香葉基丙酮(C65)、9-十六烯酸乙酯(C82)和二氫獼猴桃內(nèi)酯(C83)。

圖4 VIP得分圖Fig.4 VIP scoring plot

運用統(tǒng)計推斷分析進一步驗證鑒別模型，圖5-a為OPLS-DA模型置換驗證圖。Q2代表累積交叉有效性，Q2值越大表示模型可預測度越高；R2代表累積方差值，R2值越大表示模型解釋能力越強。圖5-a中R2和Q2的截距分別為0.259和-0.326，位于左邊綠色的R2值和藍色的Q2值均低于最右邊的值，且Q2的回歸線截距為負值，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預測能力，可用于后續(xù)特征揮發(fā)性物質(zhì)的確定。利用建立的模型對驗證集樣品進行原產(chǎn)地判別，具體結(jié)果見圖5-b。驗證集中的98～103號樣本都實現(xiàn)了準確的預測(共8個樣品，75%預測準確)，其中僅104和105號樣品預測不準確(共8個樣品，25%預測不準確)，尤其是105號樣品偏差過大，可能是因為該豆瓣醬樣品具有明顯的重慶地理風味特征，與其他樣品差異過大，使結(jié)果無法準確預測，后續(xù)會通過其他判別方法進一步分析。

a-置換驗證圖；b-預測圖圖5 OPLS-DA 模型置換驗證圖和模型預測圖Fig.5 OPLS-DA permutation test and prediction

2.3 基于Fisher判別分析方法的豆瓣醬產(chǎn)地判別模型

Fisher判別分析能夠?qū)崿F(xiàn)最大的類間距離以及最小的類內(nèi)距離，使得樣本有最佳的可分離性。由于非郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬樣品來源于不同產(chǎn)地，為了解決非郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬樣品之間差異性過大的問題，本研究進一步建立基于Fisher判別函數(shù)的一般判別方法對豆瓣醬樣品進行多變量判別分析。

將OPLS-DA篩選出的對原產(chǎn)地判別有重要貢獻作用的45種揮發(fā)性物質(zhì)作為判別分析的自變量，對訓練集樣本進行逐步判別分析，結(jié)果顯示，乙醛(C1)、甲醇(C6)等15種揮發(fā)性物質(zhì)對豆瓣醬產(chǎn)地判別顯著的物質(zhì)被引入到判別模型中。不同產(chǎn)地和工藝豆瓣醬判別函數(shù)模型系數(shù)見表3，判別分類結(jié)果見表4。

表3 不同產(chǎn)地和工藝豆瓣醬判別函數(shù)模型系數(shù)Table 3 Discriminant function model coefficients of different broad bean pastes

表4 不同產(chǎn)地和工藝豆瓣醬的一般判別分析結(jié)果Table 4 General discriminant analysis of different broad bean pastes

提取模型前3個典型判別函數(shù)，Willks’ Lambda檢驗結(jié)果進一步證實，在α=0.05的顯著性水平下，3個函數(shù)對分類效果均為顯著，其中判別函數(shù)1、判別函數(shù)2和判別函數(shù)3累積解釋判別模型能力為100%，且典型相關(guān)系數(shù)分別為0.935、0.853和0.748，表明3個判別函數(shù)對豆瓣醬的產(chǎn)地和工藝分類具有重要作用。圖6為3個判別函數(shù)3的得分值散點圖。利用Fisher判別模型對所有訓練集樣品建立分類模型。在判別模型中FC的31個樣品均實現(xiàn)正確的判別；PC有1個樣本被誤判為PH；FH有2個樣本被誤判為PH；PH有1個樣本被誤判為FC。本研究建立的判別模型整體正確判別率為95.9%。為了進一步考查Fisher判別模型的有效性和正確性，用建立的模型對訓練集中8個未參加建模的樣品進行判別分析，判別結(jié)果見表5，其中8個樣品均實現(xiàn)正確判別，表明基于揮發(fā)性成分的指紋差異可以有效鑒別郫縣產(chǎn)區(qū)與非郫縣產(chǎn)區(qū)的豆瓣醬。

圖6 不同產(chǎn)區(qū)和工藝豆瓣醬前3個典型判別函數(shù)得分散點圖Fig.6 Scores of the first three typical discrimination functions of broad bean pastes

表5 Fisher判別分析預測結(jié)果Table 5 Prediction by Fisher model

3 結(jié)論與討論

本實驗利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對不同產(chǎn)地來源的豆瓣醬的揮發(fā)性成分進行檢測與分析，共檢測到87種香氣物質(zhì)?；贠PLS-DA建立的判別模型篩選出VIP>1的45種對郫縣豆瓣醬的產(chǎn)地判別具有較大貢獻的揮發(fā)性物質(zhì)(圖4中前45中化合物)。進一步基于篩選出來的45種揮發(fā)性物質(zhì)，利用Fisher判別分析構(gòu)建產(chǎn)地判別模型，確定15種郫縣豆瓣醬的有效溯源指標，其中包含6種酯類、3種醇類、2種酸類、2種酮類、1種醛類和1種酚類。酯類和酚類物質(zhì)與前人的研究具有一定的相似性。劉超蘭等[21]發(fā)現(xiàn)豆瓣醬陳釀8個月后十四烷酸、棕櫚酸和反式-4-葵烯酸等乙酯衍生物等主體酯香成倍增加。劉平等[22]采用氣相色譜-嗅覺測量法及香氣活性值法初步確定4-乙基-2-甲氧基苯酚、十六酸乙酯等7種香氣化合物為一級傳統(tǒng)郫縣豆瓣醬的特征香氣物質(zhì)。李治華等[15]發(fā)現(xiàn)4-乙基-2-甲氧基苯酚和水楊酸甲酯在不同發(fā)酵時間豆瓣醬之間具有明顯差異。這表明本文篩選出來的酯類和酚類物質(zhì)作為有效溯源指標具有一定的代表性。除此之外，香葉基丙酮、3-羥基丁酮等8種物質(zhì)也是郫縣豆瓣醬區(qū)別于其他豆瓣醬的重要成分。香葉基丙酮是具有木蘭香氣的風味物質(zhì)，略帶甜蜜的玫瑰香韻味，郫縣產(chǎn)區(qū)豆瓣醬中香葉基丙酮的含量高于非郫縣產(chǎn)區(qū)。3-羥基丁酮具有令人愉快的奶油香味，其僅在非郫縣產(chǎn)區(qū)的紅油豆瓣醬中平均相對含量較高(0.18%)。

Fisher判別分析方法構(gòu)建的判別模型的整體正確判別率為95.9%，對驗證集樣品實現(xiàn)了100%的正確判別。在Fisher判別模型中對非郫縣產(chǎn)區(qū)的紅油豆瓣醬的誤判率較高，可能是因為不同產(chǎn)地紅油豆瓣醬的原料相似度較高，紅油豆瓣醬樣本量較少也是影響判別模型準確率的因素之一。Fisher判別模型對驗證集的判別比OPLS-DA模型更準確，可能是因為在Fisher判別分析中進一步篩選了對原產(chǎn)地分類有重要貢獻作用的變量，從而排除了干擾原產(chǎn)地判別的變量，說明變量的選擇對判別分析的準確率影響較大?；贠PLS-DA和Fisher判別分析所構(gòu)建的模型對于郫縣豆瓣醬原產(chǎn)地識別有一定的預測能力，對郫縣豆瓣醬地理標志性產(chǎn)品及消費者合法權(quán)益的保護提供了一定的技術(shù)支撐。