馬 光，蘇長青，高小寬，呂亞慈，李會(huì)芬

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北衡水 053000）

葡萄白腐病是一種常見病害，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生。我國各葡萄產(chǎn)區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，而且近年來此病害發(fā)生更加普遍。葡萄白腐病早期癥狀表現(xiàn)為果實(shí)上的棕色圓形腐爛病變，隨著病情的發(fā)展，腐爛區(qū)逐漸擴(kuò)大，最后使果實(shí)完全腐爛失去商品價(jià)值。在潮濕的條件下，在病變上形成黑色子實(shí)體和白色分生孢子。葡萄白腐病是由半知菌亞門墊殼孢屬Petr. & Syd 引起的[1]。傳統(tǒng)的葡萄白腐病防治是在加強(qiáng)田間管理的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)藥劑防治。隨著環(huán)保觀念的深入人心，無公害生物農(nóng)藥在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用呈逐年上升趨勢(shì)。本文通過拮抗性篩選，獲得了一株對(duì)葡萄白腐病具有良好拮抗作用和防治效果的放線菌菌株K5，并通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA 的方法對(duì)其分類進(jìn)行了鑒定，為葡萄白腐病的生物防治提供了優(yōu)良的微生物種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 土壤放線菌的分離 錐形瓶中加入90 mL 無菌水和取自葡萄園的土壤10 g，120 r/min 振蕩25 min后室溫靜置10 min。取上清1 mL 加入無菌水9 mL。梯度稀釋分別制備成1/100，1/1000，1/10000，1/100000 不同濃度的稀釋液。取0.1 mL 不同濃度的稀釋液均勻涂布到固體高氏一號(hào)的培養(yǎng)基表面。28 ℃培養(yǎng)5 d 后挑取沒有染菌，單個(gè)形態(tài)不同菌落接種至試管斜面放入培養(yǎng)箱28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 拮抗放線菌的篩選 挑選試管里長勢(shì)良好、無污染、形態(tài)各異的菌種分別和實(shí)驗(yàn)室保存的葡萄白腐病菌種一起在PDA 培養(yǎng)基上相距2 cm 左右劃線，將培養(yǎng)皿放到恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)。5 d 后測(cè)量葡萄白腐病菌的直徑大小，計(jì)算抑菌率，具體計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[2]。

1.3 拮抗放線菌防治葡萄白腐病的離體果試驗(yàn) 選取成熟度和大小一致的巨峰葡萄果實(shí)，每處理選10 顆葡萄果實(shí)。處理1：噴發(fā)酵原液50 倍稀釋液，24 h 后再刺傷接種葡萄白腐病菌；處理2：刺傷接種白腐病菌24 h后再噴發(fā)酵原液50 倍稀釋液；對(duì)照：果實(shí)噴無菌水。28 ℃條件下保濕3 d 后調(diào)查病情指數(shù)，計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[3]。

1.4 拮抗放線菌株的鑒定 根據(jù)菌落特征和16S rDNA 鑒定。提取放線菌基因組總DNA，以總DNA為模板，采用通用引物27F 和1492R（序列分別為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增其16S rDNA。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min 一個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行在線Blastn比對(duì)，比對(duì)庫選擇16S rRNA，比對(duì)結(jié)果以系統(tǒng)發(fā)育樹的形式進(jìn)行展示，確定與所篩選菌株分支最近的物種以最終確定所篩選到的放線菌菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板對(duì)峙法篩選拮抗葡萄白腐病的放線菌 利用稀釋平板分離的方法獲得了9 株放線菌，分別編號(hào)為K1-K9，將其與葡萄白腐病病菌一起培養(yǎng)進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)。計(jì)算抑菌率表明K5 對(duì)葡萄白腐病菌有很強(qiáng)抑制作用，其抑菌率達(dá)到了62.56%，顯著高于其他8 株（圖1）。培養(yǎng)皿內(nèi)K5 產(chǎn)生了明顯的抑菌帶，在K5 附近葡萄白腐病菌菌絲不能生長。

圖1 放線菌拮抗葡萄白腐病的平板對(duì)峙培養(yǎng)抑菌率

2.2 拮抗放線菌對(duì)離體果葡萄白腐病的防治效果從表1 可以看出，處理1 葡萄果實(shí)的病情指數(shù)總體小于處理2，從相對(duì)防效來看，處理1 也好于處理2。從不同拮抗菌株來看，平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)葡萄白腐病菌抑制作用較強(qiáng)的防線菌株K5 相對(duì)防效最好，顯著好于其它8 株放線菌。

表1 放線菌防治離體果葡萄白腐病效果

2.3 拮抗放線菌菌株K5 的鑒定 對(duì)葡萄白腐病菌抑制作用最強(qiáng)的菌株K5 菌落特征為：菌落小而致密，菌絲致密微小。剛開始生長時(shí)，菌體呈較干而且不透明的狀態(tài)，顏色為單一的白色，邊緣整齊且表面光滑，黏著性強(qiáng)、用接種針很難挑起。而后，逐漸生長成為絨毛狀、表面起粉、色澤逐漸豐富。在培養(yǎng)基上可裂生大量分生孢子進(jìn)行散播、繁殖。初步判定為鏈霉菌。

以放線菌16s rDNA 通用引物和篩選得到的菌株K5 總DNA分別作為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。得到單一擴(kuò)增條帶，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 16s rRNA 數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹表明K5 與淡紫灰鏈霉菌聚為一支（圖2）。結(jié)合菌株K5 的形態(tài)學(xué)鑒定將菌株K5 鑒定為鏈霉菌，可確定篩選到的拮抗放線菌菌株K5 為淡紫灰鏈霉菌。

圖2 K5 菌株16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

篩選對(duì)葡萄白腐病具有顯著拮抗作用的菌株，研制生物農(nóng)藥也越來越受到重視。拮抗菌株的篩選以及生物農(nóng)藥在葡萄上的應(yīng)用已經(jīng)多有報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌、放線菌[4]等對(duì)葡萄霜霉病病菌有拮抗作用。在對(duì)葡萄灰霉病的研究中發(fā)現(xiàn)假絲酵母菌（對(duì)紅提葡萄灰霉病具有明顯的抑制作用[5]。在葡萄白腐病的拮抗菌株篩選研究中也發(fā)現(xiàn)了幾種有較強(qiáng)抑菌作用的菌株[6-7]，但數(shù)量還相對(duì)較少。本研究通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA分類對(duì)葡萄園土壤中分離到的1 株對(duì)葡萄白腐病菌具有較好抑菌效果的菌株進(jìn)行了鑒定，確定其為淡紫灰鏈霉菌，豐富了葡萄白腐病生物防治的微生物菌種資源。為使該菌株能夠真正在葡萄生產(chǎn)中得到應(yīng)用，應(yīng)繼續(xù)對(duì)其抑菌機(jī)理、發(fā)酵條件以及生物藥劑配方進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。