呂 靜，劉文波，劉 暢，任同偉，陳 櫻，歐陽康，黃偉堅，韋祖樟

(廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病，俗稱“豬藍耳病”。該病可導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎、返情等繁殖系統(tǒng)障礙、仔豬高死亡率、各年齡段豬只不同程度的呼吸道癥狀及食欲減退、并能引起免疫抑制和持續(xù)感染[1-3]，給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。我國于1995年開始暴發(fā)此病，郭寶清等[4]首次從流產(chǎn)胎兒中分離到美洲型PRRSV，并命名為CH-1a。2006年我國多地暴發(fā)高致病性PRRS，由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起，感染了超過200萬頭豬，死亡病例約40萬頭，發(fā)病率和死亡率較經(jīng)典型PRRS均明顯升高[5-6]。2013年起，與NADC30毒株高度同源的毒株不斷被分離并報道，其nsp2區(qū)域存在不連續(xù)缺失了131個氨基酸[7]，統(tǒng)稱這類毒株為NADC30-like毒株。我國現(xiàn)在流行的毒株主要為美洲型，其中主要優(yōu)勢流行毒株為譜系8毒株(HP-PRRSV-like)、譜系1毒株(NADC30-like)和譜系3毒株(QYYZ-like)。

PRRSV不論在體內(nèi)還是體外均表現(xiàn)出嚴(yán)格的細胞嗜性。在體內(nèi)，PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細胞(PAMs)；在體外，PRRSV只在原代PAMs和MA104以及衍生細胞系MARC-145中繁殖[8]。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV通過結(jié)合細胞受體進入易感細胞，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細胞受體主要有：唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)、硫酸乙酰肝素(heparin sulphate,HS)、波形蛋白(vimentin)、CD163分子、CD151分子及非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA分子[9]。CD163分子是大小約130 kDa的糖蛋白，富含半胱氨酸，其主要介導(dǎo)PRRSV在細胞質(zhì)中的脫衣殼和病毒基因組的釋放[10-11]，并且已經(jīng)確定CD163分子的病毒結(jié)合區(qū)為清道夫受體半胖氨酸富含結(jié)構(gòu)域(SRCR)5-9[12]?，F(xiàn)已成功建立的穩(wěn)定表達pCD163的細胞系有：HEK-293-pCD163細胞系[13]、PAM-CD163細胞系[9]、CHO-K1-CD163細胞[14]、MARC-145-CD163細胞系[15]、PK-15-CD163細胞系[16]、BHK-21-CD163細胞系[17]等。已有報道通過普通單質(zhì)粒載體方法構(gòu)建出MARC-145-CD163細胞系。本研究通過慢病毒病毒載體的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達pCD163受體的MARC-145細胞系，該方法宿主細胞廣泛，轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高,該細胞系可用于高效、快速地增殖PRRSV毒株，為PRRSV的分離和相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞和病毒慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry購自生物風(fēng)生物科技有限公司；VSVG質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒、MARC-145細胞、293T細胞、PAMs細胞、PRRSV毒株(GXNN1396、GXNN202004a、GXGG202007)均由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室保存；DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ購自NEB公司；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、TaKaRa LA Taq?、dNTP Mixture、T4DNA連接酶購自寶生物工程有限公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、HP Total RNA Kit購自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine 2000、fluorescein goat anti-mouse IgG(H+L)購自Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)基MEM、新生胎牛血清(FBS)、DMEM粉劑、0.05%Trypsin-EDTA、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司；Mouse anti-porcine CD163購自Bio-Rad公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL Western blot Kit購自康為世紀(jì)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank公布的pCD163基因序列(登錄號：HM991330)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對擴增pCD163受體基因序列的特異性引物，并在引物的上、下游分別引入酶切位點XbaⅠ和BamHⅠ。引物序列如下：pCD163-F:5′-CGATCTAGAATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3′,pCD163-R：5′-CGAGGATTCT-CATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG-3′，下劃線為內(nèi)切酶識別位點，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 總RNA的提取及pCD163基因的擴增使用HP Total RNA Kit試劑盒提取PAMs總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：10× LA Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，pCD163-F 2 μL，pCD163-R 2 μL，TaKaRa LA Taq 1 μL，ddH2O 35 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，63℃退火45 s，72℃延伸3 min 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后切膠純化回收。

1.5 重組質(zhì)粒pLVX- pCD163-IRES-mCherry的構(gòu)建及鑒定pCD163膠回收產(chǎn)物及慢病毒表達載體pLVX-IRES-mCherry分別使用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化回收，經(jīng)T4DNA連接酶16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐抗性的LA平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，次日抽提質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送華大基因測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pLVX-pCD163-IRES-mCherry。

1.6 重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry轉(zhuǎn)染293T細胞將293T細胞傳代于6孔板培養(yǎng)，待細胞密度達到80%～90%時，按照Lipofectamine 2000說明書，將重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry:psPAX2∶VSVG=5 μg∶3.5 μg∶1.25 μg 的比例共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染后48 h觀察細胞及熒光表達情況，收集上清慢病毒感染液后添加2 mL新鮮10% FBS DMEM培養(yǎng)基；72 h再次收取細胞上清液，3 000×g離心10 min，-80℃保存。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞篩選將MRAC-145細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細胞密度達到80%～90%時，使用48 h慢病毒感染液感染MARC-145細胞，37℃孵育4～6 h，間隔1 h搖板1次，棄去感染液，加入新鮮的2% FBS DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時設(shè)置未感染的MARC-145細胞為陰性對照。感染96 h后，加入嘌呤霉素進行篩選，嘌呤霉素質(zhì)量濃度為16 mg/L。每天觀察細胞狀態(tài)，3 d左右更換1次含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，待陰性對照細胞全部死亡后，終止篩選。將藥物篩選后存活的細胞消化為單個細胞，進行細胞計數(shù)，使用終點稀釋法稀釋細胞，接種于96孔板，使每個孔細胞數(shù)為0～1個，培養(yǎng)10～14 d。待96孔板中細胞長滿后，在熒光顯微鏡下觀察，選取具有紅色熒光的單克隆細胞株移至12孔板中培養(yǎng)，待細胞長滿后對孔中部分細胞進行鑒定。

1.8 RT-PCR檢測MARC-pCD163細胞系中CD163表達使用0.25%胰酶消化篩選到的MARC-pCD163細胞系，取部分細胞裂解，其余細胞繼續(xù)培養(yǎng)。裂解后的細胞使用HP Total RNA Kit試劑盒抽提細胞總RNA，同時設(shè)置MARC-145細胞為陰性對照。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴增CD163受體序列，PCR反應(yīng)體系及條件按照1.4方法進行。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.9 間接免疫熒光(IFA)檢測MARC-pCD163細胞系中pCD163表達將RT-PCR鑒定陽性的細胞株繼續(xù)傳代至12代接種于6孔細胞培養(yǎng)板。待細胞密度達100%時，PBS洗滌3次，冰甲醇4℃固定30 min；加入1% BSA常溫封閉30 min，PBS洗滌3次；加入1∶300倍稀釋后的小鼠抗pCD163單克隆抗體，37℃孵育2 h后，PBS洗滌5次，每次5 min；加入1∶500稀釋的Alexa Fluor 568標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌5次，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。設(shè)置MARC-145細胞作為陰性對照。

1.10 Western blot檢測MARC-pCD163細胞系中CD163表達情況分別將MARC-pCD163細胞及MARC-145細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入配置好的RAPI裂解液(RAPI∶PMSF=100∶1)于冰上裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液加入5×loading buffer，于沸水中煮10 min。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE后，按照Bio-Rad公司半干轉(zhuǎn)儀操作說明進行電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中常溫封閉2 h，加入1∶300稀釋的小鼠抗pCD163單克隆抗體，4℃過夜孵育；TBST洗膜5次，每次5 min；加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜5次,用ECL Western blot Kit試劑盒顯色后觀察結(jié)果。

1.11 MARC-pCD163細胞對不同PRRSV毒株增殖能力的測定將MARC-pCD163細胞與MARC-145細胞同時感染0.1 MOI的不同譜系PRRSV毒株GXNN1396(lineage 8)、GXNN202004a (lineage 1)、GXGG202007 (lineage 3)，分別于感染后24，48，72，96，120 h收取300 μL細胞上清。將收獲的病毒液進行10倍梯度稀釋，取10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-77個稀釋梯度，每個稀釋度設(shè)置8個重復(fù)，同時設(shè)置未接毒組作為對照，每天觀察細胞病變(CPE)情況，按照Reed-Muench法計算每個時間點待測病毒TCID50值，繪制病毒增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry的構(gòu)建和包裝以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板PCR擴增獲得pCD163基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見約3 348 bp的目的條帶(圖1A)。將pCD163基因克隆至pLVX-IRES-mCherry中，重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切得到預(yù)期大小的片段(圖1B)，測序結(jié)果表明pLVX-pCD163-IRES-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES- mCherry與包裝輔助質(zhì)粒psPAX2、VSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，48，72 h均可觀察到紅色熒光，表明慢病毒包裝成功。

A.pCD163基因PCR擴增片段(M.DL5000 DNA Marker；1.pCD163基因PCR擴增產(chǎn)物)；B.重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(M.DL10000 DNA Marker；1,2.pLVX-pCD163-IRES-mCherry質(zhì)粒XbaⅠ/BamHⅠ酶切產(chǎn)物)

2.2 細胞系的篩選與鑒定慢病毒感染MARC-145細胞后，經(jīng)過嘌呤霉素篩選，存活細胞經(jīng)終點稀釋法接種于96孔細胞培養(yǎng)板，10～14 d可見明顯細胞克隆團。將顯微鏡下觀察有紅色熒光的細胞株擴大培養(yǎng)，抽提細胞總RNA，RT-PCR擴增pCD163基因，可見在3 348 bp處有相符目的條帶(圖2)。將RT-PCR鑒定正確的細胞傳至12代，IFA可以觀察到MARC-pCD163細胞呈特異性的綠色熒光，而MARC-145細胞無綠色熒光(圖3)。收取細胞總蛋白，Western blot試驗檢測到MARC- pCD163細胞在130 kDa左右處有目的條帶，而MARC-145細胞未檢測到條帶(圖4)。上述結(jié)果表明成功篩選出穩(wěn)定表達豬CD163受體蛋白的MARC-145細胞系。

M.DL5000 DNA Marker；1～6.細胞系的RT-PCR產(chǎn)物；7.MARC-145細胞的RT-PCR產(chǎn)物；8.陰性對照

A..MARC-pCD163細胞；B.MARC-145細胞

1.MARC-pCD163細胞系；2.MARC-145細胞

2.3 MARC-pCD163細胞對不同PRRSV毒株增殖能力的測定將MARC-pCD163細胞與MARC-145細胞同時感染0.1 MOI的3個不同譜系的PRRSV毒株，測定不同時間點的TCID50，繪制3株毒株的生長曲線，結(jié)果見圖5。3株毒株在MARC-pCD163細胞與MARC-145細胞上最高滴度相近，但在MARC-145細胞上最高滴度出現(xiàn)的時間為96 h，MARC-pCD163細胞上最高滴度出現(xiàn)的時間為48 h，結(jié)果表明MARC-pCD163細胞能顯著加快病毒最高滴度出現(xiàn)的時間。

圖5 PRRSV在MARC-pCD163和MARC-145細胞中的增殖圖

3 討論

pCD163分子已被鑒定為兩種基因型PRRSV的細胞受體[18]。GORP等[19]用Sn和pCD163抗體同時孵育PAM細胞，能阻斷PRRSV感染PAM細胞，但單獨的pCD163抗體不能阻斷PRRSV感染細胞，表明Sn與pCD163具有協(xié)同作用，但pCD163分子不介導(dǎo)PRRSV內(nèi)化。DELRUE等[20]研究表明單獨表達Sn的細胞能夠吸附并內(nèi)吞PRRSV，但PRRSV不能脫衣殼，但同時表達Sn和pCD163分子的細胞則能產(chǎn)生子代PRRSV，表明pCD163分子參與病毒的脫衣殼過程。流式細胞試驗表明，PRRSV感染性與pCD163表達量之間存在直接正向關(guān)系[21]，且試驗證明PRRSV非敏感細胞(BHK-21、LLC-PK1、PK-15等)中過表達pCD163，能使非敏感細胞被PRRSV感染并能產(chǎn)生高滴度的子代病毒[8]。目前，常用MA104以及衍生細胞系MARC-145進行PRRSV毒株分離。然而，有些PRRSV毒株，特別是近年流行的NADC30-like毒株，在傳代細胞系中復(fù)制能力弱，產(chǎn)生滴度低，難以獲得在細胞系中穩(wěn)定傳代的病毒。而這些毒株在PAM中有較好的復(fù)制能力。為此，本試驗設(shè)計特異性引物擴增pCD163基因序列，從PAM細胞中經(jīng)RT-PCR擴增得到pCD163基因，構(gòu)建了穩(wěn)定表達pCD163的MARC-145細胞系。盡管不同譜系的PRRSV毒株在MARC-pCD163和MARC-145均能產(chǎn)生同樣高的病毒量，但PRRSV毒株在MARC-pCD163細胞中最高病毒滴度出現(xiàn)的時間早于48 h，為以后PRRSV毒株的分離培養(yǎng)和受體功能奠定了基礎(chǔ)。

目前，構(gòu)建基因過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的載體主要有普通單質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體等[9]。慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，對處于分裂期和非分裂期的細胞均具有感染能力，能夠感染多種類型的細胞，且能攜帶大片段的外源基因在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下高效地整合至目的細胞染色體中[22]。目前所應(yīng)用的慢病毒屬于復(fù)制缺陷型病毒，具有良好的生物安全性，是一種理想的用于建立穩(wěn)定細胞系的基因轉(zhuǎn)移載體。常用的慢病毒表達系統(tǒng)為第1代的3質(zhì)粒表達系統(tǒng)和第2、3代的4質(zhì)粒表達系統(tǒng)，其中第2、3代的4質(zhì)粒表達系統(tǒng)生物安全性更好。293T細胞是由293細胞通過基因技術(shù)衍生出的細胞系，具有生長速度快、易轉(zhuǎn)染、蛋白表達水平高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于病毒包裝，但293T細胞貼壁性不強，在培養(yǎng)293T細胞及使用293T包裝慢病毒時需要特別注意。本試驗選用慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry，載體本身帶有嘌呤霉素抗性基因和紅色熒光蛋白標(biāo)記基因，可以通過在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，從而更加直觀地觀察監(jiān)測慢病毒包裝、慢病毒感染目的細胞及使用嘌呤霉素篩選細胞的情況。本試驗通過慢病毒表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達豬pCD163受體蛋白的MARC-145細胞系，PRRSV在MARC-pCD163細胞中的增殖速度及病毒滴度均有所提高，為今后的PRRSV分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性及PRRSV細胞受體的研究奠定基礎(chǔ)。