常 凱， 王艷艷， 那琬琳， 劉晨霞， 葉雨笙， 江忠勇， 劉 媛

1 中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 成都 610083；2 四川省疾病預(yù)防控制中心 微生物檢驗(yàn)所， 成都 610041；3 成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院， 成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 成都 611730；4 成都市第七人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 成都醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院， 成都 610041

目前經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療乙型肝炎的藥物主要包括核苷酸類似物及IFNα兩大類[1]。核酸類似物可減少HBV復(fù)制，但對共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的影響很小，具有需要長期服藥、停藥后易反彈、患者依從性不佳等問題[2]。干擾素雖在一小部分受者中可能導(dǎo)致功能性治愈(HBsAg丟失)，但副作用較大且抑制病毒復(fù)制作用有限[3-4]。

中藥黃芪為豆科多年生草本植物膜夾黃芪和蒙古黃芪的干燥根[5]。黃芪的主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖、氨基酸以及微量元素等[6]。其臨床常用于治療肺心病、充血性心力衰竭、病毒性心肌炎、腎臟病和糖尿病等[7-8]。近年國內(nèi)外對黃芪甲苷的研究越來越多[9]，主要具有調(diào)節(jié)免疫、缺血保護(hù)、抗炎、抗病毒等作用，對HBV、人腺病毒等多種病毒具有抑制作用[10]。黃芪甲苷作為黃芪皂苷的重要一員，在已有的臨床和基礎(chǔ)研究中都表現(xiàn)出保護(hù)肝臟細(xì)胞和抗HBV活性，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，黃芪對HBsAg及HBeAg的分泌有較好的抑制作用[11]；黃芪注射液聯(lián)合或單獨(dú)使用，抗病毒和免疫調(diào)節(jié)療效均呈劑量依賴性，在聯(lián)合恩替卡韋使用中具有很好的抗HBV感染作用，不僅可以很好的抑制HBV復(fù)制，而且可以在停藥后延緩HBV反彈，其機(jī)制包括JAK-STAT通路和細(xì)胞因子的調(diào)控[12]。在抗HBV作用中黃芪最主要的單體活性成分是黃芪甲苷，然而其具體的護(hù)肝基礎(chǔ)和抗病毒機(jī)制仍不明確[13]。

線粒體翻譯起始因子2(mitochondrial translation initiation factor 2，MTIF2)和核糖體蛋白L10(ribosomal protein L10，RPL10)作為調(diào)控線粒體翻譯步驟的明星分子，在諸多的病毒宿主翻譯機(jī)制中扮演重要作用。MTIF2為翻譯起始因子IF-2，多存在與線粒體和細(xì)胞質(zhì)，是經(jīng)典翻譯因子GTPase家族中IF-2亞家族成員[14]。MTIF2是蛋白質(zhì)合成起始的基本成分之一，能夠保護(hù)甲硫酰-tRNA不被自發(fā)水解，并促進(jìn)其結(jié)合到30S核糖體亞基[15]。同時(shí)也參與GTP在70S核糖體復(fù)合物的水解[16]。在宿主精子細(xì)胞中的研究[17]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干擾翻譯起始因子時(shí)，HBV和X基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低。RPL10為核糖體大亞基的組成單元，然而在核糖體構(gòu)成中并非所有的核糖體蛋白成員均需參加[18]。在已有研究中，包括HIV在內(nèi)的多種病毒復(fù)制的翻譯調(diào)控均與RPL10有關(guān)，本課題組前期對臨床高HBV和無HBV攜帶的肝癌組織樣本進(jìn)行TMT全蛋白組學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn),RPL10與HBV復(fù)制關(guān)系密切，且干擾其表達(dá)后能明顯抑制HBV復(fù)制，因此推斷宿主RPL10可能是特異性參與病毒翻譯的核糖體蛋白。

基于以上研究，本研究擬用黃芪甲苷刺激人正常肝細(xì)胞L-02和攜帶HBV的Hep3B細(xì)胞，探討其生物活性和抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞L-02，人肝癌細(xì)胞系 Hep3B(含HBV基因組)，購于成都諾和生物科技有限公司。

1.1.2 藥物及試劑 黃芪甲苷(美國Sigma-Aldrich)；胎牛血清(紐西蘭 Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基、PBS、青霉素鏈霉素雙抗(美國Gbico 公司)； Cell Counting Kit(CCK-8)(日本同仁)；細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購于上海碧云天；總RNA提取試劑盒、HBV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。TransScript Green Two-Step qRT -PCR SuperMix 試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；HBsAg診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)、HBeAg診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購于北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。肝細(xì)胞外泌相關(guān)蛋白生化檢測試劑盒購于北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常肝細(xì)胞L-02分別接種于6孔板和96孔板中，接種濃度為每孔1×104cell/mL，待18 h細(xì)胞貼壁后，分別加入含不同濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)基(0、5、10和20 μg/mL，設(shè)復(fù)孔)培養(yǎng)24 h；將人肝癌細(xì)胞Hep3B置于T25培養(yǎng)瓶，細(xì)胞濃度為1×105/mL，分別添加黃芪甲苷濃度為0、5、10和20 μg/mL的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h。按實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測要求分別收獲培養(yǎng)細(xì)胞和上清液備用。所用培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基，含1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清；培養(yǎng)條件為CO2濃度5%，溫度37 ℃和濕度36%。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 L-02細(xì)胞96 孔板培養(yǎng)24 h后吸出上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再加入90 μL培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。各濃度黃芪甲苷對L-02細(xì)胞的抑制率=(對照組OD值-用藥組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)[19]。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和死亡 將人正常肝細(xì)胞L-02 6孔板培養(yǎng)24 h 后處理消化和洗滌細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫，避光，輕輕混勻避光10 min；加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入PBS適量，輕輕混勻后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；用 70%的冰乙醇固定 24 h，PI 染色后流式細(xì)胞儀檢測[20]。判斷壞死細(xì)胞為(FITC+/PI+)；而凋亡細(xì)胞為(FITC+/PI-)。

1.2.4 生物化學(xué)法檢測L-02細(xì)胞外泌蛋白 將人正常肝細(xì)胞L-02 6孔板培養(yǎng)24 h 后分別收集培養(yǎng)液，1500 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行AFP、AST、ALT和ALP的外泌蛋白檢測。將各組待檢培養(yǎng)液置于Beckman Coulter AU5800生化儀進(jìn)行檢測，分析各蛋白外泌水平。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫資料集GSE65359、GSE84044和GSE58208，獲得乙型肝炎患者的RNA測序數(shù)據(jù)原始計(jì)數(shù)和相應(yīng)的臨床信息。使用R套裝軟件ConsensusClusterPlus (v1.54.0)進(jìn)行一致性分析，分析最佳聚類個(gè)數(shù)。重復(fù)100次抽取總樣本的80%，clusterAlg =“hc”, innerLinkage=‘ward.D2’。聚類熱圖均由R 套裝軟件pheatmap (v1.0.12)分析，基因表達(dá)熱圖保留方差在0.1以上的基因。通過R套裝軟件 survival 和 survminer進(jìn)行實(shí)現(xiàn)，以上所有分析方法均由R v4.0.3實(shí)現(xiàn)。

應(yīng)用HCCDB數(shù)據(jù)庫分別分析RPL10和MTIF2的生存曲線，應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫分析RPL10和MTIF2聯(lián)合生存曲線。

1.2.6 HBV標(biāo)志物檢測 Hep3B在不同黃芪甲苷濃度作用下培養(yǎng)24 h后，收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測上清液中的HBsAg和HBeAg水平；熒光定量PCR(qPCR)法檢測上清液中HBV DNA水平。

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT -PCR)法基因檢測

Hep3B在不同黃芪甲苷濃度作用下培養(yǎng)24 h后，分別收集上清液和細(xì)胞，并分別提取RNA，檢測上清液中HBV RNA水平；檢測細(xì)胞中MTIF2和RPL10基因轉(zhuǎn)錄水平。所用引物見表1，由InvitrogenTM合成。采用2-△△ct法計(jì)算基因相對表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物列表

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對細(xì)胞生長的影響 根據(jù)黃芪甲苷濃度的不同，分為0、5、10和20 μg/mL 4組。黃芪甲苷濃度20 μg/mL組處理24 h和48 h相較未處理組細(xì)胞生長活性均顯著提高(P值均<0.05)，黃芪甲苷濃度20 μg/mL組處理72 h相較10 μg/mL組生長活性提高(P<0.05)，黃芪甲苷濃度5 μg/mL組處理72 h相較未處理組生長活性提高(P<0.05)(表2)。4組內(nèi)各時(shí)間段間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

表2 黃芪甲苷對人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞生長活性的影響

2.2 黃芪甲苷對細(xì)胞死亡和凋亡的影響 在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理L-02細(xì)胞24 h后，4組間細(xì)胞死亡率、凋亡率及死亡率+凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 黃芪甲苷對L-02細(xì)胞凋亡的影響

2.3 黃芪甲苷對人正常肝細(xì)胞L-02外泌成分的影響

在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理L-02細(xì)胞24 h后，L-02細(xì)胞外泌AFP、ALT、AST和ALP水平變化各有不同(表4，圖1)。5、10和20 μg/mL 3個(gè)處理組AFP、AST水平均較未處理組顯著增高(P值均<0.05)。10和20 μg/mL 2個(gè)處理組ALT水平分別均較未處理和5 μg/mL兩組顯著降低(P值均<0.05)；20 μg/mL組ALT水平較10 μg/mL組顯著降低(P<0.05)。

表4 不同濃度的黃芪甲苷處理對L-02外泌蛋白的影響

2.4 黃芪甲苷對HBV的影響

2.4.1 黃芪甲苷參與HBV復(fù)制機(jī)制的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用基因功能分析軟件GeneMANIA分析黃芪甲苷調(diào)控基因RPL10和MTIF2參與的生物學(xué)功能[21]。結(jié)果表明,RPL10和MTIF2基因在生物學(xué)功能上高度連鎖，主要參與3項(xiàng)重要生物功能：翻譯起始(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR=2.01×10-12),病毒基因表達(dá)(FDR=1.12×10-10),核糖體亞基(FDR=1.47×10-11)。表明黃芪甲苷所調(diào)節(jié)的基因主要是通過核糖體翻譯起始調(diào)控影響HBV復(fù)制(圖2a)。

基于上述研究及前人的基礎(chǔ)[22]，構(gòu)建了黃芪甲苷參與HBV復(fù)制的可能作用機(jī)制(圖2b)。即專一性寄生于肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA提供pgRNA在內(nèi)的所有病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄模板，pgRNA和mRNA可借助宿主細(xì)胞翻譯出多種用于病毒包裝的蛋白，在胞質(zhì)中組裝形成核衣殼復(fù)合體用于形成新的病毒中間體。在該過程中，黃芪甲苷可調(diào)控RPL10和MRIF2分別參與核糖體大亞基的組成和翻譯起始。影響中間體裝配成成熟的病毒Dane顆粒釋放入血或重新補(bǔ)充核內(nèi)的cccDNA。

注：與0 μg/mL組比較，＊ P<0.05；與5 μg/mL組比較，# P<0.05。

注：a,RPL10&MTIF2蛋白互作分析圖；b,黃芪甲苷參與HBV復(fù)制的分子機(jī)制示意圖。

2.4.2 RPL10 & MTIF2調(diào)控HBV復(fù)制的生物信息學(xué)分析 調(diào)取TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中HBV相關(guān)資料集GSE65359、GSE84044和GSE58208，對RPL10 & MTIF2調(diào)控HBV復(fù)制的相關(guān)基因(RPL10、RPS13、RPL28、RPL29、RPL24、RPL3、RPL10L、MTIF2、EIF4A3、MAGOH、MRPL16、RSL24D1、LRPPRC)進(jìn)行富集分析。使用R套裝軟件Consensus Cluster Plus (v1.54.0) 進(jìn)行一致性分析，聚類個(gè)數(shù)為4時(shí)，表現(xiàn)出理想的聚類效果(圖3a)。聚類熱圖均由R套裝軟件pheatmap (v1.0.12)分析，表明在功能上明顯分為兩類，且在基因表達(dá)水平的趨勢一致(圖3b)。

調(diào)取肝癌數(shù)據(jù)庫中HBV感染的肝癌患者資料351例，分析RPL10的表達(dá)差異對患者預(yù)后的影響：發(fā)現(xiàn)較低表達(dá)RPL10患者，RPL10表達(dá)水平高的患者預(yù)后較差(圖3c)。在對MTIF2的表達(dá)差異對患者預(yù)后的分析中，調(diào)取肝癌數(shù)據(jù)庫資料212例：發(fā)現(xiàn)較低表達(dá)MTIF2患者，MTIF2表達(dá)水平高的患者預(yù)后較差(圖3d)。

分析145例TCGA資料集中HBV感染的肝癌患者資料(圖3e)，RPL10 和 MTIF2同時(shí)高表達(dá)的患者預(yù)后較差(P=0.039 2，95%CI:0.362～0.975。在不同樣本風(fēng)險(xiǎn)分值對應(yīng)的生存時(shí)間和生存狀態(tài)散點(diǎn)圖分布中可以看出，RPL10 和 MTIF2的表達(dá)水平越高，死亡病例數(shù)越高(圖3f)。而在無HBV感染的肝癌患者中，不存在上述現(xiàn)象，因此說明：RPL10 和 MTIF2主要是通過影響HBV發(fā)揮其效力。

注：a, 一致性聚類結(jié)果熱圖；b,相關(guān)基因表達(dá)聚類熱圖；c,RPL10基因生存曲線分析；d,MTIF2基因生存曲線分析；e,RPL10和MTIF2基因聯(lián)合生存曲線分析；f,不同樣本Risk score對應(yīng)的生存時(shí)間和生存狀態(tài)散點(diǎn)分布圖。

2.4.3 黃芪甲苷對pgRNA、病毒抗原、RPL10、MTIF2表達(dá)的影響 在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理Hep3B細(xì)胞24 h后，Hep3B細(xì)胞HBV DNA和pgRNA水平變化各有不同(表5、圖4)。 3個(gè)處理組HBV DNA、pgRNA、HBsAg、HBeAg、RPL10和MTIF2水平與未處理組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

注：與0 μg/mL組比較，＊P<0.05。

表5 黃芪甲苷對HBV復(fù)制裝配中相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

3 討論

為了快速的在宿主體內(nèi)進(jìn)行增殖和復(fù)制，HBV通過激活宿主細(xì)胞多種信號通路搶奪mRNA翻譯資源[23]。同時(shí)，該搶奪過程又會(huì)受到各種約束，如翻譯系統(tǒng)不兼容，翻譯起始、延伸和終止受阻等等。因此明確HBV掠奪翻譯系統(tǒng)的方式方法，阻斷病毒對宿主信號通路的激活調(diào)控是阻斷HBV復(fù)制的重要策略之一[24]。本研究首先對黃芪甲苷處理正常肝細(xì)胞所產(chǎn)生的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖，損傷較小。又進(jìn)一步應(yīng)用黃芪甲苷處理HBV細(xì)胞模型Hep3B，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠有效抑制MTIF2和RPL10的表達(dá)，一方面通過抑制翻譯起始減少病毒組裝所需蛋白的翻譯；另一方面減少特異性核糖體大亞基的組裝，降低用于合成病毒所需蛋白的核糖體形成，進(jìn)而影響HBV復(fù)制。

黃芪甲苷處理正常肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，20 μg/mL黃芪甲苷在72 h內(nèi)能促進(jìn)L-02細(xì)胞生長，5、10和20 μg/mL黃芪甲苷處理24 h能促進(jìn)L-02細(xì)胞AFP和AST分泌，降低ALT水平，但對細(xì)胞凋亡和ALP分泌影響較小。表現(xiàn)出促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖的作用。這與胡雅夢等[25]的80 μg/ml以下黃芪甲苷對L-02細(xì)胞增殖無影響的報(bào)道不一致，但該報(bào)道也說明黃芪甲苷能夠提高輻射損傷后L-02細(xì)胞的增殖能力,抑制輻射所致的胞內(nèi)ROS和MDA含量升高。劉麗等[26]在急性肝損傷小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠有效降低血清ALT和AST的含量，具有促進(jìn)肝細(xì)胞生長保護(hù)肝臟的功效。與本研究結(jié)果基本一致，部分結(jié)果的差異可能由于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟町悓?dǎo)致。但總體的結(jié)論都證明黃芪甲苷具有促進(jìn)肝細(xì)胞生長和保護(hù)肝臟的功效，表明其對正常肝細(xì)胞的刺激和損傷作用較小，具有良好的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。

應(yīng)用生物信息學(xué)調(diào)取數(shù)據(jù)庫大樣本臨床資料分析發(fā)現(xiàn)：RPL10 和 MTIF2主要是作用HBV發(fā)揮其效力影響肝癌患者預(yù)后，且RPL10 和 MTIF2的表達(dá)水平越高，死亡病例數(shù)越高，預(yù)后越差。由于該研究僅基于HBV所致的肝癌數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)得出，因此對于單純感染HBV的非腫瘤患者預(yù)后情況有待進(jìn)一步研究。

乙型肝炎與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，HBV DNA隨機(jī)整合頻率增加能夠引起遺傳紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖[27]。而HBV的復(fù)制廣泛依賴于宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)[28]。本研究表明5～20 μg/mL黃芪甲苷在Hep3B細(xì)胞中能有效降低HBV DNA和pgRNA的相對表達(dá)水平，抑制HBsAg和HBeAg合成，抑制宿主RPL10和MTIF2基因mRNA表達(dá)。同時(shí)生物信息學(xué)分析表明關(guān)鍵基因RPL10 和 MTIF2的表達(dá)水平越高，死亡病例數(shù)越高，預(yù)后越差，提示高水平RPL10和MTIF2提示預(yù)后差的原因可能與HBV復(fù)制調(diào)控相關(guān)。

縱觀整個(gè)抗病毒領(lǐng)域，HBV、HIV和呼吸道病毒是新藥研發(fā)的主戰(zhàn)場，雖然臨床藥物種類繁多，但是有效率仍然不容樂觀。在近兩年多發(fā)的大型公共衛(wèi)生事件下更凸顯出這一短板，因而闡明傳統(tǒng)中草藥對病毒基因宿主內(nèi)翻譯調(diào)控機(jī)制的作用，在未來開發(fā)或改進(jìn)抗病毒藥物以及在新發(fā)病原體的應(yīng)對中具有重要意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：常凱、王艷艷負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；常凱、王艷艷、那琬琳、劉晨霞、葉雨笙、江忠勇參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施與修改論文；常凱、劉媛負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。