賴昕彤 王柯嵐 由雨欣 譚俊杰

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 江蘇省植物基因編輯工程研究中心，南京 210095）

基因編輯是一種新興的能對(duì)特定基因組進(jìn)行插入、刪除、替換等各種修飾的基因工程技術(shù)。CRISPR/Cas系統(tǒng)［1］，跟傳統(tǒng)基因編輯工具如鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）［2］和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）［3］等相比，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)下基因組編輯主導(dǎo)技術(shù)，推動(dòng)了各行各業(yè)的發(fā)展。

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌進(jìn)化出來(lái)的用來(lái)抵御噬菌體及外源DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)［4］。目前使用最廣泛且技術(shù)開發(fā)最成熟的是來(lái)源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）并經(jīng)過(guò)改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要包括單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）及Cas9兩 個(gè) 元 件。CRISPR/Cas9完成基因編輯主要分為兩步（圖1）：（1）Cas9核酸酶在sgRNA的引導(dǎo)下利用其包含的兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC和HNH分別對(duì)靶向DNA的兩條鏈在距離PAM（protospacer adjacent motif）上游大約3 bp處進(jìn)行剪斷，引起DNA雙鏈斷裂（doublestrand break，DSB）；（2）DSB內(nèi)源修復(fù)。其修復(fù)途徑主要包括非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）［5］和同源重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR）［6］。前者介導(dǎo)的DSB修復(fù)簡(jiǎn)單、高效，是大部分細(xì)胞修復(fù)DSB的最主要方式，但其出錯(cuò)率高，往往引發(fā)難以預(yù)測(cè)的核苷酸插入或刪除（insertions and deletions，indels），導(dǎo)致靶基因功能喪失；HDR方式保真度高，但是依賴于外部提供的修復(fù)模板，且在大部分細(xì)胞中效率極低。因此，雖然CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯簡(jiǎn)單高效，但因其對(duì)DSB的高度依賴，缺乏對(duì)編輯結(jié)果的控制，可能導(dǎo)致被編輯后的細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)法預(yù)測(cè)的紊亂［7-8］。實(shí)現(xiàn)高效且不依賴DSB的精準(zhǔn)編輯將是未來(lái)基因編輯的發(fā)展趨勢(shì)。

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯Fig. 1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing

1 堿基編輯系統(tǒng)簡(jiǎn)介

點(diǎn)突變是自然界中最常見(jiàn)的基因突變類型。根據(jù)人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)ClinVar分析，超過(guò)半數(shù)的人類遺傳疾病是由點(diǎn)突變引起［9］。在作物遺傳育種上，點(diǎn)突變也是許多重要農(nóng)藝性狀遺傳變異的基礎(chǔ)。將高效、精準(zhǔn)的核苷酸替換應(yīng)用于基因治療，可以從根本上治愈點(diǎn)突變引起的人類遺傳疾?。粦?yīng)用于作物育種，可以簡(jiǎn)化并加快育種進(jìn)程，可見(jiàn)開發(fā)高效精準(zhǔn)的堿基替換工具十分重要。

2016年，哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊(duì)在原有CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上首次開發(fā)了實(shí)現(xiàn)單堿基替換的新系統(tǒng)-堿基編輯器（base editor，BE）［10］。其將無(wú)催化活性的Cas9（catalytically inactive Cas9，dCas9）或者Cas9切口酶（Cas9 nickase，nCas9）與胞嘧啶脫氨酶APOBEC1以及尿嘧啶糖基化酶抑制劑 （uracil glycosylase inhibitor，UGI）進(jìn)行融合，通過(guò)sgRNA將融合蛋白帶至靶位點(diǎn)，從而在不引入DSB的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)堿基的精準(zhǔn)替換（圖 2）。跟原有CRISPR/Cas9相比，堿基編輯器既不引入DSB，也無(wú)需提供外源修復(fù)模板即可進(jìn)行高效精準(zhǔn)的基因編輯。該工具的開發(fā)使CRISPR/Cas系統(tǒng)從切割特異DNA的分子“剪刀”變成可以重寫堿基的“修正器”，打開了精準(zhǔn)基因編輯的大門。

由于基于胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）只能催化C到T的轉(zhuǎn)變，為了擴(kuò)展編輯類型，該團(tuán)隊(duì)隨后嘗試將自然界中的各種腺嘌呤脫氨酶與nCas9融合，基于CBE類似工作原理，腺嘌呤脫氨酶可以將腺嘌呤（A）轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤（I），其在DNA復(fù)制中常被識(shí)別為鳥嘌呤（G），因此，I與胸腺嘧啶（T）產(chǎn)生I∶T錯(cuò)配后，通過(guò)DNA修復(fù)途徑或細(xì)胞復(fù)制，完成A到G的轉(zhuǎn)變（圖 2）?？紤]到自然界中腺嘌呤脫氨酶只能以RNA為底物，該團(tuán)隊(duì)隨后將大腸桿菌中tRNA腺嘌呤脫氨酶（tRNAspecific adenosine deaminase，TadA）與Cas9切口酶 融合，并進(jìn)行多輪人工進(jìn)化，最終獲得了編輯效率最高的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）ABE7.10［11］（圖 2）。

圖2 CBE和ABE介導(dǎo)的堿基編輯Fig. 2 CBE and ABE-mediated base editing

CBE和ABE能實(shí)現(xiàn)全部單堿基轉(zhuǎn)換（base transition），但不能有效實(shí)現(xiàn)單堿基之間的顛換（base conversion）。隨后研究人員也在積極探索除CBE和ABE之外的可以實(shí)現(xiàn)其他類別的堿基編輯技術(shù)。2020年，張學(xué)禮和J. Keith Joung兩團(tuán)隊(duì)首次獨(dú)立報(bào)道了能實(shí)現(xiàn)堿基顛換的新型堿基編輯器 GBEs（glycosylase base editors） 和CGBE1（C-to-G base editors）［12-13］。其工作原理和CBE很接近，都是首先將胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，不同的是，GBE接下來(lái)直接用融合在nCas9另一端的尿嘧啶 DNA 糖基化酶（uracil DNA N-glycosylase，UNG）將U移除，并引發(fā)堿基切除修復(fù)，提供C堿基向其他堿基突變的機(jī)會(huì)，在大腸桿菌中主要是C→A，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要是C→G［12］。為了在大多數(shù)位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)高效、高純度的C→G堿基編輯，David R. Liu團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPRi篩選、靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析并聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)開發(fā)了更加有應(yīng)用前景的新型CGBE［14］。

這些DNA堿基編輯工具目前已成功應(yīng)用于動(dòng)物［15-17］、植物［18-20］和微生物［21］，在點(diǎn)突變引起的人類疾病治療和作物精準(zhǔn)育種上有巨大的應(yīng)用 潛能［22］。

2 堿基編輯系統(tǒng)優(yōu)化

2.1 提高編輯效率

第一版堿基編輯器（BE1）通過(guò)將大鼠的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1簡(jiǎn)單地融合到dCas9的氨基端，并用一段16 aa的XTEN蛋白基序連接。雖然APOBEC1可以催化C到U的轉(zhuǎn)變，但由于細(xì)胞內(nèi)存在尿嘧啶糖基化酶UNG，會(huì)不斷去除脫氨后產(chǎn)生的U，從而導(dǎo)致C→T轉(zhuǎn)換效率低下。針對(duì)此問(wèn)題，第二版堿基編輯器（BE2）通過(guò)融入尿嘧啶糖基化酶抑制劑UGI，從而保護(hù)U不被移除，使在人體內(nèi)的編輯效率提高了3倍。第三版堿基編輯器（BE3）主要是用Cas9切口酶替代dCas9，通過(guò)在非編輯鏈引入切口，從而激活堿基錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）機(jī)制，并以編輯鏈為模板進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)了編輯產(chǎn)物的形成，該策略將編輯效率提高了2-6倍，平均編輯效率達(dá)到37%，同時(shí)indel的產(chǎn)生比例僅有約1.1%［10］。第四版堿基編輯器BE4主要是通過(guò)融入更多的UGI，最大程度的減少了編輯副產(chǎn)物，提高了C→T突變的效率［23］。此外，通過(guò)在編輯器兩端融入密碼子優(yōu)化的雙分型核定位信號(hào)（bipartite NLS，bpNLS），產(chǎn)生了編輯效率最大化的BE4max以及ABEmax［24］。在腺嘌呤堿基編輯器ABE7.10的基礎(chǔ)上，研究人員利用腺苷脫氨酶變體庫(kù)對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，獲得效率更高的ABE8版本，與ABE7.10相比，其在A5-A7處的編輯效率提高了約1.5倍，A3-A4和A8-A10處約3.2倍，非NGG PAM變體的總體目標(biāo)編輯效率提高約4.2倍［25］。David R. Liu團(tuán)隊(duì)對(duì)ABE7.10進(jìn)行多輪定向進(jìn)化，獲得了ABE8e，與ABE7.10相比，該版本在TadA上引入了8個(gè)額外突變，活性更是提高了590倍，且能與各種Cas9 或Cas12同源蛋白廣泛兼容［26］，ABE8e的晶體結(jié)構(gòu)解析表明，其催化 DNA 脫氨的速度比早期的ABEs快約1 100 倍［27］。除了哺乳動(dòng)物，ABE8e在編輯其它物種上同樣具有超高的編輯效率，比如多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)幾乎同時(shí)報(bào)道ABE8e在編輯水稻基因組上比原來(lái)ABEmax表現(xiàn)出更高的編輯效率，在諸多靶位點(diǎn)的編輯效率更是達(dá)到了幾乎100%［28-29］。此外，周煥斌團(tuán)隊(duì)通過(guò)比較分析ABE8.17、ABE8.20以及ABE8e，開發(fā)了全新版本ABE9，其編輯水稻基因組的能力甚至高于ABE8e，尤其是對(duì)于原來(lái)難以編輯的位點(diǎn)，ABE9表現(xiàn)出更佳的編輯能力［28］。

其它的效率優(yōu)化策略還包括在脫氨酶與Cas蛋白之間插入非特異的單鏈DNA結(jié)合蛋白基序，增強(qiáng)脫氨酶與底物的互作［30］。這些策略極大提高了堿基編輯器在哺乳動(dòng)物以及植物細(xì)胞中的編輯效率，推動(dòng)了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

2.2 改變編輯窗口寬度

Cas9-sgRNA復(fù)合體與目標(biāo)DNA鏈結(jié)合后，隨后與互補(bǔ)的DNA序列退火形成“R-loop” 結(jié)構(gòu)［31］，其中暴露的單鏈DNA即為脫氨酶的底物。堿基編輯器在單鏈DNA上具有一定靶向范圍，該范圍內(nèi)的堿基均能被脫氨酶有效脫氨，該編輯范圍稱為堿基編輯器的編輯窗口或活性窗口［10］。由于融合蛋白與目標(biāo)DNA序列結(jié)合后掩蓋了PAM相鄰的核苷酸，因此BE的活性窗口通常位于PAM的遠(yuǎn)端［10，32-33］。例如，BE3的活性窗口為遠(yuǎn)離PAM端的第4-8位堿基（C4-C8）。

編輯窗口的寬度受多種因素的影響，包括脫氨酶與Cas蛋白的類型、堿基編輯器的空間構(gòu)造 等［10-11，15，33-35］。表1 總結(jié)了目前主要的堿基編輯器及其編輯窗口寬度、序列偏向等特征。

表1 主要堿基編輯器及其特征Table 1 Major base editors and their characteristics

靶向堿基的編輯依賴于脫氨酶和底物之間的互作，因此不同種類的脫氨酶會(huì)影響活性窗口寬度［34］。例如，通過(guò)把BE3中的APOBEC1替換為源于海鰻（Petromyzon marinus）的脫氨酶CDA1，構(gòu)建出新的堿基編輯器CDA1-BE3，其編輯窗口變?yōu)镃1-C7。研究學(xué)者利用不同種類的胞嘧啶脫氨酶構(gòu)建了多樣化的堿基編輯編輯器，主要包括哺乳動(dòng)物APOBEC家 族 蛋 白，如AID［36-37］、APOBEC1和APOBEC3（A3A-H）［38-42］，以及七鰓鰻CDA1家族蛋白，如CDA1［33-35，43-45］。另外，改變脫氨酶的催化或結(jié)合活性也會(huì)影響編輯窗口的寬度。例如，通過(guò)突變r(jià)APOBEC1中與底物結(jié)合或催化相關(guān)的氨基酸殘基，產(chǎn)生一系列BE3變體YE1/YE2/YEE-BE3，大大縮小了堿基編輯窗口寬度［46］。在APOBEC3A中引入點(diǎn)突變N57G，產(chǎn)生工程化的eA3A-BE3，增強(qiáng)了對(duì)TCR基序的偏好性，間接縮短了編輯窗口寬度［38］。將F148A突變引入人工進(jìn)化的TadA*，所組成的ABE7.10F148A也大大縮小了編輯窗口［47］。此外，通過(guò)同時(shí)融合多個(gè)相同或不同的脫氨酶，使R-loop中底物核苷酸在局部高濃度脫氨酶的環(huán)境中更易暴露，從而達(dá)到拓寬編輯窗口的目的［48］，還可使編輯產(chǎn)物多樣化或提高編輯效率［49-52］。大多數(shù)脫氨酶對(duì)其底物DNA的序列表現(xiàn)出一定的偏好，這也間接影響著編輯窗口的寬度。例如，APOBEC1對(duì)底物序列的偏好 性 為TC≥CC≥AC＞GC［10］，而APOBEC3G偏好CC基序中的第2個(gè)C［41-42］。目前，包含CDA1、AID或A3A脫氨酶的堿基編輯器對(duì)底物DNA序列的依賴性較小，可能是因?yàn)檫@些脫氨酶的活性相對(duì)較高［33，37-40，53］。

自然界天然存在或人工進(jìn)化的Cas變體可以識(shí)別不同的PAM基序，且其組成的堿基編輯器可能擁有不同的編輯窗口。例如SaCas9介導(dǎo)的堿基編輯器支持更寬的編輯窗口：其介導(dǎo)的CBE編輯窗口為C3-C12，ABE編輯窗口為A4-A12［46］；基于Cfp1/Cas12a的堿基編輯窗口為C8-C13［54］；由微型Cas12f變體（CasMINI）衍生的ABE具有A3-A4的窄窗口［55］；而由環(huán)狀排列的Cas9變體（Cas9-CP）組成的CBE和ABE改變了脫氨酶在R-loop中的定位，從而在更寬的編輯窗口中實(shí)現(xiàn)了更有效的靶向堿基［56-57］。

堿基編輯器內(nèi)部構(gòu)象也會(huì)影響編輯窗口寬度，包括脫氨酶與Cas蛋白的融合位點(diǎn)、連接兩者的接頭類型和長(zhǎng)度等。例如，將PmCDA1分別融合到Cas9切口酶的兩端，形成n/cCDA1-BE3，兩者呈現(xiàn)出不同的編輯窗口（nCDA1-BE3，C1-C7；cCDA1-BE3，C2-C5）［34］。對(duì)于nCas9介導(dǎo)的堿基編輯器，將脫氨酶融合在N端通常會(huì)比融合在C端產(chǎn)生更寬的編輯窗口［10，34，44］，這可能是由于N端融合會(huì)使脫氨酶更易接近R-loop內(nèi)的ssDNA。除在兩端融合之外，最近還報(bào)道了脫氨酶可以嵌入Cas9中，所產(chǎn)生的一系列堿基編輯器擁有獨(dú)特的活性窗口，其寬度取決于它們?cè)贑as9中的插入位點(diǎn)［58-59］。此外，堿基編輯器中Cas9和脫氨酶的連接長(zhǎng)度也會(huì)影響編輯窗口寬度。例如，適當(dāng)縮短Cas9與CDA1之間的連接長(zhǎng)度，甚至去掉脫氨酶C端不必要的序列，可以很大程度的縮小編輯窗口寬度至1-2 nt［34］。

總之，堿基編輯窗口的多樣化可以滿足堿基編輯器不同的應(yīng)用需求，從而推動(dòng)其進(jìn)一步的發(fā)展和應(yīng)用。

2.3 拓展編輯范圍

堿基編輯需要靶位點(diǎn)包含PAM，比如基于SpCas9的堿基編輯器識(shí)別的PAM序列為NGG，這種特定的PAM要求限制了可編輯的區(qū)域，嚴(yán)重阻礙了其廣泛應(yīng)用。為了擴(kuò)大堿基編輯的范圍，常采用的方式是利用識(shí)別不同PAM的天然Cas蛋白或人工改造的Cas9變體。比如，陳佳團(tuán)隊(duì)使用Cas12a （Cpf1）開發(fā)了新型的CBE系統(tǒng)，識(shí)別的PAM 序列為TTTV（V可以是A、C或G），這一系統(tǒng)適用于富含T的基因組DNA［54］。David R. Liu團(tuán)隊(duì)利用來(lái)自金葡菌（Staphylococcus aureus）的Cas9蛋白，構(gòu)建了靶向包含NNGRRT的PAM序列的堿基編輯器SaBE3［46］。此外，通過(guò)Cas變體的替換，獲得了各種PAM松弛型的堿基編輯變體，如VQRBE3（NGA）、VRER-BE3（NGCG）、SaBE3-KKH（NNNRRT）［46］。尤其是利用Nureki實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的SpCas9-NG（NGN）［60］以及Kleinstiver實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的SpG（NGN）和SpRY（NRN 或NYN）［61］等Cas9變體所獲得的堿基編輯器，幾乎能夠突破PAM的限制，靶向所有NNN的位點(diǎn)。值得注意的是，盡管這些變體的利用拓展了堿基編輯器的編輯范圍，但卻大大降低了其編輯效率，也增加了對(duì)靶位點(diǎn)的依賴性。因此，如何在維持松弛型PAM的識(shí)別下進(jìn)一步提高堿基編輯器的效率值得進(jìn)一步的研究。此外，這些PAM松弛型的堿基編輯變體的應(yīng)用具有一定的自編輯活性，尤其是基于SpRY的CBE和ABE，其能夠識(shí)別sgRNA骨架上與靶序列相連的GTT PAM 序列，因此會(huì)對(duì)自身的sgRNA進(jìn)行編輯，從而一方面降低其編輯效率，另一方面改變的sgRNA可能會(huì)產(chǎn)生非靶向編輯，導(dǎo)致脫靶效應(yīng)［62-64］。如何減少自編輯活性仍是基因編輯領(lǐng)域目前亟待解決的難題之一。

2.4 提高編輯特異性和精準(zhǔn)度

在細(xì)胞中應(yīng)用堿基編輯器時(shí)，會(huì)出現(xiàn)DNA及RNA水平上的脫靶。其中DNA水平上的脫靶分為sgRNA依賴型和非sgRNA依賴型。前者是由于sgRNA錯(cuò)誤地引導(dǎo)了Cas蛋白，使之與相似的DNA序列相結(jié)合［65-67］。研究表明，使用工程化的高保真Cas變體［68-71］或截短的sgRNA［72-73］，或遞送堿基編輯器與sgRNA形成的核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoproteins，RNPs）［74］等策略均可以降低此類脫靶效應(yīng)；而后者是由于脫氨酶的過(guò)度表達(dá)，使全基因組特別是基因富集區(qū)域發(fā)生了隨機(jī)點(diǎn)突變。值得注意的是，這類脫靶只出現(xiàn)在CBEs中，在ABEs中并未發(fā)生，其原因可能是ABE中的脫氨酶來(lái)源于RNA特異性編輯的腺嘌呤脫氨酶，經(jīng)人工進(jìn)化改造后表現(xiàn)出了較高的特異性，從而未表現(xiàn)出過(guò)度的DNA堿基編輯［75-76］。大量研究表明，通過(guò)工程化改造脫氨酶可以減少這類脫靶現(xiàn)象。例如，利用人工改造的rAPOBEC1變體YE1建立YE1-BE3堿基編輯系統(tǒng)，可以大大減少非sgRNA依賴型的脫靶［77-78］。通過(guò)篩選153種胞嘧啶脫氨酶，并進(jìn)一步優(yōu)化其靶標(biāo)位點(diǎn)和非靶標(biāo)位點(diǎn)的編輯，研究人員發(fā)現(xiàn)其中4種脫氨酶變體（AmAPOBEC1，PpAPOBEC1，RrA3F，SsAPOBEC3B）顯示出最小的非sgRNA依賴型的DNA脫靶活性［79］。另有研究表明，將脫氨酶精準(zhǔn)嵌入Cas蛋白結(jié)構(gòu)中，也可以減少全基因組范圍的DNA和RNA脫靶［58-59］。擁有較窄編輯窗口的堿基編輯器一般伴隨著較少的脫靶現(xiàn)象，因?yàn)檫@種情況下，無(wú)論是目標(biāo)還是非目標(biāo)區(qū)域能編輯的堿基都變少了，從而導(dǎo)致脫靶也變少或消失［35，77］。

除了DNA脫靶，由于CBE和ABE所使用的均是能作用于RNA的脫氨酶，因此兩者還會(huì)出現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)的RNA脫靶［47，80-82］。盡管RNA脫靶突變存在的時(shí)間很短，但是如果持續(xù)誘導(dǎo)，仍存在很高的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在遺傳疾病治療上。與非sgRNA依賴的DNA脫靶類似，目前消除此類RNA脫靶效應(yīng)的策略是在CBE和ABE中設(shè)計(jì)合適的脫氨酶變體。例如，通過(guò)工程化改造脫氨酶，獲得了3個(gè)高 保 真 的CBE變 體（BE3W90Y/R126E，A3AR128A-BE3，A3AY130F-BE3）和一個(gè)ABE變體（ABE7.10F148A），它們不僅可以高效地靶向目標(biāo)DNA，還能有效減少RNA的脫靶編輯［47］。另有研究人員通過(guò)篩選一系列BE3和ABE變體，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)BE3變體（rAPOBEC1；R33A，R33A/K34A）和 兩 個(gè)ABE變 體（TadA*；K20A/R21A，V82G）具有較低的RNA編輯活性［80-81］。而且，他們還發(fā)現(xiàn)含有eA3A（eA3A-BE3）、hAID（hAID-BE3）和CDA1（target-AID）的CBE可以減少RNA脫靶。此外，通過(guò)V106W的替換或R153的缺失突變，獲得了工程化改造的TadA*變體，該變體構(gòu)成的ABE大大減少了RNA脫靶［82-83］。

除了在DNA和RNA水平上發(fā)生非預(yù)期的脫氨，當(dāng)編輯窗口內(nèi)含有多個(gè)非目標(biāo)堿基C時(shí)，目標(biāo)堿基C被編輯的同時(shí)也伴隨著非目標(biāo)堿基C的編輯，從而產(chǎn)生大量的編輯副產(chǎn)物，給堿基編輯尤其是基因治療上的應(yīng)用帶來(lái)了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在植物堿基編輯方面，盡管發(fā)生旁側(cè)編輯的植株可以在后期中篩掉，但大量的編輯副產(chǎn)物不僅會(huì)使后續(xù)的篩選工作更加繁瑣，還導(dǎo)致了對(duì)前期轉(zhuǎn)化編輯效率的過(guò)度依賴。因此，縮小堿基編輯器的編輯窗口，提高其編輯精度，變得尤為重要。大量相關(guān)研究表明，縮小堿基編輯窗口的策略主要有以下3種：（1）通過(guò)突變堿基編輯器的脫氨酶，適當(dāng)降低其催化和結(jié)合活性。比如，通過(guò)突變脫氨酶APOBEC1催化及結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基W90Y、R126E或R132E，開發(fā)一系列縮小堿基編輯窗口的BE3變體YE1/YE2/YEE-BE3［46］。雖然這3個(gè)變體的編輯窗口均有縮小，但其編輯效率也隨之降低，尤其是編輯窗口最窄的YEE-BE3，在許多位點(diǎn)缺乏編輯活性。（2）通過(guò)突變脫氨酶，增強(qiáng)其對(duì)底物的偏好性。比如，通過(guò)在人類APOBEC3A引入N57G突變，構(gòu)建工程化的堿基編輯器eA3A-BE3，實(shí)現(xiàn)選擇性的識(shí)別TCR底物基序［38］。相似的，通過(guò)工程化產(chǎn)生的eA3G-BE3，增強(qiáng)對(duì)CC底物基序識(shí)別的偏好性［41-42］。該方法雖然在包含特定基序的編輯位點(diǎn)上使編輯窗口變窄，但縮小程度有限且極大依賴于底物序列。（3）調(diào)整堿基編輯器的內(nèi)部空間構(gòu)造。比如，通過(guò)降低脫氨酶與Cas9之間的接頭長(zhǎng)度，改變堿基編輯器的空間構(gòu)造，從而讓脫氨酶的活性區(qū)域在靶向DNA上維持于一個(gè)更加精準(zhǔn)的定位［34-35］。而且該策略不改變氨基酸的催化及結(jié)合活性，只是讓脫氨酶在非靶堿基處“英雄無(wú)用武之地”。盡管該方法目前只測(cè)試了少數(shù)脫氨酶及其構(gòu)成的堿基編輯器，但由于該策略產(chǎn)生的堿基編輯器在大大縮短編輯窗口的同時(shí)并未降低目標(biāo)堿基的催化活性，因此值得進(jìn)一步的研究和發(fā)展。

3 堿基編輯應(yīng)用

3.1 堿基編輯用于疾病治療

根據(jù)人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)ClinVar分析，超過(guò)半數(shù)的人類遺傳疾病是由點(diǎn)突變引起［9］。而堿基編輯器能夠高效實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的替換，因此其主要的潛在應(yīng)用之一是用來(lái)糾正點(diǎn)突變引起的人類遺傳疾病。例如，把BE3轉(zhuǎn)入小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，可以將與阿爾茨海默病相關(guān)的等位基因APOE4轉(zhuǎn)變?yōu)榈惋L(fēng)險(xiǎn)的APOE3r，也可以糾正乳腺癌細(xì)胞中與癌癥相關(guān)的p53基因突變（Y163C）［10］。利用ABE將與鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）相關(guān)的致病基因型HBBS轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞中的良性等位基因型HBBG，并成功將鐮狀細(xì)胞病小鼠的血液學(xué)參數(shù)恢復(fù)到接近正常水平［84］。利用脂質(zhì)納米顆粒將ABE遞送到食蟹猴肝臟細(xì)胞中，并對(duì)PCSK9基因?qū)崿F(xiàn)堿基突變，將其體內(nèi)的壞膽固醇含量降低約60%［85］。其他應(yīng)用堿基編輯治療的疾病包括Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥［86］、白化病［86］、Hutchinson-Gilford早衰綜合征［87］和其他代謝疾?。?8-89］。

3.2 堿基編輯用于作物遺傳改良

與傳統(tǒng)育種相比，堿基編輯器能夠快速高效地對(duì)植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，加速了作物育種進(jìn)程。近年來(lái)，許多植物研究者通過(guò)密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了適用于植物的堿基編輯系統(tǒng)，由此實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻、小麥等主要農(nóng)作物的重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因定點(diǎn)突變，快速獲得改良品種。例如，Zong等［90］構(gòu)建了植物BE系統(tǒng)PBE（Plant base editor），并在原生質(zhì)體和再生的水稻、小麥和玉米植株中，實(shí)現(xiàn)了C3-C9位點(diǎn)的堿基編輯，效率高達(dá)43.48%。隨后他們又通過(guò)融合nCas9和人類APOBEC3A構(gòu)建了A3A-PBE，并成功在小麥、水稻和馬鈴薯中產(chǎn)生高效C→T的靶向突變。A3A-PBE實(shí)現(xiàn)了在17 nt的編輯窗口內(nèi)對(duì)內(nèi)源基因組位點(diǎn)和不同序列的高效堿基替換［40］。此外，Hua等［91］利用人工進(jìn)化的SpCas9和SaCas9變體，并構(gòu)建了相應(yīng)BE變體，在水稻中大大擴(kuò)展了編輯范圍。ABE和CBE在改變作物株型、提高作物抗性和養(yǎng)分吸收效率方面均發(fā)揮重要作用。Lu等［92］利用大鼠APOBEC1基因開發(fā)了水稻堿基編輯系統(tǒng)，并有效編輯了水稻的兩個(gè)重要基因NRT1.1B和SLR1，編輯效率分別為3.7%和13.3%。SLR1編碼DELLA蛋白，其TVHYNP基序及其附近的氨基酸發(fā)生置換，導(dǎo)致植株高度降低，獲得了半矮稈型材料。Li等［93］將nCas9、胞苷脫氨酶和UGI進(jìn)行融 合，在水稻中產(chǎn)生目標(biāo)點(diǎn)突變，成功在OsPDS（編碼一種植物烯去飽和酶），OsSBEIIb（編碼水稻淀粉分支酶IIb）的3個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)上引入了精準(zhǔn)編輯。

值得注意的是，BE 在人類和作物上的應(yīng)用有所不同，作物基因編輯上強(qiáng)調(diào)特異性外，也強(qiáng)調(diào)多樣化，產(chǎn)生更多的變異。該特征通常用于植物內(nèi)源基因定向進(jìn)化，通過(guò)對(duì)靶基因區(qū)域進(jìn)行堿基編輯，產(chǎn)生大量和多樣化的突變，隨后進(jìn)行人工篩選獲得提高農(nóng)藝性狀的目標(biāo)變異。最顯著的例子是植物抗除草劑位點(diǎn)的發(fā)掘，例如通過(guò)合用CBE和ABE，以及針對(duì)靶基因的sgRNA文庫(kù)，在水稻中對(duì)除草劑內(nèi)源靶標(biāo)基因OsALS1進(jìn)行近乎飽和突變，從而成功鑒定出OsALS1抗除草劑新位點(diǎn)，并創(chuàng)制出具有除草劑抗性的水稻新種質(zhì)［94］。高彩霞團(tuán)隊(duì)通過(guò)同時(shí)融合兩種不同類型脫氨酶設(shè)計(jì)了雙堿基編輯器STEMEs，并利用STEME-1和STEME-NG對(duì)水稻OsACC基因進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得了抗除草劑的水稻新種質(zhì)［50］。為了提高定向進(jìn)化效率，未來(lái)堿基編輯器需要擁有更寬的活性窗口、更大的編輯范圍和更多堿基轉(zhuǎn)換類型，從而為后續(xù)的人工篩選產(chǎn)生更加多樣化的編輯產(chǎn)物。

3.3 CBE引入終止密碼子實(shí)現(xiàn)基因敲除

CBE可以通過(guò)C→T單堿基轉(zhuǎn)換，將4種密碼子（正義鏈上的CAA、CAG、CGA和反義鏈上的TGG）轉(zhuǎn)換為終止密碼子（TGA、TAG、TAA），實(shí)現(xiàn)在不引入DSB的情況下，在目標(biāo)位點(diǎn)處提前引入終止密碼子來(lái)敲除蛋白質(zhì)編碼基因。Jin Soo Kim團(tuán)隊(duì)率先利用BE3在小鼠胚胎中實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶基因Dmd或Tyr的高效終止密碼子引入，并成功在小鼠中建立了肌營(yíng)養(yǎng)不良以及白化病的相關(guān)疾病模型［86］。此外，利用BE3引入無(wú)義突變的原理，Adli團(tuán)隊(duì)以及Ciccia團(tuán)隊(duì)分別建立了使基因失活的CRISPRStop［95］和iSTOP［96］系統(tǒng)，后者同時(shí)在包括人類、小鼠和擬南芥等8個(gè)物種建立了sgRNA文庫(kù)用于配合BE3使用，可在全基因組范圍內(nèi)失活真核基因，并模擬癌癥相關(guān)的無(wú)義突變。

與CRISPR介導(dǎo)的移碼突變相比，基于CBE終止密碼子引入方法的最大優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需產(chǎn)生DSB。作為最嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，DSB會(huì)激活廣泛的細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制或者細(xì)胞應(yīng)激甚至死亡，相比之下，CBE介導(dǎo)的基因失活策略更加溫和、安全。為了更深入了解二者的差別，Dang等［97］針對(duì)腫瘤抑制基因，設(shè)計(jì)了兩個(gè)靶向TP53位點(diǎn)的sgRNA，利用BE3介導(dǎo)的iSTOP和傳統(tǒng)的CRISPR/ Cas9對(duì)其進(jìn)行敲除。實(shí)驗(yàn)表明，BE3產(chǎn)生的基因型更少，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和鄰近基因影響不大。此外二者對(duì)于兩個(gè)相鄰基因的雙敲除效率存在差異，BE3介導(dǎo)的基因敲除對(duì)相鄰基因的副作用更小，更能安全、有效地敲除兩個(gè)近距離的基因。

此外，該策略形成的編輯結(jié)果精準(zhǔn)可控，利用該策略在第一代獲得純合突變體的概率也會(huì)更高。將其應(yīng)用于在植物中，可以加速獲得純合突變體，從而應(yīng)用于反向遺傳或作物育種過(guò)程。Ren等［98］開發(fā)了高效的A3A/Y130F-CBE_V01系統(tǒng)，并用于植物的多重編輯。他們?cè)诙鄠€(gè)控制種子形狀相關(guān)的基因中提前引入終止密碼子，成功敲除OsGS3、OsGW2等基因，并快速獲得純合的多突變體，有效增加籽粒的長(zhǎng)度和寬度。

總之，堿基編輯器在動(dòng)、植物中已獲得了廣泛的應(yīng)用，除了上述主要應(yīng)用外，隨著人們對(duì)堿基編輯器的深入了解，其更多的未知應(yīng)用將被逐一挖掘。

4 總結(jié)和展望

堿基編輯器由于其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、高效、結(jié)果可預(yù)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療以及作物精準(zhǔn)育種上有著無(wú)限的應(yīng)用潛能。本文初步概括了DNA堿基編輯的研究進(jìn)展。這些研究進(jìn)展一方面為堿基編輯器進(jìn)一步的發(fā)展奠基了基礎(chǔ)；另一方面對(duì)堿基編輯的未來(lái)發(fā)展提出了新的問(wèn)題和挑戰(zhàn)：（1）如何進(jìn)一步提高堿基編輯器的精度以及在維持堿基編輯器的高精度下，如何進(jìn)一步平衡編輯范圍、效率以及特異性。盡管目前許多研究報(bào)道了提高堿基編輯器精度的方法，但目前仍然沒(méi)有辦法僅僅編輯單個(gè)堿基而不影響旁側(cè)同類堿基。此外，編輯精度的提高也伴隨靶向區(qū)域減小，以及對(duì)PAM依賴的增加。隨著各種Cas9變體的開發(fā)，尤其是較少依賴PAM的Cas9-NG、Cas9-SpRY等的出現(xiàn)，維持編輯精度且突破靶向范圍變得可能，但Cas9變體的引入犧牲了部分的編輯效率，此外，隨著精準(zhǔn)堿基編輯范圍的擴(kuò)展，其特異性是否受到影響仍待評(píng)估。其背后的科學(xué)問(wèn)題，比如堿基編輯器中脫氨酶脫氨的結(jié)構(gòu)機(jī)理、sgRNA識(shí)別Cas9的分子機(jī)理以及堿基編輯器脫靶的分子機(jī)制等值得進(jìn)一步的探究，解決這些技術(shù)瓶頸背后的科學(xué)問(wèn)題，為研發(fā)高效、廣適性和特異性的精準(zhǔn)堿基編輯工具提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。（2）如何進(jìn)一步拓寬能夠被編輯的堿基類型。目前的堿基編輯器主要實(shí)現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換而不能進(jìn)行堿基顛換，雖已有少量報(bào)道C到G（或A）的堿基編輯器，但其編輯產(chǎn)物依賴被編輯的細(xì)胞類型，且會(huì)使indel出現(xiàn)的頻率增加，因此還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。（3）如何開發(fā)更強(qiáng)大的基于堿基編輯器的人工定向進(jìn)化工具。堿基編輯器可以模擬自然界在設(shè)定的靶向DNA區(qū)域內(nèi)隨機(jī)產(chǎn)生大量的點(diǎn)突變，后續(xù)利用適當(dāng)?shù)暮Y選壓力鑒定出所需的有益變異。擴(kuò)增編輯窗口寬度、拓展可同時(shí)編輯的堿基類型以及提高編輯效率都是未來(lái)優(yōu)化的方向。