賈晨波 蘇一黃 馬秀梅 王春利 徐春燕

（寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021）

生物法是目前處理染料廢水的主要方法之一，它主要依賴特殊微生物的作用改變?nèi)玖戏肿拥慕Y(jié)構(gòu)使廢水脫色，運行成本低且綠色環(huán)保［1］，具有較大的應用空間，已成為印染廢水處理的研究熱點。采用真菌處理染料廢水已經(jīng)得到了廣泛研究，所使用的菌株既有擔子菌也有子囊菌［2-3］，漆酶在真菌降解染料的過程中發(fā)揮著重要作用。漆酶是含有銅離子的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類物質(zhì)和非酚類物質(zhì)的氧化，同時將分子氧還原為水。漆酶的底物范圍廣，反應效率高且穩(wěn)定性好［4-5］，反應過程不需要輔酶因子和H2O2參與，因此在多個領域中都有應用，例如污水處理［6］、制漿造紙［7］、染料脫色［8］等。擔子菌產(chǎn)生的漆酶在木質(zhì)纖維素脫木質(zhì)化中具有良好的潛力和特性，相關(guān)研究很多；相比之下，對子囊菌漆酶的了解較少［9］，目前的報道僅僅提到了少數(shù)的幾種產(chǎn)漆酶子囊菌，例如Nectriella pironii［10］和Cladosporium cladosporioides［11］。與擔子菌相比，子囊菌大多生長更快且能夠產(chǎn)生大量子囊孢子，產(chǎn)漆酶的子囊菌能夠在培養(yǎng)的早期階段產(chǎn)生漆酶［12-13］，因此在應用上擁有獨特的優(yōu)勢，但相關(guān)研究還較為欠缺。

本實驗室前期分離到一株端梗霉屬子囊菌Z45（Acrophialophora sp.）［14］，它能夠產(chǎn)生漆酶，推測其也具有降解染料的能力。端梗霉屬于耐熱土壤真菌，大部分都耐高溫且具有分解木質(zhì)纖維素的能力，能夠產(chǎn)生大量的對熱穩(wěn)定的纖維素酶和木聚糖酶，對木質(zhì)素和植物殘體中的碳循環(huán)起著重要作用。菌株Z45耐熱、喜酸，培養(yǎng)周期短，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求低，優(yōu)良的生長特性使其在農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面的應用前景值得關(guān)注。本文利用漆酶氧化愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生棕紅色物質(zhì)這一原理，依據(jù)棕紅色氧化圈的大小研究影響端梗霉Z45產(chǎn)漆酶的關(guān)鍵因素，進一步通過正交試驗設計對其產(chǎn)酶的基礎培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并測定其在優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的漆酶活力，最后研究了菌株Z45及其粗酶液對合成染料的脫色能力。本研究將對耐熱真菌端梗霉Z45的產(chǎn)酶能力和應用潛力提供參考數(shù)據(jù)，為針對該菌株進一步展開深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 菌株Z45為一株產(chǎn)漆酶的子囊菌端梗霉，其ITS序列的GenBank登錄號為MN784715，該菌株由本實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；PDB培養(yǎng)基；G-PDA培養(yǎng)基：在PDA中加入愈創(chuàng)木酚（0.1%）即為G-PDA培養(yǎng)基。

液體產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，氯化鈣0.5 g，蛋白胨2 g，維生素B110 mg，愈創(chuàng)木酚1 mL（0.1%），蒸餾水1 000 mL。

固體產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基：在液體產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基的基礎上加18 g瓊脂。

PDA染料培養(yǎng)基：分別向PDA培養(yǎng)基加入0.1%的中性紅、剛果紅、蘇丹紅、孔雀綠、結(jié)晶紫、甲基藍、亞甲基藍、溴酚藍染料。

甲基藍培養(yǎng)基：在正交試驗優(yōu)化后的最優(yōu)培養(yǎng)基中加入適量甲基藍，即蔗糖20 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，氯化鈣0.5 g，硝酸鈉0.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，甲基藍按所需濃度添加，調(diào)節(jié)pH值至5.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶能力驗證 在G-PDA培養(yǎng)基中接種直徑6.0 mm的新鮮菌餅一塊，于40℃恒溫培養(yǎng)24 h后進行倒置培養(yǎng)，每天觀察并測量菌落與變色圈直徑，每個實驗設置3個生物學重復。

1.2.2 菌株Z45的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基優(yōu)化 分別用不同碳源替代基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的葡萄糖，接種直徑6.0 mm的菌餅于不同碳源的基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，測定菌株Z45的產(chǎn)漆酶情況，供試碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉。用不同氮源替代基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的蛋白胨，接種直徑6.0 mm的菌餅于不同氮源的基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，測定菌株Z45的產(chǎn)漆酶情況，供試氮源分別為蛋白胨、酵母粉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素。以淀粉和硝酸鈉分別配制碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1的基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種直徑6.0 mm的菌餅于不同碳氮比的基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基，探究不同碳氮比對菌株Z45氧化愈創(chuàng)木酚的影響。以淀粉和硝酸鈉為碳氮源，按40∶1的碳氮比，其他成分與基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基相同，配制培養(yǎng)基并調(diào)節(jié)pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接種直徑6.0 mm的菌餅，測定菌株Z45的產(chǎn)漆酶 情況。

在單因素試驗基礎上，選擇產(chǎn)漆酶效果較好的碳源、氮源、碳氮比、pH值，設計四因素三水平L9（43）的正交試驗，測定不同條件下菌株Z45的變色圈直徑，用SPSS17.0進行分析，優(yōu)化產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基。

1.2.3 菌株Z45的漆酶活力測定 將菌株Z45分別在PDB培養(yǎng)基和優(yōu)化后的液體產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中于40℃培養(yǎng)，每3 d取樣按照文獻方法［15］測定漆酶 活性。

1.2.4 染料脫色實驗 在PDA染料培養(yǎng)基上接種菌株Z45（直徑6.0 mm），于40℃培養(yǎng)并觀察不同染料的脫色情況。調(diào)整PDA甲基藍培養(yǎng)基的甲基藍濃度為0.05 g/L，0.08 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，0.25 g/L和0.3 g/L，按上述方法接種、培養(yǎng)，觀察菌株生長及脫色情況。在優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中加入甲基藍使其濃度為0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，0.25 g/L和0.3 g/L，同上述方法接種、培養(yǎng)，觀察菌株生長及對不同濃度甲基藍的脫色情況。

離心收集優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中菌株Z45的粗酶液，測定其漆酶活力，將粗酶液按1∶1的比例分別與0.2 g/L和0.5 g/L的甲基藍溶液混合，于40℃水浴鍋中溫浴，在不同的時間取樣，于588 nm處測定其OD值并計算粗酶液在不同時間對不同濃度甲基藍溶液的脫色情況。改變酶液與甲基藍染料的比例用于探究漆酶與染料脫色的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 菌株Z45的產(chǎn)漆酶能力

與PDA上的生長情況相比，菌株Z45在G-PDA上的菌絲較細且比PDA培養(yǎng)基上生長緩慢（圖1），這可能是愈創(chuàng)木酚的毒性所致，但菌株Z45使愈創(chuàng)木酚氧化極為明顯，變色圈為深褐色，且變色圈遠大于菌絲覆蓋范圍，提示該菌株具有較好的產(chǎn)漆酶能力。隨著培養(yǎng)時間延長，變色圈逐漸增大，圈徑比先增大再減小，培養(yǎng)至第2天時，圈徑比最大，為1.98，培養(yǎng)2 d后，菌株Z45對培養(yǎng)基中的愈創(chuàng)木酚持續(xù)氧化，但圈徑比開始減小。圈徑比和變色圈直徑都是評價不同菌株產(chǎn)漆酶能力的重要指標，鑒于本研究中所關(guān)注的菌種只有端梗霉Z45一種，再結(jié)合菌株Z45培養(yǎng)6 d內(nèi)圈徑比與變色圈的變化規(guī)律，后續(xù)研究僅采用變色圈直徑進行表征。

圖1 G-PDA與PDA平板上菌株Z45不同培養(yǎng)時期的基本情況Fig. 1 Basic performance of strain Z45 on the G-PDA and PDA medium

2.2 不同因素對菌株Z45產(chǎn)漆酶的影響

在各單因素試驗中，不同培養(yǎng)基上的菌落生長形狀與變色圈都較為規(guī)則，基本呈圓環(huán)形，菌絲生長顏色均為白色至灰白色，所有培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了氧化變色圈，變色圈呈現(xiàn)暗紅色且其直徑大于菌落直徑。圖2-A為菌株Z45在不同碳源培養(yǎng)基下的氧化變色圈直徑，可以看到在以淀粉為碳源時，菌株產(chǎn)漆酶效果最好，其次是蔗糖和乳糖，在以葡萄糖、麥芽糖和羧甲基纖維素鈉為碳源時也能產(chǎn)漆酶，但是效果較差。在氮源的比較試驗中（圖2-B），以硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸鈉和硝酸銨為氮源時，菌株Z45均能產(chǎn)生漆酶，其中以尿素為氮源時產(chǎn)漆酶效果最差，以硝酸鈉和硝酸銨為氮源時菌株Z45產(chǎn)漆酶效果均較好，二者沒有顯著性差異；但在硝酸銨的培養(yǎng)基上有較多孢子產(chǎn)生的新菌落，各菌落容易連成一片，不易觀測分析，因此選擇硝酸鈉為氮源做后續(xù)分析。在不同碳氮比的單因素試驗中（圖2-C），菌株Z45的氧化變色圈在40∶1時最大，在40∶1和50∶1時無顯著性差異。圖2-D為不同pH的單因素試驗，當pH為5.0時變色圈最大，其次是pH為4.0時，pH值大于8.0時菌株生長緩慢，菌絲較弱且沒有出現(xiàn)典型的超出接種塊范圍的變色現(xiàn)象。

圖2 不同條件下的變色圈直徑Fig.2 Diameter of discoloration circle under different condition

2.3 正交實驗優(yōu)化結(jié)果

正交實驗和方差分析（表1、表2）顯示，碳源、氮源和C/N比對漆酶的影響極顯著，極差RB＞RA＞RC＞RD，說明各單因素對菌株Z45產(chǎn)漆酶的影響程度依次為氮源＞碳源＞碳氮比＞pH。菌株Z45產(chǎn)漆酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B1C3D2，即以蔗糖為碳源、硝酸鈉為氮源、碳氮比為45∶1、 pH為5。

表1 正交試驗的結(jié)果與直觀分析Table 1 Results of orthogonal test and the visual analysis

表2 正交試驗的方差分析Table 2 ANOVA of the orthogonal test

2.4 漆酶活性及漆酶與染料脫色的相關(guān)性

菌株Z45在PDB培養(yǎng)基和優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間的漆酶活性（圖3）顯示，優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中的漆酶活性顯著大于PDB中的活性。在培養(yǎng)的前5 d，兩種培養(yǎng)基中均難以檢出漆酶活性；第6天開始，兩種培養(yǎng)基中均能夠檢測到漆酶活性；兩種培養(yǎng)基中的漆酶活性均在第9天達到最高，而后逐漸降低，其中優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中漆酶活性最高可達7.6 U/mL。

圖3 不同培養(yǎng)基中的漆酶活性Fig. 3 Laccase activities in different media

為明確漆酶與染料脫色的相關(guān)性，改變?nèi)玖厦撋w系中加入漆酶的比例，并測定了反應1 h的脫色率，即脫色速率。結(jié)果（圖4）表明，隨著脫色體系中粗漆酶液加入比例的增加，反應1 h時，甲基藍染料的脫色率逐漸升高，提示在一定范圍內(nèi)甲基藍染料的脫色率與脫色體系中粗漆酶液的用量呈正相關(guān)，推測漆酶在甲基藍染料的脫色中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖4 不同粗酶液加入量下甲基藍的脫色速率Fig.4 Decolorization rate of methyl blue with different amount of crude laccase

2.5 染料脫色能力

2.5.1 菌株Z45對不同染料的脫色比較 將菌株Z45在PDA染料培養(yǎng)基上培養(yǎng)2.5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，在所有染料培養(yǎng)基上，菌株Z45均能夠較好地生長，但無脫色現(xiàn)象發(fā)生；培養(yǎng)5 d后，孔雀石綠、剛果紅和蘇丹Ⅲ依然無脫色現(xiàn)象，而溴酚藍、中性紅、甲基藍、亞甲基藍和結(jié)晶紫脫色明顯。其中，菌株Z45對甲基藍染料的脫色效果最好，平板上藍色基本完全脫除；對照為不接菌株Z45的PDA染料培養(yǎng)基，可以看到平板依然呈現(xiàn)藍色（圖5）。

圖5 菌株Z45對甲基藍染料的脫色Fig.5 Decolorization of methyl blue by strain Z45

2.5.2 菌株Z45對甲基藍染料的脫色 菌株Z45在不同甲基藍濃度的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d時，除甲基藍濃度為0.3 g/L的培養(yǎng)基外，其它較低甲基藍濃度的培養(yǎng)基均開始脫色。培養(yǎng)7 d時，不同濃度甲基藍染料培養(yǎng)基上染料脫色較為明顯（圖6），此時，濃度在0.1 g/L以下時甲基藍完全無色，甲基藍濃度在0.1 g/L以上時，甲基藍完全脫色的時間隨染料濃度升高逐漸延長。

圖6 PDA培養(yǎng)基上不同濃度甲基藍染料的脫色情況Fig.6 Decolorization of methyl blue under different concentrations on PDA medium

在優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基上添加不同濃度的甲基藍染料，菌株都能正常生長，且在接菌后的第1天就開始脫色。甲基藍濃度為0.1 g/L和0.15 g/L的培養(yǎng)基在第7天時完全脫色，其余濃度的培養(yǎng)基接近完全脫色（圖7），在第8天時其余濃度的培養(yǎng)基也全部脫色。這與在PDA甲基藍培養(yǎng)基上的脫色情況基本一致，僅0.15 g/L甲基藍濃度下優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基上的脫色比PDA培養(yǎng)上的更徹底、更快一些。但兩種培養(yǎng)基上的菌絲顏色有較大差別，PDA甲基藍培養(yǎng)基上的菌絲為純白色，而優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基上的菌絲為灰白色或黑色。

圖7 優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中不同濃度甲基藍的脫色情況Fig. 7 Decolorization of methyl blue under different concentrations on the optimized medium for laccase production

菌株Z45的粗酶液在24 h內(nèi)對兩種濃度甲基藍染液的脫色結(jié)果（圖8）表明，粗漆酶與甲基藍的反應迅速，在前1 h內(nèi)粗漆酶對甲基藍的脫色速度最快；而后隨著反應時間的延長，反應速度減慢，進入緩慢脫色期。此時，漆酶與兩種濃度甲基藍染液的反應呈現(xiàn)不同現(xiàn)象，在0.2 g/L的甲基藍溶液中，反應迅速進入平臺期；而在0.5 g/L的甲基藍溶液中，反應經(jīng)過較長一段時間的中速反應期后逐漸進入平臺期。24 h后，粗漆酶對0.2 g/L和0.5 g/L甲基藍溶液的脫色率分別達到34.5%和42.3%。

圖8 粗酶液對不同濃度甲基藍溶液的脫色情況Fig. 8 Decolorization of methyl blue under different concentrations by crude enzyme solution

3 討論

漆酶廣泛地存在于微生物中，許多真菌和細菌都具有產(chǎn)漆酶的能力，目前對于白腐真菌（主要是擔子菌類）產(chǎn)漆酶的研究較多，一些子囊菌也能夠產(chǎn)漆酶，如曲霉［16］，但相關(guān)報道較少。子囊菌和擔子菌是真菌的主要類群，占真菌總量的98%。子囊菌的種類繁多，無論是已知種類還是未知種類都比擔子菌表現(xiàn)出了更大的多樣性及更快的進化速率［17］，巨大的數(shù)量蘊涵了更強的適應性和更多的功能。許多子囊菌生長迅速，菌絲體發(fā)達且能產(chǎn)生大量無性孢子，在開放的自然環(huán)境中能夠迅速占領生態(tài)位，因此，產(chǎn)漆酶的子囊菌比產(chǎn)漆酶的擔子菌在應用上更具優(yōu)勢。本實驗室前期從干旱區(qū)土壤中獲得了一株產(chǎn)漆酶的子囊菌端梗霉Z45［14］，其耐高溫且生長迅速，這些特點可能賦予它在應用上具有一定的獨特性。

優(yōu)化產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件以提高菌株的產(chǎn)漆酶能力一直是漆酶研究的重要方向之一，本文首先通過愈創(chuàng)木酚氧化實驗研究了其產(chǎn)漆酶的規(guī)律，基于正交實驗優(yōu)化了產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基并測定了其在優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中的漆酶活性。對比適合生長的基礎培養(yǎng)基和優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中的C/N比發(fā)現(xiàn)，在最適生長培養(yǎng)基中，C/N比為10∶1［14］，而最優(yōu)產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基的C/N比則為45∶1，說明菌株Z45產(chǎn)漆酶受低氮誘導。最后，分析了菌株Z45對不同染料的脫色能力及優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基對三苯甲烷類染料甲基藍脫色的促進作用，并測試了粗酶液對甲基藍染料的脫色能力。甲基藍染料是目前常用的三大類染料之一，該染料廢水常見于制革業(yè)、紡織業(yè)、造紙業(yè)等，具有致癌、致畸、致突變等較大危害［18］。該類染料具有特殊的化學結(jié)構(gòu)，在自然界中很難被降解。染料廢水排放到地表水中時，會造成水污染以及嚴重的環(huán)境問題。優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中漆酶活性顯著增加，且對甲基藍脫色也有一定的促進作用，結(jié)合菌株Z45產(chǎn)纖維素酶（液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d纖維素酶活性可達19.84 U/mL）及耐高溫、易培養(yǎng)的特性，后續(xù)研究可采用生物質(zhì)/染料的共降解體系在該菌株降解染料及木質(zhì)纖維素方面進行探索。此外，菌株Z45具有在較低pH值下對多種結(jié)構(gòu)的染料進行脫色的能力，這是處理酸性工業(yè)染色廢水的優(yōu)勢。

漆酶基因上游往往有多種順式作用元件，使得其表達可以受到多種因素的調(diào)控，通過改變營養(yǎng)條件提高漆酶產(chǎn)量是真菌產(chǎn)漆酶條件優(yōu)化中的有效方法，在相關(guān)研究中常常用到［19］。添加硫酸銅、硫酸亞鐵等合適的誘導劑也能夠提高漆酶活性［20-21］，不同調(diào)控因子之間還可能具有協(xié)同誘導作用。例如，在培養(yǎng)基中同時添加酵母粉和硫酸銅，可促進杏鮑菇產(chǎn)漆酶［22］。向基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中同時添加甘草渣和硫酸銅，也能夠協(xié)同誘導漆酶產(chǎn)生，有效提高漆酶活性［15］。向G-PDA培養(yǎng)基中添加0.05 mmol/L硫酸銅后接種Z45，培養(yǎng)基上的棕紅色變色圈顯著增大，說明適量的硫酸銅也能夠促進菌株Z45產(chǎn)漆酶。向優(yōu)化后的產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中添加不同濃度甲基藍，其脫色情況與PDA甲基藍培養(yǎng)基上基本一致，但菌絲顏色產(chǎn)生較大差異，這可能是因為不同的培養(yǎng)基會影響菌株的生長及色素的產(chǎn)生［23］，兩種培養(yǎng)和營養(yǎng)不同導致了菌絲顏色發(fā)生變化。

在甲基藍脫色實驗中添加的粗酶液活力較低，因此脫色時間較長，脫色率較低。實際生產(chǎn)中產(chǎn)生的染料廢水，往往成分復雜，常含有多種重金屬離子，它們對于漆酶的活性或促進，或抑制，因此欲將端梗霉的漆酶用于實際廢水處理還需要更多研究。此外，有不少研究人員對漆酶的固定化應用［24］進行了探索，以提高漆酶的性能和可重復使用性，這也為該菌株的進一步研究指明了方向。

4 結(jié)論

端梗霉Z45具有較好的產(chǎn)漆酶能力，通過單因素實驗和正交試驗設計得到了其產(chǎn)漆酶的優(yōu)化培養(yǎng)基：產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基以蔗糖為碳源、硝酸鈉為氮源、碳氮比為45∶1、pH為5。菌株Z45在優(yōu)化培養(yǎng)基中的漆酶活性顯著大于PDB中的活性，且染料脫色速率與漆酶活性呈現(xiàn)正相關(guān)性。菌株Z45對溴酚藍、中性紅、亞甲基藍、甲基藍和結(jié)晶紫等多種染料具有脫色能力，其中對甲基藍的脫色效果最好，培養(yǎng)5 d時藍色基本完全消除，在較低的甲基藍濃度下，脫色不受染料濃度的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基更利于菌株Z45使甲基藍脫色。