趙子玉 王春光 呂建存 李繼開 張鐵

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 中獸醫(yī)學(xué)院，保定 071001）

抗菌藥物是當(dāng)今獸醫(yī)臨床用于預(yù)防和治療動物細菌感染性疾病的主要手段，保障了現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。但是由于人類對抗生素的濫用，使得細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，對人類和動物健康造成了嚴(yán)重危害，因此受到了廣泛關(guān)注［1-3］。細菌耐藥性的產(chǎn)生機制主要包括細菌細胞膜通透性的改變、細菌生物膜的形成、抗生素作用靶位的改變、主動外排機制和滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生等［4］。在這些耐藥機制中，滅活酶β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生最為常見，占比高達80%［5］。

β-內(nèi)酰胺酶最早發(fā)現(xiàn)于1940年，至今已超過500多種［6］。β-內(nèi)酰胺酶是耐藥細菌針對β-內(nèi)酰胺類抗生素分泌的一類酶，可以與內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)相結(jié)合，破壞甚至裂解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去抗菌活性［7］。其主要有兩種分類方法，一種是Bush分類法［8］，另一種是Ambler分類法［9］。最具有代表性的為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）［10］，其主要存在于革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科細菌中，代表菌種為大腸桿菌和肺炎克雷伯菌［11］，銅綠假單胞菌也有產(chǎn)ESBLs的報道［12］。目前世界各地已發(fā)現(xiàn)超過200余種的ESBLs，且具有明顯的區(qū)域性特征［13］。根據(jù)編碼基因的同源性，ESBLs可分為CTX-M型、SHV型、TEM型、OXA型和其他型。據(jù)報道顯示，CTX-M型是我國產(chǎn)ESBLs菌株的主要基因型［14-15］，可能與我國臨床治療細菌感染時應(yīng)用頭孢噻肟多且量大有關(guān)［16］。CTX-M型ESBLs根據(jù)氨基酸序列的同源性可分為6組，主要代表為CTX-M-14型［17］，其屬于CTX-M-9亞群，在全世界也呈現(xiàn)流行趨勢［18-19］。

目前已經(jīng)研發(fā)出多種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，常見的抑酶劑有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等［20-21］，其本身具有較弱的抗菌活性，可以抑制β-內(nèi)酰胺酶，因此常與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用增強抗生素的耐藥性。但隨著這些抑酶劑與抗生素復(fù)合制劑的應(yīng)用，新的耐藥菌株也逐漸出現(xiàn)［22-23］。因此需要尋找一種新型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，使細菌恢復(fù)對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。眾所周知，中藥歷史悠久，具有種類多、安全、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，在細菌耐藥性研究中具有一定的優(yōu)勢。且中藥內(nèi)不含酰胺鍵，不容易被ESBLs破壞，可以很好的抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性［24］，因此從中藥中尋找一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑不失為一種解決β-內(nèi)酰胺酶耐藥性的好辦法。

本試驗構(gòu)建了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的原核表達載體，通過計算機虛擬篩選從中藥單體數(shù)據(jù)庫中得到了一個較好的CTX-M-14中藥抑制劑—蕓香苷，聯(lián)合抑菌試驗證明蕓香苷與頭孢噻肟鈉具有聯(lián)合抑菌作用，并通過酶動力學(xué)試驗測定抑酶劑蕓香苷與克拉維酸的抑酶作用與抑酶方式。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E320（本實驗室測序并保存的多重耐藥大腸桿菌菌株，NCBI登錄號：CP020933）、大腸桿菌ATCC25922購自美國組織細胞收藏中心（ATCC）、pET-28a（+）空質(zhì)粒載體購自武漢淼靈生物科技有限公司、His-Tagged Protein Purification Kit 試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司、DH5α、BL-21購自上海昂羽生物技術(shù)有限公司、EcoR I、Xho I限制性核酸內(nèi)切酶、Q5超保真DNA聚合酶購自NEB、IPTG購自索萊寶生物科技有限公司、蕓香苷購自上海源葉生物科技有限公司、頭孢硝噻吩（Nitrocefin）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達

1.2.1.1 CTX-M-14的基因克隆與鑒定 根據(jù)CTX-M-14的基因設(shè)計引物，以E320、ATCC25922的DNA為模版，98℃ 30 s，98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 2 min，4℃保存，共35個循環(huán)，進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果是否存在876 bp的條帶。

1.2.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以大腸桿菌E320為模板，設(shè)計的引物引入酶切位點。CTX-M-14 F：5′- CGGAATTCATGGTGACAAAGAGAG-3′（劃 線 為EcoR I酶切位點），CTX-M-14 R：5′- CCCTCGAGTTACAGCCCTTCG -3′（劃線為Xho I酶切位點）。根據(jù)上述PCR條件，將得到的PCR產(chǎn)物與pET-28a（+）分別用EcoR I和Xho I雙酶切以及膠回收，用T4連接酶過夜連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α，獲取的質(zhì)粒通過雙酶切進行鑒定，確定質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將質(zhì)粒進行測序，并與目的序列比對。

1.2.1.3 誘導(dǎo)表達及可溶性檢測 測序成功后將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL-21中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6左右，取適量菌液做未誘導(dǎo)對照，其余的菌液加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達4 h后收集菌體，處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測。

取誘導(dǎo)表達后的菌液，冰浴中超聲裂解，分別收集上清和沉淀，處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測，確定表達產(chǎn)物是在上清中以可溶性形式存在還是在沉淀中以包涵體形式存在。

1.2.1.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化 將蛋白陽性重組菌分別進行誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的優(yōu)化。第一組優(yōu)化誘導(dǎo)時間，終濃度1 mmol/L，37℃分別誘導(dǎo)3、4、5、6 h；第二組優(yōu)化誘導(dǎo)溫度，終濃度1 mmol/L，26℃、31℃、34℃、37℃、42℃分別誘導(dǎo)4 h；第三組優(yōu)化IPTG濃度，終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，31℃誘導(dǎo)4 h。處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測。

1.2.1.5 蛋白純化與活性的鑒定 冰浴條件下超聲破碎蛋白陽性重組菌直至菌體清亮，取出上清液，使用His-Tagged Protein Purification Kit試劑盒進行純化，使用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）檢測酶的活性。

1.2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14中藥抑制劑的虛擬篩選

1.2.2.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14和中藥單體化合物的結(jié)構(gòu)處理 從PDB（Protein Data Bank，www.rcsb.org）上下載大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：6vnu）。在AutoDock-Tools（The Scripps Institute）中刪除水分子，加電荷、加氫原子，經(jīng)處理后轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。從ZINC數(shù)據(jù)庫（www.zinc.org）下載中藥單體化合物結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。

1.2.2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14虛擬篩選及作用力分析 在AutoDoockTools上通過Grid Box工具找到2drd蛋白的活性口袋，用PyRx（The Scripps Institute）運行Autodock Vina完成虛擬篩選，并應(yīng)用DSVisualizer（BIOVIA）進行作用力分析。

1.2.3 聯(lián)合抑菌試驗

1.2.3.1 MIC的測定 蕓香苷經(jīng)DMSO溶解后加水配成50 mg/mL的準(zhǔn)備液，采用微量肉湯二倍稀釋法，用MHB營養(yǎng)肉湯分別測定蕓香苷、苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌E320與蛋白陽性重組菌BL-21的最小抑菌濃度（MIC），并以ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.3.2 蕓香苷與頭孢噻肟鈉的聯(lián)合抑菌試驗 采用微量棋盤稀釋法對大腸桿菌E320、蛋白陽性重組菌BL-21進行藥物體外聯(lián)合抑菌試驗，以導(dǎo)入空質(zhì)粒的BL-21作為空白對照，在縱橫兩個方向上以蕓香苷、頭孢噻肟鈉的MIC為初始濃度，對蕓香苷和頭孢噻肟鈉分別進行倍比稀釋，每孔加入大腸桿菌菌液使終濃度為5×105CFU/mL，37℃培養(yǎng)20 h，以無細菌生長的最低藥物濃度為聯(lián)合用藥MIC，計算分級抑菌濃度指數(shù)（FICI），判定聯(lián)合用藥效果。

FICI=MIC（蕓香苷聯(lián)合用藥）/MIC（蕓香苷單用）+MIC（頭孢噻肟鈉聯(lián)合用藥）/MIC（頭孢噻肟鈉單用）

判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5判定為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1判定為相加作用，1＜FICI≤2判定為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2判定為拮抗作用。

1.2.4 酶動力學(xué)測定

1.2.4.1 米氏常數(shù)（Km）與最大反應(yīng)速率（Vmax）的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，將蕓香苷溶解在含0.1 mmol/L的Na2CO3中配成10 mg/mL的溶液備用，將β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14加入到PBS中，含抑制劑組將加入抑制劑終濃度為1 mmol/L，調(diào)節(jié)pH 7.0，溶劑對照組加入等量的0.1 mmol/L的Na2CO3，空白對照組加入等量的PBS，置于37℃中溫浴5 min，頭孢噻肟鈉溶液pH調(diào)整為7.0，并置于37℃中溫浴5 min，然后根據(jù)頭孢噻肟鈉濃度（10、20、30、40、50 μm/L）將頭孢噻肟鈉加入到上述溶液中并迅速轉(zhuǎn)移到比色皿中，通過紫外分光光度計監(jiān)測5 min內(nèi)236 nm處吸光度值的變化。選取初始反應(yīng)吸光度值變化與時間呈線性關(guān)系的區(qū)段，計算水解的初速度V0，并根據(jù)方程V=Vmax/（Km+S）進行非線性擬合，分別得出Km與Vmax。

1.2.4.2 抑制常數(shù)Ki的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，分別將0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5 μm的克拉維酸或蕓香苷與含有β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的PBS混合，調(diào)節(jié)pH 7.0，置于37℃中溫浴5 min，然后轉(zhuǎn)移至比色皿中，分別加入50、100 μm的頭孢噻肟鈉進行混合，迅速加入到紫外分光光度計中，檢測5 min內(nèi)236 nm處吸光度值的變化，選取初始反應(yīng)吸光度值變化與時間呈線性關(guān)系的區(qū)段，計算水解的初速度V0，以Dixon做圖， 求出Ki。

1.2.4.3 抑酶保護率的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，在含有β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的PBS中加入蕓香苷或克拉維酸至終濃度為2 mmol/L，調(diào)節(jié)pH 7.0，溶劑對照組加入等量的0.1 mmol/L的Na2CO3，空白對照組加入等量的PBS，置于37℃中溫浴5 min，然后加入與抑制劑質(zhì)量比為1∶1的頭孢噻肟鈉，空白對照組加入頭孢噻肟鈉至終濃度為4 mmol/L，測定其236 nm處的OD值后繼續(xù)置于37℃溫浴30 min，再次測定其OD值，每組重復(fù)3次，根據(jù)OD值的變化，計算抑酶保護率。

抑酶保護率（%）=（對照組OD值的變化量-試 驗組OD值變化量）/對照組OD值的變化量×100%

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增凝膠電泳

使用CTX-M-14這對引物對E320和ATCC25922進行PCR擴增，結(jié)果（圖1）顯示，E320攜帶CTX-M-14基因，出現(xiàn)約876 bp的條帶，ATCC25922未擴增到CTX-M-14基因。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig. 1 Gel electrophoresis of PCR amplified product

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

將提取的重組質(zhì)粒用EcoR I和Xho I進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp與1 000 bp之間有與CTX-M-14相同大小條帶，證明構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒經(jīng)雙酶切Fig. 2 Double enzyme digestion of transformed plasmid

2.3 DNA測序結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)序列分析，與GenBank中CTX-M-14基因相同。測得核苷酸序列與GenBank中CTX-M-14對照，如圖3所示。

圖3 CTX-M-14測序結(jié)果比對圖Fig. 3 Alignment of CTX-M-14 sequencing results

2.4 CTX-M-14型ESBLs重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性檢測

重組菌誘導(dǎo)后樣品約在28 kD左右有明顯的融合蛋白條帶，而重組菌未誘導(dǎo)樣品無明顯特異性條帶，如圖4-A所示。裂解后的上清和沉淀中均出現(xiàn)一條28 kD左右的明顯的融合蛋白條帶，如圖4-B所示。

圖4 重組蛋白的表達檢測Fig. 4 Expression detection of recombinant protein

2.5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

結(jié)果顯示重組蛋白在31℃、IPTG濃度在0.6 mmol/L時誘導(dǎo)4 h為最佳條件，如圖5所示。

圖5 蛋白表達條件的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of protein expression conditions

2.6 重組蛋白純化及活性鑒定

重組蛋白經(jīng)蛋白純化試劑盒純化的SDS-PAGE結(jié)果見圖6-A；對CTX-M-14重組蛋白活性鑒定中，加入β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的頭孢硝噻吩紙片從黃色變?yōu)榧t色，而對照仍呈黃色，說明重組蛋白存在活性，如圖6-B所示。

圖6 重組蛋白純化及活性鑒定Fig. 6 Purification and activity identification of recombinant protein

2.7 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14抑制劑的虛擬篩選

經(jīng)過篩選共得到12個結(jié)合能低于-9.8 kcal/mol的中藥單體，其中結(jié)合能最高的是rhein diglucoside（大黃酸二葡萄糖苷），為-11.5 kcal/mol，其次是agastachin（藿香素）、glycyrrhizin（甘草酸）、timosaponin A3（知母皂苷A3）、biepiasterolide（雙表白術(shù)內(nèi)酯）、sennidin A（森尼丁A）、rutin（蕓香苷）、ciwujianoside（刺五加皂苷）、galloylpaeoniflorin（沒食子酰芍藥苷）、acaciin（刺槐甙）（表1）?？紤]到毒性、溶解性和價格等因素，我們選取了rutin（蕓香苷）來做后續(xù)的研究。

表1 Autodock Vina虛擬篩選的部分中藥成分評分結(jié)果Table 1 Scoring results of some Chinese herbal medicinal ingredients screened virtually by AutoDock Vina

2.8 蕓香苷配體與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14作用力分析

通過Autodock Vina軟件對中藥單體與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14進行分子對接模擬，結(jié)果顯示多種中藥單體能很好的與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14結(jié)合。本試驗選取蕓香苷進行了分子間作用力分析，蕓香苷與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14對接部位形成多個氫鍵和范德華力（圖7）。其結(jié) 合 作 用 力 為-9.9 kcal/mol，與Ser274、Ser237、Ser70、Ser130、Asn170、Asn132、Asn104、Arg276、Thr216、Thr235形成氫鍵，與Gly238形成范德華力。

圖7 蕓香苷與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14作用力分析Fig. 7 Interaction analysis of rutin with extended-spectrum β-lactamases CTX-M-14

2.9 MIC的測定

E320對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉為耐藥，對頭孢呋辛為敏感；重組蛋白陽性菌BL-21對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉為耐藥，對頭孢他啶、頭孢呋辛為中度敏感，且對頭孢噻肟鈉耐藥極其顯著（表2）。

表2 大腸桿菌E320、重組蛋白陽性菌BL-21的MICTable 2 MIC of E. coli E320 and recombinant protein positive BL-21

2.10 蕓香苷和頭孢噻肟鈉的聯(lián)合抑菌試驗

通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對菌株E320的MIC分別為2.5 mg/mL、1 024 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯(lián)合抑菌時，兩者具有協(xié)同作用（FICI=0.236）；通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對CTX-M-14蛋白陽性重組菌的MIC分別為2.5 mg/mL和＞1 024 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯(lián)合抑菌時，兩者具有協(xié)同作用（FICI≤0.3125）；通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對導(dǎo)入空白質(zhì)粒pET-28a（+）的BL-21的MIC分別為2.5 mg/mL、8 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯(lián)合抑菌時，兩者具有無關(guān)作用（FICI=1.5）（表3）。

表3 蕓香苷和頭孢噻肟鈉聯(lián)合抑菌試驗Table 3 Combined antibacterial test of rutin and cefotaxime sodium

2.11 酶動力學(xué)參數(shù)

根據(jù)擬合線性方程得出，β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的Km為7.13，Vmax為21.33；溶劑對照組的Km為7.11，Vmax為20.97；加入蕓香苷后的Km為8.76，Vmax為17.63；加入克拉維酸的Km為8.45，Vmax為17.79，加入抑制劑后相比空白對照Km均變大，Vmax均變小。根據(jù)Dixon作圖得出蕓香苷的Ki為11.38，克拉維酸的Ki小于蕓香苷為3.78（表4）。

表4 酶動力學(xué)參數(shù)Table 4 Enzyme kinetic parameters

2.12 抑酶保護率

蕓香苷組的OD值平均變化量為0.35，克拉維酸組的OD值平均變化量為0.32，空白對照組的OD值平均變化量為0.82，溶劑對照組變化量為0.81，根據(jù)計算得出克拉維酸的抑酶保護率為60.98%，蕓香苷的抑酶保護率為57.31%（表5）。

表5 抑酶保護率Table 5 Inhibition rate of enzyme

3 討論

分子對接是通過計算模擬的方式解決了實驗過程中效率低下的問題。Autodock Vina作為AutoDock的第二代分子對接軟件，對接的精度較第一代AutoDock更高，且操作簡易，可進行并行計算，對接速度較AutoDock具有很大優(yōu)勢。蕓香苷，又名蘆丁，是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于各種藥用植物中，其化學(xué)成分獨特、生物活性廣泛，引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［25］，其具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用［26-27］。研究顯示黃酮類化合物具有一定的抗菌活性［28］，Danciu等［29］還發(fā)現(xiàn)蕓香苷可以顯著降低金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的致病力。本研究通過Autodock Vina軟件對中藥單體與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14進行分子對接模擬，結(jié)果顯示多種中藥單體與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14受體有好的結(jié)合作用。本研究選取蕓香苷為研究對象，結(jié)果顯示蕓香苷與CTX-M-14受體多個氨基酸殘基形成了疏水作用力，并且還與對接部位形成多個氫鍵，說明蕓香苷與CTX-M-14蛋白的結(jié)合很穩(wěn)定。

序列比對分析結(jié)果與CTX-M-14相同，且蛋白大小相同，證明重組蛋白菌可以正確表達出CTX-M-14。頭孢硝噻吩是具有顯色特征的一種頭孢菌素，可以用來檢測β-內(nèi)酰胺酶活性。β-內(nèi)酰胺酶可以水解頭孢硝噻吩β-內(nèi)酰胺環(huán)上羰基碳和氮基間的酰胺鍵，該過程可以使頭孢硝噻吩顯現(xiàn)紅色［30］，結(jié)果顯示頭孢硝噻吩變?yōu)榧t色，說明重組蛋白菌表達出的β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14具有活性。

陽性蛋白重組菌BL-21對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉顯示為耐藥，并且對頭孢噻肟鈉的耐藥性最為顯著，可知CTX-M-14對頭孢噻肟鈉的水解能力最好，與文獻中報道相似［31］。因此對酶動力參數(shù)試驗選用頭孢噻肟鈉作為底物。蕓香苷使用DMSO溶劑不會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響［32］，其本身對大腸桿菌的抗菌活性較弱，但與抗生素頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用時出現(xiàn)了協(xié)同作用，可增強頭孢噻肟鈉對大腸桿菌的敏感性，提高了抗菌活性，且E320和CTX-M-14蛋白陽性重組菌呈協(xié)同作用，而蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯(lián)合應(yīng)用對導(dǎo)入空白質(zhì)粒pET-28a（+）的大腸桿菌呈無關(guān)作用，且蕓香苷與CTX-M-14蛋白有很好的結(jié)合作用，一定程度上可以說明蕓香苷是通過抑制β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14的活性從而降低對頭孢噻肟鈉的耐藥性，表明中藥單體蕓香苷可作為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的前體，可能通過結(jié)構(gòu)改造而變成抑制作用良好、毒副作用低的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。

米氏常數(shù)（Km）是酶動力學(xué)的經(jīng)典且重要的參數(shù)，代表酶與底物的親和力，Km越小親和力越大，在加入抑制劑后，Km值明顯增大，說明抑制劑會抑制酶與底物的結(jié)合，從而起到抑制作用，且克拉維酸的增大量比蕓香苷大，說明克拉維酸的抑制作用比蕓香苷好。Vmax代表酶對底物的最大水解速度，可以反映β-內(nèi)酰胺酶對酶的穩(wěn)定性，在加入抑制劑后Vmax變化不大，說明這兩種抑制劑均為競爭性抑制劑［33］。Km/Vmax這一比值稱之為水解效率，可以綜合反應(yīng)底物與酶的親和力［34］，抑制劑組Km/Vmax均大于空白對照組，說明這兩種抑制劑與酶的親和力大于底物頭孢噻肟鈉。抑制常數(shù)Ki是反應(yīng)酶與抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)，越小說明抑制作用越強，蕓香苷的Ki大于克拉維酸的Ki值，說明克拉維酸的抑制作用優(yōu)于蕓香苷，與Km的結(jié)果一致。抑酶保護率結(jié)果中克拉維酸的抑酶保護率也大于蕓香苷的抑酶保護率，說明克拉維酸的抑制作用優(yōu)于蕓香苷。

4 結(jié)論

蕓香苷具有成為新型中藥β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的潛質(zhì)，它與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用時可以增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對大腸桿菌的敏感性，通過競爭性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性。