王楠 張瑞 潘陽陽 何翃宏 王靖雷 崔燕 余四九

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070）

牦牛（Bos grunniens）分布在以中國(guó)青藏高原為中心的“3 000-6 000”米的高海拔地區(qū)，素有“高原之舟”“世界屋脊”的美稱［1］，能夠在強(qiáng)輻射、酷寒、空氣稀疏的惡劣生態(tài)環(huán)境中活動(dòng)自在，繁殖后代，又可為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、奶、毛和役力等生產(chǎn)和生活所需品，是當(dāng)?shù)夭豢苫蛉钡闹匾蠓N。可是牦牛相比平原牛種，繁殖力低下，性成熟晚，成為了影響高寒地區(qū)牧民經(jīng)濟(jì)收入的重要因素［2］。

TGF-β超家族是一類生物活性很高，臨床應(yīng)用前景很好，對(duì)細(xì)胞增殖和分化有多種調(diào)節(jié)作用的多肽生長(zhǎng)因子［3］。其主要包括TGF-Bs、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）、活化素、生長(zhǎng)和分化因子、AMH和抑制素。這類生長(zhǎng)因子已被表明在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化、黏附、遷移及Th17反應(yīng)的極化、ROS的產(chǎn)生和凋亡中發(fā)揮重要作用［4-8］。TGF-β存在4種亞型，為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及TGF-β5，存在哺乳動(dòng)物體內(nèi)僅有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種變異體，這3種結(jié)構(gòu)相似的變異體高度保守，在生物反應(yīng)中作用相似［9］。TGF-β1作為生長(zhǎng)因子家族的原型成員，其活性最強(qiáng)，對(duì)其的研究最深。TGF-β1最早發(fā)現(xiàn)與1978年，是首次發(fā)現(xiàn)的一種多肽細(xì)胞因子［10-11］。機(jī)體多種組織和細(xì)胞均可產(chǎn)生TGF-β1，其在不同的條件下發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與的生物學(xué)作用主要有細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷后的修復(fù)、骨重建等重要過程［12］。其中TGF-β1對(duì)哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育過程至關(guān)重要，通常具有調(diào)控胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要功能。有研究表明，TGF-β1作為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中最關(guān)鍵的形態(tài)發(fā)生物質(zhì)，參與胚胎肢端發(fā)芽、脊椎骨形成、面骨形成和心臟瓣膜生成等重要步驟［13］。近年來，隨著對(duì)該因子的深入研究，人們又發(fā)現(xiàn)TGF-β1在卵巢中也發(fā)揮著不可小覷的作用，可參與排卵發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控的自分泌旁分泌、調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞卵泡發(fā)育、與顆粒細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞等［14］。研究表明，正常情況下，TGF-β1主要位于竇卵泡的卵泡膜細(xì)胞（granular cell TC）、初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞（ovarian granulosacell，GC）及卵巢間質(zhì)中，在卵泡發(fā)育末期，TGF-β1可以通過誘導(dǎo)TC及GC的增殖分化，細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與卵泡閉鎖過程，并可維持卵巢黃體，刺激孕酮產(chǎn)生［15］。而TGF-β1作為卵巢中重要的自分泌／旁分泌因子，可通過激活SMAD通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞透明質(zhì)酸的合成，進(jìn)而參與COC細(xì)胞外基質(zhì)形成的調(diào)控［16-17］。據(jù)報(bào)道，敲除小鼠體內(nèi)TGF-β1 I型受體，阻斷TGF-β1信號(hào)通路，會(huì)導(dǎo)致小鼠輸卵管及子宮發(fā)育異常，致小鼠不孕［18］。但其在牦牛生殖發(fā)育中的研究，鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)成功克隆牦牛TGF-β1基因，并進(jìn)行生物學(xué)信息分析，探討牦牛TGF-β1基因與其他牛種之間的差異性。利用qRT-PCR、IHC、WB等方法檢測(cè)正常生理?xiàng)l件下TGF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮的表達(dá)，為進(jìn)一步研究TGF-β1參與牦牛生殖發(fā)育的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)改善牦牛的繁殖力，增加牧民收入具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

TranZol、E.coli DH5α感受肽細(xì)胞均購(gòu)自（全式金，北京），SYBR?Premix Ex TapTMEraserTM、Taq PCR Master Mix and pMDTM19-T Vector Cloning Kit均購(gòu)自（TaKaRa，大連）、通用型DNA純化回收試劑盒（北京，天根），SP試劑盒、IPTG、4×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自（Solarbio公司，北京）、TGF beta1 Antibody（AF1027）（Affinity公司，美國(guó)）、GAPDH（武漢三鷹）、Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody（博奧森，北京），普通PCR儀（艾本德公司，德國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler? 96 SW 1，loch1公司，瑞士）、恒溫培養(yǎng)箱（松下，日本）、顯微鏡（DP71，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 試驗(yàn)所用的樣品于2020年9月采集青海省西寧市馬佳肴屠宰場(chǎng)，選取健康且年齡（3-6歲）的發(fā)情期和妊娠期的雌性牦牛各4頭，頸動(dòng)脈致死后，分別取不同時(shí)期（卵泡期、黃體期、妊娠期）的不同部位（卵巢、輸卵管、子宮），用生理鹽水沖洗后浸泡于4%的多聚甲醛固定（修剪組織塊大小為1 cm3）用于后期免疫組化的實(shí)驗(yàn)，其他剩余組織錫箔紙包裹放于液氮罐，-80℃保存，用于后期分子實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 牦牛TGF-β1基因克隆

1.2.2.1 引物的設(shè)計(jì) 參照GenBank公布的普通牛（Bos taurus）TGF-β1基因和牦牛內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），利 用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)牦牛的TGF-β1基因上下游引物用于基因序列的克隆，引物D-TGFβ1、TGF-β1用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。內(nèi)參引物為GAPDH，所用引物均在上海生工合成，具體引物信息見表1。

表1 引物序列及長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and length

1.2.2.2 總RNA、蛋白提取及目的基因的擴(kuò)增 從-80℃超低溫冰箱中取出發(fā)情期和妊娠期不同部位的雌性牦牛組織，參照TransZol試劑盒說明書提取總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和OD260/OD280值，將RNA濃度調(diào)成一致，參照兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（Go ScriptTM Reverse Transcription Syatem，Promega）合 成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩⒄誖IPA組織蛋白提取試劑盒說明書，提取組織總蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 牦牛TGF-β1基因的克隆 以牦牛cDNA為模板，TGF-β1為引物，擴(kuò)增牦牛TGF-β1基因全序列。PCR總反應(yīng)體系為20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性（95℃ 4 min）；變性（95℃ 30 s）；退火（60℃ 30 s）；延伸（72℃ 15 s）；循環(huán)40次；72℃保存5 min；最后保存于4℃，瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果。用膠回收試劑盒回收純化目的條帶。將純化的膠回收產(chǎn)物與pMDTM19-T Vector進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物（10 μL）轉(zhuǎn)化至100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞后，于含有X-Gal、IPTG、AMP的LB固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，挑取單顆菌進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的陽性克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，所得菌液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2.4 生物信息學(xué)分析 NCBI-ORF在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行開放閱讀 框 分 析，NCBI-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)比分析牦牛TGF-β1基因相似性，利用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用ExPASy-Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，利用在線軟件TMHMM ServerV.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)牦牛TGF-β1基因編碼蛋白跨膜區(qū)域，利用IBCP在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用在線軟件Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）分析其蛋白親疏水性，利用在線軟件Netphos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)TGF-β1基因的表達(dá) 利用qRT-PCR檢測(cè)牦牛TGF-β1基因在牦牛發(fā)情期和妊娠期主要生殖器官的表達(dá)情況，以牦牛cDNA為模板，D-TGF-β1為引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：cDNA為2 μL，上下游引物為0.8 μL，無菌去離子水6.4 μL，SYBR?Premix Ex TapTMEraserTM10 μL，3 Step Amplification：（95℃，5 s）、（60℃，30 s）、（72℃，12 s）、40個(gè)循環(huán)（n=4）。根據(jù)cq值以2-ΔΔCt計(jì)算［19］TGF-β1基因在發(fā)情期和妊娠期卵巢，輸卵管和子宮中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá)

1.2.4.1 蛋白樣品的制備 將牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮的蛋白樣品與4X蛋白上樣緩沖液按照3∶1比例配置蛋白工作液，金屬浴變性（100℃，10 min），冰上靜置10 min后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 Western blot SDS PAGE凝膠電泳，分別配置12%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后按照目的蛋白大小切膠將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉，TGF beta1 Antibody（1∶1 500稀釋）4℃孵育過夜，PBST清洗一抗，10 min/次，共1 h，Goat Anti-Rabbit IgG/HRP antibody室溫孵育1 h，PBST清洗，10 min/次，共1 h。使用GEAI600化學(xué)發(fā)光儀成像系統(tǒng)掃描目的條帶，利用成像結(jié)果計(jì)算灰度值分析TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量（目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值）。

1.2.5 免疫組化法對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)進(jìn)行定位 選取固定于4%多聚甲醛溶液中的卵巢、輸卵管和子宮組織塊自來水沖洗24 h，上行酒精脫水，酒苯透明浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm的組織切片，烘片機(jī)上烘片6 h，下行酒精脫蠟，抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法），阻斷（滴加3%H2O2溶液37℃作用10 min），封閉（擦干組織后滴加SPA試劑盒A液作用15 min），一抗反應(yīng)（（Rabbit Anti-TGF-β1 antibody）1∶150稀釋后4℃孵育過夜），添加對(duì)照組（PBS代替一抗），二抗反應(yīng)（滴加二抗SPA試劑盒B液37℃濕盒孵育15min），三抗反應(yīng)（滴加三抗SPA試劑盒C液37℃濕盒孵育15 min），DAB顯色，蘇木精復(fù)染后鹽酸酒精分化、自來水返藍(lán)脫水、透明、樹脂封片，待晾干至于顯微鏡（DP71，Olympus，日本）進(jìn)行拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用ImageJ軟件根據(jù)灰度值分析蛋白表達(dá)量（目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值）。運(yùn)用SPSS21.0對(duì)TGF-β1基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異顯著性進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析（均值兩兩比較），極顯著（P＜0.01），顯著（P＜0.05），結(jié)果以±SE（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，用GraphPad Prism8繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果

2.1 牦牛TGF-β1基因的擴(kuò)增與克隆

以內(nèi)參引物GAPDH、引物D-TGF-β1檢測(cè)牦牛cDNA模板，結(jié)果顯示（圖1），條帶單一，在178 bp、153 bp處有清晰目的條帶，cDNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以TGF-β1為引物，擴(kuò)增牦牛TGF-β1全CDS區(qū)，結(jié)果顯示（圖2），在1 173 bp處出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期大小一致，經(jīng)克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)后，其與參考序列高度一致，將其提交至GenBank，登陸號(hào)為MZ004937。

圖1 D-TGF-β1、GAPDH基因 PCR擴(kuò)增電泳Fig. 1 D-TGF-β1 and GAPDH PCR amplification electrophoresis

圖2 TGF-β1 PCR擴(kuò)增電泳Fig. 2 TGF-β1 PCR amplification electrophoresis

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 TGF-β1基因開放閱讀框分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 牦牛TGF-β1基因開放閱讀框分析結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因全長(zhǎng)1 173 bp，編碼390個(gè)氨基酸。NCBI-BLAST比對(duì)核苷酸相似性結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因與瘤?！疗胀ㄅ＃˙os indicus×Bos taurus）相似性最高為99%以上，與山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）相似性為98%，與家貓（Felis catus）、犬（Canine）相似性最低為91%左右，與瘤?！疗胀ㄅＯ啾?，其核苷酸序列在第1 168位出現(xiàn)差異，所編碼氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔▓D3）。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示（圖4），牦牛TGF-β1基因與普通牛的親緣關(guān)系最近，與瘤?！疗胀ㄅ４沃?，與犬、大熊貓的親緣性最遠(yuǎn)。

圖3 不同物種間TGF-β1基因序列比對(duì)Fig. 3 Sequence alignment of TGF-β1 gene among different species

圖4 TGF-β1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TGF-β1gene

2.2.2 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白分子量大小44.4 kD，理論等電點(diǎn)（pI）8.97，原子總數(shù)6 256，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）52.97，為不穩(wěn)定蛋白。共編碼氨基酸390個(gè)，其中含量最高的氨基酸是亮氨酸（Leu）13.3%，含量最低的氨基酸是色氨酸（Trp）1.8%，帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）40個(gè)，占氨基酸總數(shù)的7.6%；帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）50個(gè)，占氨基酸總數(shù)的12.8%。

2.2.3 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖5-A），該蛋白由3種折疊方式構(gòu)成：α-螺旋90個(gè)氨基酸占23.07%；延伸鏈為97個(gè)氨基酸，占24.87%；無規(guī)則卷曲為203個(gè)氨基酸，占52.05%。牦牛TGF-β1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5-B）與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

2.2.4 牦牛TGF-β1基因編碼蛋白親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析 牦牛TGF-β1蛋白親疏水性分析結(jié)果（圖5-C）表明，疏水性最強(qiáng)為第15位亮氨酸（Leu），分值最高為2.678，親水性最強(qiáng)為第176位天冬酰胺（Asn），分值最低為-2.522，親水性平均系數(shù)（GRAVY）-0.382，為親水性蛋白。TGF-β1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖5-D）表明，TGF-β1蛋白含跨膜區(qū)域，為跨膜蛋白。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果（圖5-E）顯示，有27個(gè)絲氨酸（Ser），6個(gè)蘇氨酸（Thr），4個(gè)酪氨酸（Tyr閾值大于0.5），可能成為蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點(diǎn)。

圖5 牦牛TGF-β1蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig. 5 Results of yak TGF-β1 protein via bioinformatics analysis

2.3 牦牛TGF-β1基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

采用qRT-PCR檢測(cè)牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中TGF-β1基因的表達(dá)量結(jié)果（圖6）顯示，TGF-β1基因在牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中均有表達(dá)。其中，在卵巢和輸卵管中妊娠期表達(dá)量均顯著高于卵泡期和黃體期（P＜0.05），黃體期次之，卵泡期表達(dá)量最低；在子宮中，妊娠期表達(dá)量最高，卵泡期次之，黃體期表達(dá)量最低（P＜0.05）。

圖6 TGF-β1 mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expressions of TGF-β1 mRNA in different tissues

2.4 牦牛TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果（圖7）顯示，TGF-β1蛋白普遍表達(dá)于牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢、輸卵管和子宮中。結(jié)果（圖8）顯示，卵泡期卵巢表達(dá)量顯著高于妊娠期和黃體期（P＜0.05），黃體期次之，妊娠期表達(dá)量最低；妊娠期輸卵管TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著高于黃體期、卵泡期。妊娠期子宮中TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著高于黃體期和卵泡期，卵泡期次之，黃體期最低。

圖7 TGF-β1和GAPDH蛋白在不同組織中的檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Detection results of TGF-β1 and GAPDH protein in different tissues

圖8 TGF-β1蛋白在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative expressions of TGF-β1 protein in different tissues

2.5 牦牛TGF-β1蛋白定位結(jié)果

免疫組化結(jié)果（圖9）顯示（棕褐色為TGF-β1蛋白陽性表達(dá)，與之對(duì)應(yīng)的為陰性表達(dá)）。TGF-β1蛋白在牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢，輸卵管和子宮中均有陽性表達(dá)，在發(fā)情期和妊娠期的同一組織中蛋白表達(dá)部位無明顯差異。在卵巢中主要表達(dá)于卵巢生殖上皮（GE）、卵泡膜細(xì)胞（TF）、卵泡顆粒層（SG）（圖9-A1、圖9-A2）和黃體細(xì)胞（CL）（圖9-B1）；在輸卵管中主要表達(dá)于漿液腺（sg）和黏膜上皮細(xì)胞（EM）（圖9-C1、圖9-C2）；在子宮中主要表達(dá)部位為子宮腺（UG）和子宮內(nèi)膜細(xì)胞（EP）（圖 9-D1、圖9）。

圖9 TGF-β1蛋白在在不同組織中的分布Fig. 9 Distribution of TGF-β1 proteins in different tissues

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出了牦牛TGF-β1基因（GenBank登錄號(hào)：MZ004937），并發(fā)現(xiàn)TGF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢，輸卵管和子宮中均有表達(dá)。研究結(jié)果顯示，牦牛TGF-β1基因ORF全長(zhǎng)為1 173 bp。編碼390個(gè)氨基酸，人和小鼠編碼氨基酸數(shù)也為390個(gè)。TGF-β1蛋白存在37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，含跨膜區(qū)域，為跨膜蛋白。據(jù)報(bào)道，TGF-β通過與跨膜I型（TβRI）2和II型（TβRII）受體結(jié)合來啟動(dòng)下游信號(hào)通路并發(fā)揮其功能［20］?？赡芘c其含跨膜區(qū)相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，成熟型TGF-β1基因在進(jìn)化中高度保守，且人、猴、豬和雞TGF-β1的成熟單體有完全相同的氨基酸序列［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牦牛TGFβ1基因核苷酸序列與普通牛一致性較高，僅在第1 168位出現(xiàn)差異，所編碼氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?，且系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，牦牛TGFβ1基因與犏牛、普通牛和野牦牛的親緣關(guān)系較近，進(jìn)一步說明其高度保守型。

在雌性哺乳動(dòng)物中，原始卵泡池的形成對(duì)維持繁殖力至關(guān)重要。有研究闡明了TGF-β1參與原始卵泡發(fā)育過程［22］。有研究表明，TGF-β1在調(diào)控卵巢體細(xì)胞間的卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間縫隙連接中扮演了重要的角色［23］。在卵泡發(fā)育、閉鎖、成熟、排卵及黃體的形成等生理過程中都發(fā)揮了重要的作用，這些作用與卵巢功能密切相關(guān)。TGF-β1作為多細(xì)胞來源的細(xì)胞因子［24］，有文獻(xiàn)報(bào)道［25-28］稱TGF-β1具有多條信號(hào)通路，在翻譯過程中受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（IL-26、HMGBI、NF-κB、15-LOX-1、CBX7）調(diào)控。因此蛋白和基因在相對(duì)表達(dá)水平上存在差異。文獻(xiàn)報(bào)道［29］TGF-β1參與胚泡著床過程，TGF-β1可促使卵泡顆粒細(xì)胞分化但阻滯其增殖，與體內(nèi)FSH濃度呈負(fù)相關(guān)［30］，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白在卵泡期卵巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃體期和妊娠期。TGF-β1蛋白在卵泡期卵巢中的高表達(dá)及黃體期的下降，可能與其參與卵泡發(fā)育及成熟，受體內(nèi)FSH濃度影響有關(guān)。卵泡連續(xù)的發(fā)育需要卵母細(xì)胞，黃體細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞之間的雙向交流［31］，而TGF-β1可以自分泌或旁分泌的方式通過Smad蛋白家族廣泛地表達(dá)于不同時(shí)期卵泡的卵泡膜細(xì)胞、卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中［32-33］。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白在卵巢中主要分布于顆粒細(xì)胞、卵巢生殖上皮、卵泡膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞，與前人研究一致。進(jìn)一步證明其在卵泡發(fā)育成熟過程中發(fā)揮了重要作用。

輸卵管具有輸送精子、卵子及受精卵的功能，且是精子貯藏、精子獲能、頂體反應(yīng)和受精的場(chǎng)所［34］。有研究發(fā)現(xiàn)輸卵管細(xì)胞可以調(diào)節(jié)合成TGF-β1，TGF-β1在調(diào)節(jié)與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的輸卵管生殖生理學(xué)功能中起重要作用［35］。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在妊娠期相對(duì)表達(dá)量最高。免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1主要表達(dá)于牦牛的輸卵管黏膜上皮，輸卵管粘膜上皮細(xì)胞具有分泌功能，分泌的活性物質(zhì)為胚胎早期發(fā)育提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［36］。TGF-β1在妊娠期的高表達(dá)，可能提示其參與了早期胚胎發(fā)育并誘導(dǎo)輸卵管黏膜上皮細(xì)胞的快速增殖，為早期胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持妊娠環(huán)境。有證據(jù)表明TGF-β1在人類輸卵管、胎盤、子宮內(nèi)膜和胚胎組織中都有表達(dá)［37-39］，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1定位于牦牛的輸卵管黏膜上皮，與學(xué)者研究一致。

子宮是胚胎附植的器官，為胎兒的發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境和必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性中起關(guān)鍵作用，附植失敗的子宮內(nèi)膜中TGF-β1的表達(dá)量會(huì)顯著降低［40］。且有研究結(jié)果表明，TGF-β/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)參與了胚胎植入過程，TGF-β1及其最特異性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Smad3在植入窗口期間在子宮內(nèi)膜中表達(dá)［41］。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在妊娠期子宮的表達(dá)量最高，其在妊娠期的高表達(dá)，可能與其參與胚胎附植及胚胎發(fā)育過程有關(guān)。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，子宮腺可分泌TGF-β1，TGF-β1參與胚胎附植和胚胎發(fā)育過程［29］，且TGF-β1還參與調(diào)節(jié)母體-胚胎免疫反應(yīng)［42-43］。本研究結(jié)果顯示TGF-β1在子宮中主要表達(dá)子宮內(nèi)膜和子宮腺，與學(xué)者研究結(jié)果一致。子宮腺分泌的子宮乳中含糖原等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可供給著床前附植階段胚胎早期所需營(yíng)養(yǎng)［44］。TGF-β1在子宮內(nèi)膜和子宮腺的表達(dá)，可能提示其參與分泌胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并參與附植時(shí)胎兒及母體間的免疫反應(yīng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出了牦牛TGF-β1基因（GenBank登錄號(hào)：MZ004937），牦牛TGF-β1基因ORF全長(zhǎng)為1 173 bp，編碼390個(gè)氨基酸，為跨膜的不穩(wěn)定蛋白。牦牛TGF-β1基因與普通牛的進(jìn)化水平最近，與犬、大熊貓的最遠(yuǎn)。TGF-β1在牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮均有表達(dá)，表達(dá)有差異。TGF-β1蛋白在不同時(shí)期同一組織定位無明顯變化。結(jié)果提示TGF-β1在牦牛發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮中具有重要的生物學(xué)作用，可能參與調(diào)節(jié)牦牛卵泡發(fā)育、成熟及排卵過程，且在早期胚胎發(fā)育、胚胎附植和維持妊娠過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在發(fā)情期和妊娠期的卵巢、輸卵管和子宮中的表達(dá)，有助于進(jìn)一步探討高原哺乳動(dòng)物對(duì)高寒環(huán)境的適應(yīng)性提供理論依據(jù)。