王萬順 付強 魏玉榮 胡新艷 陳俊貞 李澤宇 史慧君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

牛病毒性腹瀉/黏膜?。╞ovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的牛傳染性疾病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為三類動物疫病。BVDV感染范圍廣泛，能夠在牛、羊等多數(shù)偶蹄動物之間傳播，甚至在野生動物中也出現(xiàn)感染。主要以幼齡動物表現(xiàn)明顯，以高溫發(fā)熱、腹瀉、黏膜出現(xiàn)病理性炎癥為主要的臨床癥狀［1-2］。目前該病呈現(xiàn)世界性分布，并在澳大利亞、美國、英國、中國等畜牧業(yè)發(fā)達國家傳播迅速，非致細(xì)胞病變型（noncytopathogenic effect，NCP）BVDV感染早期妊娠母牛造成犢牛持續(xù)性感染（persistent infection，PI），PI牛成為潛在感染源，終身攜帶病毒并且通過自身的唾液、尿液以及乳汁傳播［3-4］。BVDV還能夠?qū)εＴ瓷镏破分腥缪濉鼍?、胚胎、疫苗等造成污染，使得畜牧業(yè)之間的商業(yè)領(lǐng)域損傷嚴(yán)重［5-6］。

Piontek等［7］在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)一種膜內(nèi)多蛋白復(fù)合物，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞單層的相鄰細(xì)胞之間提供頂端細(xì)胞間連接，這種復(fù)合物被稱為緊密連接蛋白（tight junction proteins，TJs）。OCLN作為TJs蛋白重要蛋白之一，主要參與TJs的屏障作用和柵欄作用。OCLN的編碼基因保守，通過對OCLN的cDNA和氨基酸序列的分析，在不同種屬之間的同源性高達90%，在肺臟、腎臟、肝臟、睪丸及腦組織的上皮細(xì)胞中OCLN都能夠高水平表達［8］。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)利用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）干擾OCLN蛋白的表達，可抑制丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）病毒進入人肝癌細(xì)胞Huh7.5.1，沉默OCLN蛋白的表達不會影響其他TJ蛋白JAM、CLDN1 和ZO-1的表達。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)敲除OCLN能夠有效抑制BVDV體外復(fù)制［10］，然而OCLN是否影響B(tài)VDV體內(nèi)復(fù)制尚不清楚，本研究采用慢病毒介導(dǎo)OCLN在BALB/c小鼠過表達，建立動物模型，感染BVDV后檢測OCLN過表達對BVDV體內(nèi)復(fù)制的影響，為研究BVDV的防控機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、動物和病毒 牛腎細(xì)胞（Madin-Darby bovine kidney，MDBK）和人胚腎細(xì)胞HEK-293T購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；4-5周齡健康BALB/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心；BVDV新疆分離株TC株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實驗室保存。

1.1.2 試劑和儀器 QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix購自Qiagen公司；TRIzol細(xì)胞裂解液購自Ambion公司；D2000 DNA Marker（MD114）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒（DP120）、cDNA第一條鏈合成試劑盒（KR103）、DNA瓊脂糖凝膠回收試 劑 盒（DP219）和Taq PCR Master Mix（KT201）購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶Xho I（1094A）和Xba I（1093A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Trypsin-EDTA、高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、馬血清（horse serum，HS）均購自BI公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自Proteintech公司；兔抗OCLN抗體購自Thermo公司；低溫高速離心機Thermo Fisher Scientific公司；實時熒光定量PCR儀（Fast 7500）購自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達載體構(gòu)建

1.2.1.1 引物合成 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中牛OCLN的基因序列（登錄號：NM_001082433.2）設(shè)計OCLN基因擴增引物：OCLN-F1：5′-CCGCTCGAGAT GTCATCCAGGCCTTTTGAAAG-3′和OCLN-R1：5′-T GCTCTAGATGTTTTCCGTCGGTCGTAATCTC-3′；引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.1.2 PCR基因擴增鑒定 收集MDBK細(xì)胞加入適量的TRIzol細(xì)胞裂解液，提取總RNA，測定RNA濃度，并使用cDNA第一條鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以引物OCLN-F和OCLN-R，PCR擴增基因OCLN。PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL、OCLN-F1/R1（10 μmol/L）各0.6 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.8 μL；PCR擴增程序：預(yù)變性94℃ min；變性94℃ 40 s、退火68℃ 40 s、延伸72℃ 90 s、循環(huán)40次；終延伸72℃ 10 min、終止4℃。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，并使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。

1.2.1.3 慢病毒表達載體構(gòu)建 Xho I和Xba I雙酶切pLVML-Myc-MCS-linker-GFP-IRES-Puro和OLCN基因回收產(chǎn)物，電泳檢測后回收載體和目的基因，使用T4 DNA連接酶連接目的基因和載體，置于4℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)過夜，PCR檢測陽性克隆菌落，PCR反應(yīng)條件和程序同1.2.1.2；將陽性克隆菌落送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序鑒定，測序結(jié)果使用Blast進行比對分析并制作進化樹。

1.2.2 慢病毒包裝及滴度測定 使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒分別提取pLVML-Myc-bOCLN-linker-GFP-IRES、pLVML-Myc-Mcs-linker-GFP-IRES-Puro、pSPAX2、pMD2.G質(zhì) 粒，將pLVML-Myc-bOCLNlinker-GFP-IRES-Puro/pLVML-Myc-Mcs-linker-GFPIRES-Puro與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后觀察綠色熒光GFP表達情況，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000 r/min離心5 min后取上清，使用0.45 μmol/L濾器過濾細(xì)胞碎片，病毒懸液轉(zhuǎn)移至Amicon超濾離心管，4℃ 7 800 r/min離心90 min，轉(zhuǎn)移濃縮柱內(nèi)病毒液至EP管，-80℃保存?zhèn)溆?；按照每?.5×105個細(xì)胞的密度將HEK-293T接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入0.5、1、2、5 μL濃縮病毒液，并加入聚凝胺溶液（終濃度為8 μg/mL），慢病毒感染48 h后加入適量4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，DAPI 染色20 min，使用熒光顯微鏡隨機選擇不同視野進行拍照，用ImageJ軟件統(tǒng)計DAPI陽性細(xì)胞及綠色熒光陽性細(xì)胞數(shù)量，按照如下公式計算病毒滴度：病毒滴度（IU/mL）=（綠色熒光細(xì)胞/藍(lán)色熒光細(xì)胞）/加入的病毒液體積×1.5×105×103［11］。

1.2.3 慢病毒感染BALB/c小鼠和BVDV攻毒 將30只4-5周齡BALB/c隨機分為A（0 d）、B（4 d）、C（8 d）、D（10 d）、E（15 d）五組，每組6只，3只為實驗組，3只為對照組。尾靜脈注射5×107IU慢病毒，注射劑量200 μL，連續(xù)注射兩次，每次間隔48 h，第二次注射慢病毒后96 h時，用1.68×105TCID50/只劑量的BVDV進行攻毒；攻毒后0、4、8、10、15 d處死一組小鼠，解剖后采集腎臟、肝臟、 脾臟、肺臟、小腸等組織，提取總RNA和各組織總蛋白；取少量組織浸潤福爾馬林溶液，后續(xù)制作病理切片，觀察病變情況。

1.2.4 qRT-PCR檢測各組織OCLN mRNA水平 稱取1 g各組織，加入液氮研磨后，加入500 μL TRIzol細(xì)胞裂解液，提取各組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測各組織中OCLN mRNA水平。qRT-PCR反 應(yīng) 體 系 為：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL，OCLN-F2/R2（10 μmol/L）各1.4 μL，cDNA 模 板 1.0 μL，QN ROX Reference Dye 0.1 μL，RNase Free ddH2O 6.1 μL；引物為OCLN-F2：5′-ACCTCTCCTCCCGGAGTAAT-3′；OCLN-R2：5′-GCTACCAAAGGCACTTCCTG-3′；qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃ 2 min；95℃ 5 s、60℃ 30 s、40循環(huán)；按照如下公式計算OCLN mRNA水平：2-ΔΔCt=2-［（實驗組目的基因Ct-實驗組內(nèi)參基因Ct）-（對照組目的基因Ct-對照組內(nèi)參基因Ct）］。

1.2.5 Western blot檢測各組織OCLN蛋白表達水平 稱取1 g各組織，加入液氮研磨后加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；分別取80 μg總蛋白使用SDS-PAGE分離總蛋白，并轉(zhuǎn)膜至PVDF，使用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入兔抗OCLN抗體（1∶1 000稀釋）置于4℃孵育過夜，使用PBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），使用ECL化學(xué)發(fā)光底物進行顯色和曝光，并拍攝相應(yīng)的圖片。

1.2.6 qRT-PCR檢測BVDV病毒載量 各組織處理、RNA提取、cDNA合成、qPCR反應(yīng)體系和程序同1.2.1.2。BVDV病毒載量qRT-PCR檢測引物為5′UTR-F：5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′；5′UTR-R：5′-GGAACTCCATGTGCCATGTACA-3′；qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線參照田瑞鑫等［12］報道。

1.2.7 組織病理切片檢測 福爾馬林溶液固定小鼠各組織后，經(jīng)脫水浸蠟、包埋、切片、H&E染色步驟制備病理切片，觀察各組織的病理變化情況。

1.2.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以mean±SD（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。使用SPSS 17.0軟件進行單因素t檢驗分析，使用graphpad prism 5.0進行柱狀圖作圖；*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建

pLVML-Myc-bOCLN-linker-GFP-IRES-Puro和pLVML-Myc-Mcs-linker-GFP-IRES-Puro慢病毒質(zhì)粒圖譜見圖1-A和1-B。使用PCR鑒定單克隆菌落，結(jié)果如圖1-C，PCR擴增OCLN基因后電泳檢測可見大小約為1 566 bp條帶，與OCLN基因大小一致。使用Blast進行分析發(fā)現(xiàn)OCLN基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中牛OCLN基因（登錄號：NM_001082433.2）序列同源性為100%（圖1-D）。

圖1 慢病毒質(zhì)粒圖譜和載體鑒定Fig. 1 Lentivirus plasmid map and vector identification

2.2 慢病毒包裝結(jié)果

分別將過表達質(zhì)粒pLVML-Myc-bOCLN-linker-GFP-IRES-Puro、對照質(zhì)粒pLVML-Myc-Mcs-linker-GFP-IRES-Puro與包裝輔助質(zhì)粒（pSPAX2和pMD2.G）轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集慢病毒懸液，并感染HEK-293T細(xì)胞，感染48 h后發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光，根據(jù)公式計算得出慢病毒滴度為5×108IU/mL（圖2）。

圖2 慢病毒感染HEK-293T細(xì)胞后綠色熒光表達情況檢測Fig. 2 Detection of green fluorescence expression in the HEK-293T cells infected with lentivirus

2.3 qRT-PCR檢測小鼠各組織中OCLN mRNA水平

慢病毒尾靜脈注射BALB/c小鼠，采集各組織提取總RNA，qRT-PCR檢測各組織中OCLN mRNA水平變化。結(jié)果如圖3所示，與對照GFP慢病毒感染相比，OCLN-GFP慢病毒感染BALB/c小鼠96 h后，小腸、肝臟、肺臟和脾臟等組織中OCLN mRNA水平顯著性增加，其中肝臟中OCLN mRNA量最高。

圖3 qRT-PCR檢測各組織中OCLN mRNA表達量Fig. 3 Detection of OCLN mRNA expressions in various tissues by qRT-PCR

2.4 Western blot檢測小鼠各組織中OCLN蛋白表達水平

慢病毒注射BALB/c小鼠96 h后，采集各組織器官，提取總蛋白，Western blot檢測各組織中OCLN蛋白表達水平。結(jié)果如圖4所示，與對照GFP慢病毒感染相比，OCLN-GFP慢病毒感染后各組織中OCLN蛋白表達顯著增加。

圖4 Western blot檢測各組織中OCLN蛋白表達水平Fig. 4 Expressions of OCLN protein in various tissues by Western blot

2.5 qRT-PCR檢測各組織中BVDV載量

慢病毒感染BALB/c小鼠后進行BVDV攻毒處理，不同時間后使用qRT-PCR檢測各組織中BVDV載量。結(jié)果如圖5所示，與對照GFP慢病毒感染相比，BVDV攻毒OCLN-GFP慢病毒感染BALB/c小鼠0和4 d時，各組織中BVDV 5′ UTR拷貝數(shù)未出現(xiàn)明顯的差異；BVDV攻毒后8、10和15 d時，OCLN-GFP慢病毒感染BALB/c小鼠各組織中BVDV 5′ UTR拷貝數(shù)差異逐漸明顯，在攻毒后15 d時，BVDV 5′UTR拷貝數(shù)增加最顯著，表明OCLN-GFP感染BALB/c小鼠造成OCLN蛋白過表達，有助于BVDV載量的增加。

圖5 qRT-PCR檢測各組織中BVDV載量Fig. 5 BVDV loading in various tissue by qRT-PCR

2.6 病理切片檢測BALB/c小鼠各組織病變情況

慢病毒注射BALB/c小鼠后BVDV攻毒，制作組織病理切片并進行H&E染色觀察各組織病變情況。結(jié)果如圖6所示，BALB/c小鼠各組織感染BVDV后都不同程度的病變。肝臟組織大量動、靜脈以及肝竇充血，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，不同程度的顆粒變性、壞死現(xiàn)象；脾臟組織病變主要表現(xiàn)為淤血、組織局部出血，有少量淋巴細(xì)胞浸潤；肺臟組織病變特征主要為出血、淤血、空泡，肺泡間隔顯著增寬，肺泡壞死現(xiàn)象；腎臟組織病變特征主要出血、顆粒變形和少量淋巴細(xì)胞浸潤，皮質(zhì)髓質(zhì)分界模糊，間質(zhì)增生；小腸組織腸絨毛固有層淋巴細(xì)胞浸潤，小腸毛細(xì)血管出血，腸黏膜固有層水腫，腸絨毛上皮細(xì)胞壞死。

圖6 病理切片檢測BALB/c小鼠各組織病變情況Fig. 6 Detection of pathological changes of various tissues in BALB/c mice by pathological section

與對照GFP慢病毒感染相比，BVDV攻毒OCLN-GFP慢病毒感染組各組織病變更為嚴(yán)重。BVDV攻毒4 d時，病變最先出現(xiàn)于肺臟，肺泡壞死出血，炎性細(xì)胞浸潤；其次是肝臟中肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤，其余組織較為輕微；BVDV攻毒10和15 d時，肺臟組織出血嚴(yán)重，肝細(xì)胞大量顆粒變形以及壞死現(xiàn)象出現(xiàn)；肺臟不同程度出血、淤血和空泡，肺泡壞死；腎臟出血，淤血、大量淋巴細(xì)胞浸潤；脾臟炎性細(xì)胞浸潤；小腸上皮細(xì)胞壞死，淋巴細(xì)胞浸潤。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的分化、增殖、遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達中都有TJs的參與［13-16］。TJs功能喪失將導(dǎo)致癌癥、中風(fēng)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、肺疾病和炎癥性腸病等各種疾病的發(fā)生，據(jù)報道，至少有9種不同病毒家族的成員使用緊密連接相關(guān)蛋白作為受體［17］。TJs家族重要蛋白OCLN可作為HCV侵入的關(guān)鍵受體。OCLN主要表達于細(xì)胞膜，其蛋白結(jié)構(gòu)包括2個細(xì)胞外環(huán)（extracellular loops，EL）和4個跨膜區(qū)域（transmembrane，TM）［18］，其中EL2能與HCV囊膜蛋白E2發(fā)生互作，從而介導(dǎo)HCV侵入。BVDV與HCV屬于同科病毒，其復(fù)制過程是否受到OCLN蛋白的介導(dǎo)，進而受OCLN調(diào)控？前期本課題組已通過CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi敲低等技術(shù)敲除/低OCLN在BVDV靶細(xì)胞MDBK中的表達，進而研究其對BVDV復(fù)制影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCLN敲除/低都將嚴(yán)重影響B(tài)VDV在宿主細(xì)胞中復(fù)制，而OCLN是否影響B(tài)VDV體內(nèi)復(fù)制？國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用慢病毒介導(dǎo)OCLN在BALB/c小鼠體內(nèi)過表達，進而研究OCLN過表達對BVDV體內(nèi)復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCLN過表達造成BVDV在BALB/c小鼠體內(nèi)病毒載量顯著性增加，而感染造成的病變更加嚴(yán)重，表明OCLN過表達增加BVDV體內(nèi)復(fù)制。

阮文強等［19］采用3株不同來源的CP型BVDV毒株，通過BALB/c小鼠為實驗動物進行攻毒，病理切片可見攻毒小鼠肝臟和腸道炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞脫落壞死，脾臟脾內(nèi)吞噬細(xì)胞增多和脾小結(jié)反應(yīng)性增生，肺泡萎縮和出血。田瑞鑫等［12］BVDV攻毒小鼠之后病理切片可見大部分臟器出現(xiàn)不同程度組織病變，心臟及肝臟組織局部出血、淤血，心肌細(xì)胞壞死癥狀明顯，肺臟及脾臟顆粒變形并伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤，小腸上皮細(xì)胞壞死并有輕微出血現(xiàn)象。本實驗在攻毒BVDV之后，與GFP組小鼠對比，OCLN-GFP組各個臟器均出現(xiàn)出血、淤血以及淋巴細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象且與對照組相比更為嚴(yán)重，根據(jù)病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最先出現(xiàn)病變的部位在肺臟及肝臟，與BVDV感染小鼠體內(nèi)的研究報道相似，因?qū)嶒瀯游镏車h(huán)境進行控制可排除繼發(fā)感染因素造成動物組織的病變。

OCLN基因作為一種保守基因，在不同種屬之間同源性高達90%，且OCLN mRNA能夠在肺、腎和肝中高水平表達［8］。采用慢病毒作為載體進行介導(dǎo)，通過慢病毒載體在宿主體內(nèi)介導(dǎo)外源基因能夠穩(wěn)定表達且不會出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象的特性。實驗通過采集慢病毒注射96 h后的RNA和蛋白使用qRTPCR和Western Blot技術(shù)來測定動物體內(nèi)OCLN基因，與GFP組相比，肝、脾等組織均出現(xiàn)OCLN基因過表達情況，能夠成功建立動物模型，為BVDV感染動物之后與OCLN基因的關(guān)系提供前期實驗基礎(chǔ)。田瑞鑫等［12］利用慢病毒介導(dǎo)pre-miR-29b在小鼠體內(nèi)，采用相同時間段進行檢測，并成功建立BALB/c小鼠模型。該結(jié)果與本研究類似。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)OCLN能與BVDV囊膜蛋白E2發(fā)生互作，而具體OCLN哪些基序或位點與BVDV E2結(jié)合尚不清楚，亟待研究探索。

4 結(jié)論

本研究通過慢病毒介導(dǎo)OCLN在BALB/c體內(nèi)過表達，發(fā)現(xiàn)OCLN過表達促進BVDV體內(nèi)復(fù)制，將為BVDV感染機制研究及藥物作用靶點提供依據(jù)。