吳延龍，崔軼霞，劉宇宏，張 弓

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥物科，陜西 延安 716000)

隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，以PM2.5為主的空氣顆粒物對環(huán)境產(chǎn)生的污染日趨嚴(yán)峻，統(tǒng)計結(jié)果表明，我國僅2012年大概有100萬人因PM2.5導(dǎo)致早死和2 400萬人因此而致殘，其中肺纖維化是導(dǎo)致早死和傷殘的主要病因[1]。肺纖維化是一種嚴(yán)重危害人類健康的肺間質(zhì)疾病，是各種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)展至肺癌晚期的必經(jīng)階段，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是目前臨床上公認(rèn)的不治之癥，診斷出該病的患者平均壽命為3到5年[2]。多種因素可以誘發(fā)肺纖維化的產(chǎn)生，比如藥物副作用、PM2.5、病毒、化學(xué)試劑等[3-4]。目前，未有特異性治療肺纖維化的特效藥物，有兩款藥物比菲尼酮和尼達(dá)尼布用于緩解肺纖維化病情，無逆轉(zhuǎn)纖維化作用，并伴隨有嚴(yán)重的光敏和胃腸等毒副作用[5]。因此，探究新的治療肺纖維化的藥物具有重要的現(xiàn)實意義和實際價值。

藏藥巴丫巴，又名蘭石草，為玄參科蘭石草屬多年生矮小草本，廣泛分布于青海、西藏、甘肅等省區(qū)，生于海拔2 000～4 500米的草地、疏林中或溝谷旁。據(jù)《藏藥志》記載[6]，蘭石草性寒，味甘、苦，入肺經(jīng)，具有治療肺炎、肺膿瘍、肺膿腫等病癥。以蘭石草等二十五味藏藥制成二十五味肺病丸，臨床上適用于各種肺病引起的咳嗽、胸脅痛、發(fā)燒等，對陳舊性肺結(jié)核、慢性肺炎、肺氣腫等熱性肺病的療效明顯[7]，但蘭石草的抗肺纖維化活性卻未見報道，本研究對其抗肺纖維化活性進(jìn)行研究，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級昆明種小鼠100只，雌雄各半，8～9周齡，體質(zhì)量19～26 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2015-0010。

1.2 儀器 HM525冷凍切片機(jī)[斯沃德(北京)儀器設(shè)備有限公司]；FM-200倒置熒光顯微鏡(上海普丹光學(xué)儀器有限公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；手動移液槍(德國Eppendorf公司)。

1.3 試劑 羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE試劑盒、TNF-α和IL-1β檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；Masson試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)；山羊抗小鼠TGF-β1和α-SMA抗體、DAPI(美國Santa Cruz公司)；FITC標(biāo)記二抗(北京奧維亞生物技術(shù)有限公司)。

1.4 藥物 蘭石草購于青海省西寧市康樂藥材市場。比菲尼酮膠囊劑(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，批號H20133376)；注射用博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司，批號H20055883)。

1.5 藥液制備 藥材粉碎后配制成40 mg/mL水煎液，比菲尼酮采用生理鹽水配制成50 mg/mL，博來霉素采用生理鹽水配制成5 mg/kg。

1.6 分組、建模與給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、陽性藥組及蘭石草高、低劑量組，每組20只，雌雄各半。采用Szapiel法[8]建立肺纖維化模型，小鼠麻醉(10%水合氯醛)后固定，頸部消毒，沿頸中部剪開約1 cm，用鈍性器件分離到氣管部位，模型組、陽性藥組、蘭石草組用微型注射器向氣管內(nèi)緩慢滴注5 mg/kg博來霉素，而空白組滴注等體積生理鹽水，滴注結(jié)束后縫合切口。造模7 d后，陽性藥組小鼠每天灌胃100 mg/kg比菲尼酮，空白組、模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)3周。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 體質(zhì)量和肺系數(shù) 建模1周后小鼠稱定體質(zhì)量，給藥3周后處死前再次稱定體質(zhì)量。脫頸處死小鼠，摘取肺組織稱定質(zhì)量，以肺組織濕重與體質(zhì)量之比為肺系數(shù)。

1.7.2 血清炎癥因子水平 小鼠麻醉，眼球取血，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取上部血清，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.7.3 HE、Masson染色 小鼠肺組織稱定質(zhì)量后剪取右肺，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，取一小葉，用OCT將其包埋于樣品托盤上，在-40 ℃下冷凍10 min，切片5 μm，進(jìn)行HE、Masson染色。

1.7.4 免疫熒光染色 5%BSA封片2 h，小鼠肺組織切片滴加100 μL用5%BSA稀釋的TGF-β1和α-SMA一抗(1∶100)，在4 ℃下孵育過夜，用TBST緩沖液于搖床上搖晃洗片3次，每次10 min，在室溫、避光條件下孵育FITC標(biāo)記的二抗(1∶500)2 h，DAPI對細(xì)胞核染色3 min，TBST緩沖液搖晃洗片4次，每次10 min，30%、50%、70%乙醇及無水乙醇脫水后二甲苯透化，封片，在顯微鏡下觀察(先以低倍鏡觀察整個切片大體情況，然后提高倍鏡，按從左到右、從上到下順序依次仔細(xì)觀察)。

2 結(jié)果

2.1 蘭石草對小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)；與模型組比較，蘭石草高劑量組小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)。博來霉素可明顯誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生水腫，增加小鼠肺質(zhì)量(P<0.05)，而高劑量蘭石草可降低肺質(zhì)量(P<0.05)。與空白組比較，模型組小鼠肺系數(shù)升高(P<0.05)，高劑量蘭石草可降低小鼠肺系數(shù)(P<0.05)。

表1 蘭石草對小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)的影響

2.2 蘭石草對小鼠血清炎癥因子水平的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組小鼠TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型組比較，蘭石草高劑量組小鼠TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)。

2.3 蘭石草對小鼠肺組織病變和膠原沉積的影響 如圖1A所示，空白組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，無間質(zhì)增生以及免疫細(xì)胞間質(zhì)浸潤等病理特征；模型組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的坍塌堆積，并且有嚴(yán)重的間質(zhì)增生病理特征，組織間質(zhì)可觀察到有單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤；與模型組比較，蘭石草高劑量組小鼠肺組織肺泡塌陷程度明顯減輕，免疫細(xì)胞浸潤降低，間質(zhì)增生同樣減弱，但其改善作用明顯弱于陽性藥，而蘭石草低劑量組具有一定的減緩作用，但不明顯。如圖1B所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織膠原蛋白沉積較嚴(yán)重，呈現(xiàn)較大面積和較深的藍(lán)染效果，蘭石草高劑量組、陽性藥組可明顯減少膠原蛋白的沉積，表現(xiàn)為較少和較淺的藍(lán)染效果，但低劑量蘭石草無明顯作用。如圖1C所示，高劑量蘭石草可明顯緩解小鼠肺纖維化病癥。如圖1D所示，模型組小鼠肺組織羥脯氨酸水平高于空白組(P<0.05)，而蘭石草高劑量組其水平降低(P<0.05)，蘭石草低劑量給藥組無明顯改善作用。

表2 蘭石草對小鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響

2.4 蘭石草對小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響 如圖2所示，模型組小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)高于空白組(P<0.05)，而蘭石草高劑量組其表達(dá)降低(P<0.05)。

2.5 蘭石草對小鼠肺組織α-SMA表達(dá)的影響 如圖3所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織α-SMA表達(dá)升高(P<0.05)，而蘭石草高劑量組其表達(dá)降低(P<0.05)。

注：與空白組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖1 蘭石草對小鼠病理組織改善作用和羥脯氨酸含量的抑制作用

注：A為TGF-β1免疫熒光病理組織切片，B為TGF-β1相對表達(dá)量。與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖2 蘭石草對小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響

注：A為α-SMA免疫熒光病理組織切片，B為α-SMA相對表達(dá)量。與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖3 蘭石草對小鼠肺組織α-SMA表達(dá)的影響

3 討論

肺纖維化可使小鼠體質(zhì)量明顯減輕，合理地增加肺纖維化小鼠體質(zhì)量對于評價藥物的抗肺纖維化活性具有一定的參考意義[9]。高劑量蘭石草可增加肺纖維化小鼠體質(zhì)量，但是增加趨勢弱于空白組小鼠，說明高劑量蘭石草具有一定的抗纖維化潛力；模型組小鼠肺組織質(zhì)量高于空白組，說明出現(xiàn)肺水腫病癥，高劑量給藥組小鼠肺質(zhì)量降低，緩解肺水腫情況；肺纖維化小鼠的肺系數(shù)明顯增大，高劑量蘭石草可以通過提高肺纖維化小鼠體質(zhì)量同時減輕肺纖維化小鼠的肺水腫從而降低肺系數(shù)，減緩肺纖維化作用。

炎癥是引發(fā)肺纖維化的關(guān)鍵途徑，炎癥因子均可直接或間接的促進(jìn)肺組織產(chǎn)生纖維化。TNF-α具有非常強(qiáng)烈的促炎癥作用，且在單核巨噬細(xì)胞中，TNF-α可以直接促進(jìn)促纖維化因子TGF-β1的大量產(chǎn)生，從而引發(fā)肺纖維化[10]。IL-1β主要通過調(diào)控IL-17的表達(dá)促進(jìn)纖維化的產(chǎn)生[11]，也可直接促進(jìn)肺纖維化的產(chǎn)生[12]。高劑量蘭石草對TNF-α和IL-1β具有較強(qiáng)抑制作用，該藥物可能是通過抑制炎癥而發(fā)揮抗肺纖維化的活性。

高劑量蘭石草可抑制肺組織羥脯氨酸的表達(dá)從而抑制肺組織的膠原蛋白沉積。表達(dá)膠原蛋白等的細(xì)胞外基質(zhì)主要由肺肌成纖維細(xì)胞完成，α-SMA是肺肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。通過抑制肺肌成纖維細(xì)胞的增殖可以實現(xiàn)抑制肺纖維化的作用[13]，高劑量蘭石草可明顯抑制α-SMA的表達(dá)，提示蘭石草可能通過抑制肺肌成纖維細(xì)胞的增殖而實現(xiàn)抑制肺纖維化的作用。

TGF-β1可通過激活TGF-β1/Smads信號通路促使肺纖維化形成；TGF-β1還可激活上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞向肺肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大量膠原蛋白表達(dá)于肺組織[14]。高劑量蘭石草可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)抑制肺肌成纖維細(xì)胞的增殖的活性，從而表現(xiàn)出抗肺纖維化的活性。結(jié)果表明高劑量蘭石草在小鼠體內(nèi)具有一定的抗肺纖維化活性，其機(jī)制可能與抑制炎癥和肺肌成纖維細(xì)胞的增殖進(jìn)而抑制纖維化和膠原沉積有關(guān)。