余 寧，周新燕，張 念，余 丹，楊 碩，葉樹鳴

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的以氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病，其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺組織對(duì)煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎性反應(yīng)有關(guān)[1]，其發(fā)病以炎癥機(jī)制為核心，有多種因素的介入包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、內(nèi)皮素1(endothelin 1，ET-1)等炎癥因子和轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)和STAT6，引起氣道、肺實(shí)質(zhì)與肺血管的炎癥反應(yīng)及結(jié)構(gòu)重塑，導(dǎo)致肺組織的損傷[2-4]。

中醫(yī)藥在治療COPD方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者，以化痰活血降氣法治療，可以降低氣道局部和全身的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平，減輕呼吸道局部和全身的炎癥反應(yīng)水平，取得良好的臨床療效[5]，現(xiàn)通過觀察氣管內(nèi)滴注LPS聯(lián)合煙熏COPD模型大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺功能、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、ET-1的水平和肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討化痰活血降氣法治療慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCKX(京)2016-0002。

1.2 藥物 化痰活血降氣方顆粒劑由丹參(批號(hào) 18080028)30 g、赤芍(批號(hào)18040038)10 g、桃仁(批號(hào)18060087)10 g、杏仁(批號(hào) 18060087)10 g、蘇子(批號(hào)18080061)10 g、款冬花(批號(hào)18020095)10 g、瓜蔞皮(批號(hào)18050010)10 g、浙貝母(批號(hào) 18040054)10 g、黃芩(批號(hào)18030117)10 g、魚腥草(批號(hào) 17100130)30 g、苦參(批號(hào)18020100)10 g、麻黃(批號(hào)17050111)10 g組成，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)。醋酸潑尼松片(華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20180505)。

1.3 試劑 大鼠TNF-α、IL-1β、ET-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)L-2880)；兔多克隆抗體GAPDH購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司(貨號(hào)AB-P-R001)；兔多克隆抗體STAT4(貨號(hào)51070-2-AP)、兔多克隆抗體STAT6(貨號(hào)51073-1-AP)均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；黃鶴樓牌香煙購(gòu)自甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司。

1.4 儀器 AniRes動(dòng)物肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司)；ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE公司)；FlexStation 3型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；T8-1型磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)。

2 方法

2.1 COPD模型制備 參照文獻(xiàn)[6]方法加以改良后，采用氣管內(nèi)滴注LPS加煙熏法建立COPD大鼠模型，分別于第1、14天往大鼠氣管內(nèi)滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13、15～28天，每天上午將大鼠放置在48 L玻璃密閉箱內(nèi)，持續(xù)熏黃鶴樓牌香煙霧30 min，每只大鼠使用1支，每天1次。

2.2 分組及給藥 36只健康雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及化痰活血降氣方高、中、低劑量組，每組6只。空白組大鼠不予任何處理，其余各組均建立COPD模型?；祷钛禋夥脚R床常規(guī)用量160 g/d(按生藥計(jì))，醋酸潑尼松片臨床常規(guī)用量50 mg/d，按照人與動(dòng)物體表面積換算法計(jì)算[7]，造模成功后按28.8、14.4、7.2 g/kg生藥劑量分別給高、中、低劑量組大鼠灌胃化痰活血降氣方，陽(yáng)性對(duì)照組給予灌胃醋酸潑尼松片劑量為4.5 mg/kg，正常組和模型組灌胃給予等容量蒸餾水，持續(xù)給藥28 d。

2.3 大鼠肺功能的檢測(cè) 灌胃給藥結(jié)束后用AniRes動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的肺功能指標(biāo)包括0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量比值百分?jǐn)?shù)(FEV0.3/FVC)、呼氣流量峰值(PEF)。

2.4 肺組織與病理形態(tài)學(xué)觀察 大鼠處死后，結(jié)扎未灌洗的左肺取肺組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，蠟塊4 μm切片后脫蠟水化，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，透明后中性樹膠封片，100倍及200倍光鏡觀察。

2.5 ELISA法檢測(cè)大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、ET-1水平 收集大鼠肺泡灌洗液(BALF)，3 000 r/min離心10 min，取各組大鼠BALF上清液按照ELISA試劑盒說明操作，計(jì)算TNF-α、IL-1β、ET-1水平。

2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達(dá) 將少量剪碎的組織置于2 mL EP管中，充分裂解30 min后，在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液保存。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取蛋白樣本凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗GAPDH(1∶1 000)、STAT4(1∶1 000)、STAT6(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗滌5次，加入二抗(1∶50 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗滌5次，ECL試劑顯色曝光,用BandScan分析灰度值。

2.7 免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織STAT4、STAT6蛋白表達(dá) 各組大鼠肺組織經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、脫蠟、抗原修復(fù)后，添加3%過氧化氫室溫孵育15 min，洗滌3次后加血清室溫封閉30 min，甩干后加一抗(稀釋比例為1∶100)4 ℃孵育15 h，PBS沖洗3次后加酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗4次滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染后PBS浸洗返藍(lán)，脫水分片鏡檢，棕黃色或棕褐色為目標(biāo)蛋白。觀察每張切片4個(gè)高倍視野(×400)，通過圖像分析軟件Image J軟件分析每個(gè)視野的平均光密度(MOD)值，取平均值，整理數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 化痰活血降氣方對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)的影響 空白組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)基本完整，肺血管壁未見明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，少量散在的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠氣管上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增生，管腔內(nèi)可見分泌物，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺血管壁增厚，肺泡間隔變窄并斷裂，融合成較大的囊腔；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)的破壞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺泡間的融合均較前改善，但肺血管壁仍可見明顯增厚；化痰活血降氣方高劑量組大鼠支氣管上皮細(xì)胞的破壞較模型組減輕，血管壁增厚不明顯，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及肺泡融合擴(kuò)張明顯減輕，與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，中劑量組肺組織病理變化較模型組稍有減輕，低劑量組病理學(xué)變化接近模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色圖(×100)

3.2 化痰活血降氣方對(duì)大鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及化痰活血降氣方各劑量組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，化痰活血降氣方高劑量組FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平無無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺功能

3.3 化痰活血降氣方對(duì)大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及化痰活血降氣方低劑量組大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。各組間比較，以化痰活血降氣方高劑量組療效最優(yōu)，其降低TNF-α、ET-1水平作用與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子水平

3.4 化痰活血降氣方對(duì)大鼠肺組織中的STAT4、STAT6蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及化痰活血降氣方各劑量組STAT4、STAT6表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。各組間比較，以化痰活血降氣方高劑量組療效最優(yōu)，與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達(dá)(±s，n=6)

注：A為空白組，B為模型組，C為陽(yáng)性對(duì)照組，D～F為化痰活血降氣方高、中、低劑量組。圖2 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達(dá)

3.5 化痰活血降氣方對(duì)大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達(dá)的影響 免疫組化染色后STAT4、STAT6陽(yáng)性表達(dá)在鏡下表現(xiàn)為棕黃色顆粒。與空白組比較，模型組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及化痰活血降氣方各劑量組STAT4、STAT6表達(dá)均降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表4、圖3～4。

表4 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達(dá)

圖3 各組大鼠肺組織中STAT4表達(dá)(免疫組化，×400)

圖4 各組大鼠肺組織中STAT6表達(dá)(免疫組化，×400)

4 討論

COPD屬中醫(yī)“喘病”“肺脹”等病，中醫(yī)認(rèn)為“痰”“瘀”是其關(guān)鍵病理因素，痰瘀阻肺，肺氣不降始終是本病的主要病機(jī)，化痰活血降氣方以赤芍、桃仁、丹參活血化瘀；杏仁、蘇子利肺降氣；炙麻黃宣肺平喘；款冬花降氣化痰；全瓜蔞、浙貝母、黃芩、魚腥草、苦參清熱化痰，該方化痰、活血、降氣三法并施，使本病盡快進(jìn)入緩解期，促進(jìn)正氣的恢復(fù)，改善體質(zhì)，減少再次發(fā)作，在前期臨床觀察證實(shí)療效顯著，現(xiàn)通過大鼠實(shí)驗(yàn)研究探討其作用機(jī)制。

COPD模型組大鼠肺組織病理切片可見氣道黏膜上皮細(xì)胞破壞，杯狀細(xì)胞增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔變窄并斷裂，血管壁增厚，符合COPD的病理學(xué)特點(diǎn)，提示氣管內(nèi)滴注LPS聯(lián)合煙熏法COPD建模成功。與模型組比較，化痰活血降氣方高劑量組炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及肺泡融合擴(kuò)張明顯減輕，中劑量組肺組織炎性改變也有所減輕，并且高劑量組的抗炎作用與醋酸潑尼松相當(dāng)，佐證了化痰活血降氣方可以通過抗炎和減輕肺組織重構(gòu)治療COPD。

肺功能檢查是診斷COPD的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，F(xiàn)EV1和FEV1/FVC是提示氣流受限和COPD嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)，PEF能夠反映氣道阻塞程度，因大鼠的呼吸頻率比人快，所以選用 FEV0.3/FVC來代替 FEV1/FVC[9]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF較空白組降低，客觀指標(biāo)提示氣管內(nèi)滴注LPS聯(lián)合煙熏法COPD建模成功，經(jīng)化痰活血降氣方治療后都有不同程度的回升，其中以高劑量組的療效最優(yōu)，與醋酸潑尼松療效相當(dāng)，所以化痰活血降氣方可以改善肺功能，減輕氣道阻塞。

炎癥細(xì)胞參與了慢性阻塞性肺病的病理過程，釋放多種炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)損傷和修復(fù)的反復(fù)循環(huán)[10]。其中TNF-α是單核-巨噬細(xì)胞所形成的單核因子，是在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的有效激活劑[11]，并且能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放蛋白水解酶破壞肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮[12]。IL-1β也是COPD的主要促炎因子，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道周圍募集，不斷加重炎癥反應(yīng)，并且引起支氣管黏膜水腫，腺體分泌增多，加重氣道阻塞，使氣流受限進(jìn)一步惡化[13-14]。ET-1是由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)源性血管收縮劑[15]，有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，引起血管壁增厚及管狹窄，血管收縮和細(xì)胞增殖導(dǎo)致血管重塑[16]，同時(shí)ET-1參與NF-κB的激活及其他促炎細(xì)胞因子(包括TNF-α)的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1炎癥因子較空白組均升高，經(jīng)化痰活血降氣方治療后都有不同程度的降低，其中以高劑量組的療效最優(yōu)，與醋酸潑尼松療效相當(dāng)，所以化痰活血降氣方可通過降低肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、ET-1的水平來減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，并且ET-1水平降低可以減輕肺血管重塑，IL-1β水平的降低可以緩解支氣管粘膜水腫，減輕氣道阻塞，阻止COPD病情加重。

近年來相關(guān)研究表明Th1/Th2功能平衡在肺部疾病中起關(guān)鍵作用[18]，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞可通過分泌相關(guān)的因子，引發(fā)機(jī)體的一系列促炎與抗炎反應(yīng)。Th1細(xì)胞主要分泌INF-γ等炎癥因子，INF-γ激活中性粒細(xì)胞引起肺部炎癥反應(yīng)，其轉(zhuǎn)錄因子STAT4蛋白能夠誘導(dǎo)Th0向Th1分化，并且具有促炎作用[19-20]。Th2細(xì)胞分泌IL-4等抑炎因子，可引起免疫細(xì)胞對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)，減輕肺部炎癥，并且能夠抑制Th1細(xì)胞增殖作用，其轉(zhuǎn)錄因子STAT6蛋白能誘導(dǎo)Th0向Th2的分化，具有免疫調(diào)節(jié)和抑炎作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠STAT4蛋白表達(dá)升高，STAT6蛋白表達(dá)降低，經(jīng)化瘀活血降氣方治療后，STAT4蛋白表達(dá)有不同程度降低，STAT6蛋白表達(dá)有不同程度的提升，均以化痰活血降方高劑量組為最優(yōu)，其作用與醋酸潑尼松片相當(dāng)。所以化痰活血降氣方可以通過抑制STAT4蛋白表達(dá)使Th0向Th1細(xì)胞分化減弱，減少INF-γ等促炎因子的分泌，減輕肺部炎癥反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)STAT6蛋白表達(dá)，加強(qiáng)Th0向Th2細(xì)胞分化，增加IL-4等抑炎因子的分泌，有助于Th1/Th2恢復(fù)平衡，達(dá)到治療慢性阻塞性肺疾病的作用。

綜上所述，化痰活血降氣方可通過降低BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1等炎癥因子水平，抑制STAT4蛋白表達(dá)，促進(jìn)STAT6蛋白表達(dá)，從而有助于Th1/Th2恢復(fù)平衡，抑制氣道炎癥反應(yīng)、修復(fù)肺泡間的融合、緩解血管壁增厚，改善COPD大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，證實(shí)化痰活血降氣方確能有效抑制COPD的炎癥反應(yīng)，阻止病情加重。