李怡萍，楊麗麗，鄭 昱，周 鹽，黃 萍，鄭培永，宋海燕*

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脾胃病二科，上海 200032)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)包含了從單純肝脂肪變到非酒精性脂肪性肝炎的肝臟脂質(zhì)異常沉積的相關(guān)疾病[1]，在成年人發(fā)病率為20%～33%，在肥胖人群高達75%[2]。NAFLD與代謝綜合征、2型糖尿病互為因果[3]，可進一步引發(fā)全身心腦腎血管疾病，已成為影響人類健康的主要慢性肝病之一[4]。由于NAFLD病理機制復雜，且是一種高度異質(zhì)性疾病，目前臨床仍然缺乏明確有效的治療方法。

肝臟攝取的游離脂肪酸增多，脂肪酸氧化分解減少等造成脂質(zhì)在肝細胞中過度沉積導致肝細胞發(fā)生脂肪變[5]，因此脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和沉默調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulater 1，SIRT1)信號通路是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要通路，其活化異常是NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[6-9]。

三子養(yǎng)親湯，出自《韓氏醫(yī)通》，由萊菔子、紫蘇子和白芥子三味藥組成，具有順氣降逆、化痰消滯的功效[10]。中醫(yī)學者依據(jù)“辨證論治、異病同治”的治療思想，基于痰濕瘀阻互結(jié)、氣機郁滯的共同病機，以行氣化瘀、痰瘀同治為治療原則，采用三子養(yǎng)親湯治療脂肪肝、高脂血癥，取得較好療效[11-13]，但相關(guān)臨床試驗和動物實驗依據(jù)未見報道，其作用的生物學機制也不明確。因此本研究擬通過高脂飲食誘導建立NAFLD小鼠模型，觀察三子養(yǎng)親湯干預NAFLD的作用，并基于AMPK/SIRT1對脂質(zhì)代謝的調(diào)控進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物與飼料 5周齡SPF級雄性C57BL/6 J小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院SPF級動物房，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度20～24 ℃，相對濕度45%～65%，晝夜光照12 h/12 h?；A飼料(35%能量來源于脂肪)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，高脂飼料(60%能量來源于脂肪)購自美國Research diet公司。

1.2 藥物 三子養(yǎng)親湯組方藥材炒萊菔子(上海虹橋中藥飲片有限公司，產(chǎn)地甘肅，批號190618)、炒紫蘇子(上海華濟藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地浙江，批號2019062903)、炒白芥子(上海華濟藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地山東，批號2019062202)，加水煮沸2次，藥液過濾并濃縮，于4 ℃保存?zhèn)溆?。黃連素(美國Sigma公司，批號SLBB2771V，純度≥99%)；美能(復方甘草酸苷片，日本米諾發(fā)源制藥株式會社，批號18125)。

1.3 試劑 AMPK抗體(批號5831)、p-AMPK(批號2535)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)(批號3676)、p-ACC(批號11818)均購自美國Cell Signaling Technology公司；脂酰輔酶A氧化酶1(acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1)(批號00043617)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmityl transferase 1，CPT-1 A)(批號00056856)、β-actin(批號10001832)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SIRT1(英國Abcam公司，批號GR3200692-2)。

1.4 儀器 FastPrep-24型均質(zhì)器(美國MP Biomedicals公司)；CPA3235型電子天平(德國Sartorius公司)；StepOne Plus型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，SynergyH4型酶標儀(美國Bio-Tek公司)；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 造模及給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為對照組6只，造模組24只。按照文獻[14]報道，高脂飲食喂養(yǎng)16周，可導致小鼠肝組織出現(xiàn)明顯脂肪變性，胰島素抵抗等NAFLD相關(guān)表征。本實驗采用高脂飲食喂養(yǎng)22周，建立NAFLD小鼠模型，對照組給予正常飼料。22周造模完成后造模組根據(jù)體質(zhì)量采用區(qū)組隨機的方法分為模型組、三子養(yǎng)親湯組、黃連素組和美能組，每組各6只。三子養(yǎng)親湯用藥劑量依據(jù)《中藥藥理學研究方法學》計算，按照成人臨床常規(guī)使用劑量進行等效劑量計算得小鼠給藥劑量為3.51 g/kg生藥量；黃連素劑量依據(jù)文獻報道及課題組前期實驗摸索[15-16]，采用100 mg/kg；美能藥物使用劑量按照臨床成人使用劑量進行人鼠等效換算為0.35 g/kg。用藥組予以相應藥物灌胃，對照組及模型組給予生理鹽水灌胃，每周記錄體質(zhì)量。藥物干預8周后處死，取肝臟稱定質(zhì)量，并收集血清及肝組織樣本檢測相關(guān)指標。

2.2 血脂檢測 末次給藥12 h后，小鼠禁食12 h，眼球取血，血液靜置30 min，常溫3 000 r/min 離心15 min，分離得血清。血清送至上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院檢驗科，應用全自動生化儀檢測LDL-c、HDL-c、TC、TG水平，所需相關(guān)試劑均購自瑞士Roche公司。

2.3 HE染色檢測肝組織病理學變化 取5 mm×5 mm小鼠肝組織于4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，進行脫水、石蠟包埋、切片。將5 μm組織切片按照標準流程進行HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 油紅O染色檢測肝臟脂肪變性程度 取5 mm×5 mm小鼠肝組織，4%中性多聚甲醛溶液中固定，30%蔗糖脫水，OCT包埋后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。制?0 μm肝組織冰凍切片，油紅O染液(異丙醇溶解的0.5%油紅O儲存液，使用前以3∶2加水稀釋并過濾)染色10 min，用85%甘油封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 RT-qPCR檢測肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達 應用Trizol法提取小鼠肝組織RNA，用ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；蛐蛄型ㄟ^Blast網(wǎng)上驗證，引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見表1。選用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒，在StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進行擴增反應，PCR擴增條件為95 ℃ 30 s變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s退火和延伸，重復40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT法分析計算基因相對表達量。

表1 引物序列

2.6 Western blot檢測肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達 稱取肝組織100 mg，加入RIPA裂解液，使用均質(zhì)器進行組織勻漿，冰上靜置30 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白采用10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗4 ℃搖床過夜孵育。TBST洗膜后，加入相應二抗，繼續(xù)室溫孵育2 h，應用化學發(fā)光法顯影。采集條帶圖片后用圖像分析軟件Image J分析各條帶光密度值，通過目的條帶與內(nèi)參(β-actin)光密度比值進行半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量的影響 如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組及黃連素組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量均降低(P<0.05，P<0.01)，美能組小鼠體質(zhì)量有降低趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量的影響

3.2 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠血脂的影響 如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組、黃連素組及美能組小鼠血清TC、HDL-c、LDL-c水平均降低(P<0.05，P<0.01)；各組TG水平均無明顯變化(P>0.05)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠血脂的影響

3.3 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠肝組織病理的影響 如圖3所示，對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞呈條索狀排列；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，在中央靜脈周圍彌漫性分布大泡性為主的脂肪變性，伴有炎性細胞浸潤，并出現(xiàn)肝細胞氣球樣變性；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組、黃連素組小鼠肝組織病理變化得到明顯改善，脂肪變性程度顯著減輕，無明顯炎性細胞浸潤灶，美能組小鼠病理變化有所改善，但療效不明顯。

圖3 各組小鼠肝組織HE染色(×200)

3.4 三子養(yǎng)親湯對NAFLD小鼠肝組織脂肪變程度的影響 如圖4所示，對照組小鼠肝組織僅見少量紅色小脂滴；模型組小鼠肝組織可見彌漫性分布的紅色脂滴浸潤，脂滴體積較大，部分融合成片；三子養(yǎng)親湯組小鼠肝組織脂滴含量顯著減少，且脂滴體積顯著減小。

圖4 小鼠肝組織油紅O染色(×200)

3.5 三子養(yǎng)親湯調(diào)控AMPK/SIRT1信號通路 如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中AMPK蛋白磷酸化表達和SIRT1 mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組小鼠AMPK蛋白磷酸化表達和SIRT1 mRNA和蛋白表達均升高(P<0.01)。

注：A為AMPK、SIRT1蛋白表達；B為SIRT1 mRNA表達。與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖5 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1的表達

3.6 三子養(yǎng)親湯對AMPK/SIRT1調(diào)控的脂質(zhì)代謝相關(guān)分子表達的影響 如圖6A所示，與對照組比較，模型組p-ACC、脂肪酸氧化分子CPT-1 A、ACOX1蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組p-ACC、CPT-1 A、ACOX1蛋白表達均升高(P<0.01)。如圖6B所示，與對照組比較，模型組PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表達均降低(P<0.01)，F(xiàn)ASN mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，三子養(yǎng)親湯組PPARα、CPT-1 A、PGC-1α mRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)，F(xiàn)ASN mRNA表達降低(P<0.01)。

4 討論

三子養(yǎng)親湯是治療頑固性咳嗽、慢性阻塞性肺炎、慢性支氣管炎等肺系病癥的經(jīng)典方[17]，由萊菔子、紫蘇子和白芥子3味藥組成。方中萊菔子消食導滯，下氣祛痰；紫蘇子可降氣化痰、潤腸通便、止咳平喘；白芥子辛溫，利氣散結(jié)祛痰而不耗氣。三藥相配，共奏順氣降逆，化痰消食之功。臨床上根據(jù)“異病同治”這一治療原則，基于痰濕瘀阻互結(jié)，氣機郁滯的共同病機，使用該方治療脂肪肝、高脂血癥、2型糖尿病等代謝相關(guān)性疾病，取得良好療效[12,18-19]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量增加，肝組織出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，血清TC、HDL-c、LDL-c水平均升高。與人類NAFLD患者血清HDL-c水平降低不同，模型組小鼠血清HDL-c水平升高，是由于小鼠在ApoA1(HDL的主要載脂蛋白)的啟動子區(qū)域缺乏PPAR反應元件所致[20]；與模型組比較，黃連素組、美能組小鼠肝質(zhì)量、肝組織病理及血脂得到改善，三子養(yǎng)親湯干預可減輕NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量，改善肝組織脂肪變性和炎性細胞浸潤，并降低血脂水平，證實三子養(yǎng)親湯具有改善NAFLD的作用。

脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD的形成原因之一。AMPK是細胞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，AMPK被激活后可抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸β氧化[21-22]。AMPK可磷酸化其下游分子ACC，抑制其活性，從而抑制脂肪酸的合成，增加CPT-1 A的活性從而促進脂肪酸β氧化[23]。研究也表明，AMPK可降低FASN的表達，減少脂質(zhì)的合成，增加PPARα、ACOX1、PGC-1α的表達，促進脂肪酸氧化[24-26]。SIRT1是NAD+依賴的去乙?；竅27]，與AMPK的活化相互促進，共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝[28-29]。本研究顯示，與對照組比較，模型組AMPK磷酸化、SIRT1表達均降低，三子養(yǎng)親湯組其表達升高。并且，NAFLD模型組失活的ACC表達降低，促進脂肪酸氧化基因CPT-1A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表達降低，促進脂肪酸合成的FASN表達上調(diào)，藥物干預可上調(diào)p-ACC、CPT-1 A、ACOX1、PPARα、PGC-1α的表達，降低FASN的表達，提示三子養(yǎng)親湯可能通過調(diào)控AMPK/SIRT1調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)分子信號通路，從而發(fā)揮改善肝細胞脂質(zhì)代謝的作用。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖6 各組小鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)分子的表達

綜上所述，本研究結(jié)果表明，三子養(yǎng)親湯可改善NAFLD，其作用機制可能與促進AMPK/SIRT1信號通路活化調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，本研究為該經(jīng)典方劑治療脂肪肝的臨床應用提供實驗依據(jù)。