毛 敏，李香香，楊晶瑩，楊 薇，張 馳，劉信平*

(1.湖北民族大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

二氫楊梅素是藤茶中主要活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤等多種功效，但由于水溶性、穩(wěn)定性及活性利用率較低等因素導致其廣泛應用受到抑制[1-2]。為了解決上述問題，對二氫楊梅素進行結構修飾、衍生化成為目前研究熱點[3]，如將該成分制成金屬螯合物后，其抗菌、抗氧化能力均得到提高[4]。

硒是維持人和動物機能的必需微量元素之一，具有抗氧化、抗癌等作用，人體長期嚴重缺硒可導致大骨節(jié)病及克山病[5]，并且有機硒化物能有效避免無機硒易引起中毒的缺點，備受醫(yī)藥、食品保健等領域研究人員的關注。湯震[6]等合成的硒化低聚氨基多糖具有良好的穩(wěn)定性和生物活性；田崇梅[7]等將土茯苓總黃酮和Na2SeO3聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)它有良好的抗氧化活性；高珍珍[8]等報道，硒化多糖的抗氧化活性明顯高于硒化劑Na2SeO3。鑒于此，本實驗以天然藤茶中提取純化的二氫楊梅素為前體，Na2SeO3為硒化劑制備硒化二氫楊梅素，并對其理化性質進行初步研究，以期為拓展該成分及其有機硒化物的應用奠定基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 二氫楊梅素對照品(陜西博耐澤生物科技有限公司,純度98%)。水中硒標準溶液(中國計量科學研究院)。磷酸鹽緩沖液(自制,pH 6.6)。DPPH(如吉生物科技有限公司)；無水碳酸鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵均為分析純；亞硒酸鈉、乙酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、30% H2O2、鹽酸及乙醇均為分析純或優(yōu)級純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為二次蒸餾水和超純水。

1.2 儀器 旋轉蒸發(fā)器(上海賢德實驗儀器有限公司)；真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)；微波消解儀(美國CEM公司)；雙道原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司)；紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；紅外光譜分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；綜合熱分析儀 (美國PerkinElmer公司)；MAXimaXRD-7000型X射線衍射儀(日本島津公司)。

2 方法

2.1 單因素試驗 按比例稱取二氫楊梅素、亞硒酸鈉，飽和Na2CO3溶液調節(jié)反應體系pH，加熱回流，反應后用HCl調pH，離心，依次用沸蒸餾水、冰蒸餾水淋洗，真空干燥，即得黃棕色粉末狀固體[9-11]。因素水平分別為物料比1∶0.25、1∶ 0.5、1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3，反應時間40、60、80、100、120 min，反應溫度15、35、55、75、95 ℃，反應體系pH 8、7、2。

2.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇物料比1∶ 0.25、1∶ 0.5、1∶ 1、1∶ 2，反應時間60、80、100、120 min，反應溫度35、55、75、95 ℃，反應體系pH 2、7、8、9作為影響因素，硒源利用率[(硒化二氫楊梅素中硒質量/投入硒質量)×100%]作為評價指標，正交試驗優(yōu)化硒化工藝。

2.3 表征

2.3.1 紫外 配制樣品溶液，于200～500 nm區(qū)間掃描其紫外光譜。

2.3.2 紅外 取少量樣品，在4 000～450 cm-1區(qū)間采集其紅外光譜。

2.3.3 綜合熱分析儀(TG) 在Ar氣氛中，取適量樣品至陶瓷坩鍋中檢測。

2.3.4 X射線衍射儀(XRD) 取適量樣品至樣品盤中，在掃描速度8 °/min下采集2 °～80 °(2θ)的數(shù)據(jù)。

2.4 穩(wěn)定性試驗 取15 mL樣品溶液至小試管中，依次改變受熱溫度、pH及加熱時間，于250～500 nm區(qū)間測定紫外光譜，其中受熱溫度為10、35、55、75、95、100 ℃，pH為2、4、6、7、8、10、12[12]，加熱時間為10、20、30、40、50、60 min。

2.5 抗氧化活性實驗

2.5.1 還原力 取適量小試管，依次加入1 mL 樣品溶液、2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴保溫20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液，加0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液后在700 nm波長處測定吸光度。

2.5.2 對·OH自由基的清除作用 取適量小試管，依次加入2 mL樣品溶液、2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2，37 ℃水浴保溫30 min后于510 nm波長處測定吸光度，計算·OH自由基清除率，公式為清除率={[A0-(AS-AB)]/A0}×100%，其中A0為用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度，AS為樣品溶液吸光度，AB為用蒸餾水代替水楊酸乙醇溶液的吸光度。

2.5.3 對DPPH自由基的清除作用 取適量小試管，依次加入1 mL樣品溶液、2 mL 140 μg/mL DPPH乙醇溶液，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度，計算DPPH自由基清除率[13]，公式為清除率={[A0-(AS-AB)]/A0}×100%，其中A0為用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度，AS為樣品溶液吸光度，AB為用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液的吸光度。

3 結果

3.1 單因素試驗 由圖1A可知，硒源利用率隨著物料比增加而升高，在1∶3時達1.50%；由圖1B可知，反應時間對硒源利用率的影響呈“U”型趨勢，即在40、120 min時較高；由圖1C可知，硒源利用率隨著反應溫度增加而升高，在95 ℃時達29.38%；由圖1D可知，反應體系pH為中性偏堿性時，有利于提高硒源利用率。

3.2 正交試驗 結果見表1，方差統(tǒng)計見表2，Duncan多重比較見表3。由表2可知，各因素對硒源利用率均有顯著影響(P<0.01)。由表3可知，物料比1∶ 0.25可節(jié)約原料的用量；反應時間120 min有利于提高硒源利用率；反應溫度75、95 ℃時硒源利用率較高，并且兩者差異不顯著，同時硒源利用率隨著其增加而升高，故選擇95 ℃；反應pH 7、8、9時硒源利用率較高，并且差異不顯著，故進行折中后選擇8。綜上所述，最優(yōu)工藝為A1B4C4D3，即物料比1∶ 0.25，反應時間120 min，反應溫度95 ℃，反應pH 8。再進行驗證試驗，測得硒源利用率為0.807 3，高于正交試驗中的最高值(0.736 4)。

表1 正交試驗結果

表2 方差分析

表3 Duncan多重比較

3.3 紫外 有研究報道，二氫楊梅素在207、289 nm波長處分別為類黃酮、黃酮醇的特征峰[14]。結果顯示，硒化二氫楊梅素類黃酮結構特征峰(208.5 nm)存在，即硒化后黃酮基本母核仍保留；黃酮醇結構特征峰(358.5 nm)存在一定紅移，這是因為Se取代二氫楊梅素羥基上的H，絡合軌道間的電荷轉移躍遷，電子從酚氧基配體軌道躍遷到硒離子的軌道。

注：DMY為二氫楊梅素。圖2 二氫楊梅素紅外光譜圖

3.5 TG 由圖3A可知，硒化二氫楊梅素在200 ℃以下時失重率為4.42%，為硒化二氫楊梅素分子外的吸附水[15]；在200～380 ℃區(qū)間的失重率為31.44%，為硒化二氫楊梅素的分解階段；二氫楊梅素在250 ℃處開始熔化分解，與文獻[16]報道一致；在250～370 ℃區(qū)間硒化二氫楊梅素的失重率低于二氫楊梅素，而在400 ℃后失重率高于二氫楊梅素，推測該區(qū)間形成的硒化二氫楊梅素可能破壞了二氫楊梅素與H2O之間的相互作用力，使得熱穩(wěn)定性高于二氫楊梅素[17]；400 ℃以上基本母核和Se結合處同時分解，導致熱穩(wěn)定性相對降低，也證明了硒化二氫楊梅素的合成。由圖3B可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素分解失重溫度分別為250、360 ℃，即后者熱穩(wěn)定性明顯提高。

注：DMY為二氫楊梅素。圖3 二氫楊梅素熱重曲線

3.6 XRD 由圖4可知，二氫楊梅素在13.82°、14.52°、15.94°、21.36°、25.92°、26.82°處有晶體衍射峰，Na2SeO3在17.74°、20.54°、24.20°、26.04°、32.44°、36.58°、45.00°、53.14°、60.80°處有晶體衍射峰，硒化二氫楊梅素的晶體衍射峰為8.96°、11.92°、14.58°、23.46°、26.88°、29.62°、36.14°、43.54°、45.26°；二氫楊梅素+Na2SeO3混合物具有兩者各自晶體衍射峰，不同于硒化二氫楊梅素，即它是通過化學反應而成，而不是簡單的物理混合。

注：DMY為二氫楊梅素。圖4 二氫楊梅素XRD譜圖

3.7 穩(wěn)定性試驗 由紫外分析結果可知，當受熱溫度為10～100 ℃時，硒化二氫楊梅素特征吸收峰位置未發(fā)生明顯變化，即其溶液在30 min內受熱溫度100 ℃以下時能穩(wěn)定存在；硒化二氫楊梅素溶液本身pH為6的特征吸收峰與調pH為酸性者基本一致，而與調pH為中性、堿性者不同，并且隨堿性增強特征吸收峰發(fā)生明顯變化，即它在酸性條件下穩(wěn)定，而在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，并隨堿性增強更明顯；受熱時間為10～60 min時，硒化二氫楊梅素特征吸收峰的位置基本保持一致，即它在100 ℃下受熱60 min時仍穩(wěn)定存在。

3.8 抗氧化實驗

3.8.1 還原力 物質的抗氧化能力與還原力呈正相關，當反應體系中存在抗氧化物質時，K3Fe (CN)6中的鐵離子的價態(tài)發(fā)生改變使溶液顏色改變，從而可知物質的抗氧化能力[18]。由圖5可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素都具有還原力，并呈一定的量效關系，以后者更明顯。

注：DMY為二氫楊梅素。圖5 二氫楊梅素還原力

3.8.2 對·OH自由基的清除作用 由圖6可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素對·OH自由基的清除作用均呈一定的量效關系，在樣品質量濃度為300 μg/mL時最強，以后者更明顯，表明硒化二氫楊梅素因共軛效應使自氧化的氧陰離子自由基的電荷密度降低，穩(wěn)定性增加，有利于提高對·OH自由基的清除率，從而提高抗氧化活性[19]。

注：DMY為二氫楊梅素。圖6 二氫楊梅素對·OH自由基的清除率

3.8.3 對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知，二氫楊梅素、硒化二氫楊梅素對DPPH自由基的清除率均隨著樣品質量濃度增加變化不大，在300 μg/mL時最高，以前者更明顯，但后者整體也較理想，表明Na2SeO3與二氫楊梅素硒化時部分羥基氫被Se取代，使其數(shù)量減少，導致清除DPPH自由基作用降低[20]。

注：DMY為二氫楊梅素。圖7 二氫楊梅素對DPPH自由基的清除率

4 結論

本實驗所得最優(yōu)二氫楊梅素硒化修飾工藝為物料比1∶ 0.25，反應時間120 min，反應溫度95 ℃，反應pH 8，產物熱穩(wěn)定性、水溶液穩(wěn)定性、抗氧化活性均良好，可為其進一步研發(fā)提供基礎。