董年 施強(qiáng)強(qiáng) 宋晨劍 劉莉 陳俊杰

當(dāng)前，日益嚴(yán)重的空氣污染對公眾健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，尤其影響到基數(shù)龐大的氣道疾病人群[1]。細(xì)顆粒物（particulate matter,PM）是空氣污染物中的重要成分，可以跟隨呼吸氣流廣泛沉積在支氣管上皮表面。支氣管上皮主要由固有結(jié)構(gòu)細(xì)胞支氣管上皮細(xì)胞構(gòu)成，支氣管上皮細(xì)胞在PM作用下發(fā)生炎癥損傷，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的合成分泌和細(xì)胞過早壞死凋亡，導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是氣道疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理過程[2]。與氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆性改變的氣道重構(gòu)相比，氣道炎癥具有一定的可逆性，闡明支氣管上皮的損傷修復(fù)機(jī)制在預(yù)防和診治氣道炎癥上具有重要作用。在PM作用下的動物模型中可以觀察到以氣道炎癥為主的病理改變[3]，伴隨成纖維生長因子10（fibroblast growth factor 10,FGF10）表達(dá)變化[4]，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞的環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX2）表達(dá)，進(jìn)而催化前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）合成，擴(kuò)大氣道炎癥反應(yīng)[5-6]。本研究使用FGF10干預(yù)PM誘導(dǎo)的動物模型和細(xì)胞模型，觀察PM導(dǎo)致的支氣管上皮細(xì)胞炎癥損傷效應(yīng)，探討COX2/PGE2在不同條件下的變化，為探明FGF10在PM誘導(dǎo)氣道炎癥中的抗炎調(diào)控作用及分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 6～8周SPF級雄性C57BL/6小鼠（20～22 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，動物生產(chǎn)許可證號為SXCK（京）2016-0011。人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）購自上海中科院細(xì)胞庫，根據(jù)相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)指導(dǎo)手冊進(jìn)行培養(yǎng)。PM購自美國NIST公司，商品化名：SRM 1649b；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS和PBS購自美國Gibco公司；動物實驗用FGF10購自溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；細(xì)胞實驗用FGF10購自美國Peproptech公司；抗COX2抗體和抗上皮特異性標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）抗體購自美國CST公司；ELISA試劑盒購自上海博蘊生物科技有限公司；蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002購自美國Selleck公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動物模型建立及實驗分組、處理

1.2.1 動物模型的建立和分組 取40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只?？瞻讓φ战M0、24 h時給予腹腔注射 PBS 25 μl，1、25 h 時給予氣道滴注 PBS 25 μl；FGF10組根據(jù)動物體質(zhì)量按0.5 mg/kg于0、24 h時腹腔注射FGF10，于1、25 h時氣道滴注等量PBS；PM組于0、24 h時腹腔注射等量PBS，根據(jù)動物體質(zhì)量按4.0 mg/kg于1、25 h 時氣道滴注PM；（PM+FGF10）組0、24 h時給予0.5 mg/kg FGF10腹腔注射，1、25 h時給予4.0 mg/kg PM氣道滴注。

1.2.2 動物標(biāo)本的處理 4組小鼠在末次氣道滴注24 h后用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉。（1）每組取3只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注0.9%氯化鈉溶液，獲取肺泡灌洗液用以PGE2表達(dá)水平檢測；小鼠死亡后切開胸腔獲取新鮮肺組織用于COX2表達(dá)水平檢測。（2）每組取4只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注多聚甲醛，獲取肺組織用于常規(guī)病理檢查。（3）每組取3只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注冷凍切片包埋劑，獲取肺組織用于免疫熒光檢測。

1.3 細(xì)胞模型建立及實驗分組、處理 BEAS-2B細(xì)胞用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5% CO2恒溫，隔天換液，取生長狀況良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，使用0.25%胰酶溶液消化傳代。（1）細(xì)胞模型Ⅰ分為空白組、FGF10組、PM組、PM+FGF10組?？瞻捉M于0、1 h時加入1 μl PBS培養(yǎng)；FGF10組加入10 μg/L FGF10培養(yǎng)，1 h后加入PBS；PM組加入PBS培養(yǎng)，1 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10組加入10 μg/L FGF10培養(yǎng)，1 h后加入200 mg/L PM。所有各組培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞，分別檢測COX2/PGE2表達(dá)水平和細(xì)胞功能變化。（2）細(xì)胞模型Ⅱ分為空白組、PM組、PM+FGF10組、PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組?？瞻捉M于0、1、2 h時加入1 μl PBS培養(yǎng)；PM組于0、1 h時加入PBS培養(yǎng)，2 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10組加入PBS培養(yǎng)，1 h后加入10 μg/L FGF10，2 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組加入5 mmol/L 的LY294002或U0126培養(yǎng)，1 h后加入10 μg/L FGF10，2 h后加入200 mg/L PM。所有各組培養(yǎng)25 h后收集細(xì)胞，檢測COX2/PGE2的表達(dá)水平。

1.4 小鼠指標(biāo)觀測

1.4.1 組織病理分級 4組小鼠肺組織常規(guī)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。以0到4分的主觀等級評估支氣管周圍和血管周圍的炎癥程度：0分為未觀察到炎癥；1分為偶見炎癥細(xì)胞；2分為支氣管或血管周圍不均勻分布炎癥細(xì)胞或炎癥細(xì)胞圍繞成薄的環(huán)狀（層厚1～5個炎癥細(xì)胞）；3分為支氣管或血管周圍分布均勻的炎癥細(xì)胞或炎癥細(xì)胞圍繞成厚的環(huán)狀（層厚＞5個炎癥細(xì)胞）；4分為支氣管、血管或肺泡分布彌漫聚集的炎癥細(xì)胞。

1.4.2 小鼠肺泡灌洗液中PGE2表達(dá)的檢測 采用ELISA法。4組小鼠肺泡灌洗液4℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液，加注至ELISA板中，37℃孵育2 h。移除板孔中液體，添加生物素抗體，37℃孵育1 h；洗去液體，添加HRP-抗生物素蛋白，37℃孵育1 h；重復(fù)洗滌5次。顯色并終止，利用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組樣品PGE2的質(zhì)量濃度。

1.4.3 小鼠肺組織COX2蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。4組小鼠肺組織研磨搗碎后4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳；取30 μg電泳凝膠，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用質(zhì)量濃度為5%的脫脂牛奶室溫下封閉2.0 h，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次，二抗室溫孵育1.5 h，用TBST緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次，化學(xué)發(fā)光法顯影條帶。以管家基因蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內(nèi)參，計算蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

1.4.4 小鼠支氣管上皮細(xì)胞COX2表達(dá)的檢測 采用免疫熒光法。取4組小鼠支氣管冷凍切片，用抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行切片修復(fù)，用牛血清白蛋白封閉非特異性抗原。分別使用抗COX2一抗和抗EpCAM一抗孵育過夜，PBS充分洗凈后，二抗室溫孵育1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，切片稍甩干后添加熒光猝滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算熒光強(qiáng)度。其中DAPI用于細(xì)胞核染色，發(fā)藍(lán)光；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）用于上皮特異性標(biāo)志物Epcam染色，發(fā)綠光；Sulfo-Cyanine 3染料（CY3）用于COX2染色，發(fā)紅光。

1.5 細(xì)胞指標(biāo)觀測

1.5.1 BEAS-2B細(xì)胞PGE2表達(dá)的檢測 采用ELISA法。將細(xì)胞模型Ⅰ的4組細(xì)胞上清液按照1.4.2方法測定并計算樣品PGE2質(zhì)量濃度。

1.5.2 BEAS-2B細(xì)胞COX2表達(dá)的檢測 采用Western blot法。將細(xì)胞模型Ⅰ的4組細(xì)胞用裂解液裂解，4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，按照1.4.3方法測定并計算COX2的相對表達(dá)量。

1.5.3 BEAS-2B細(xì)胞功能分析 將細(xì)胞模型Ⅰ的4組細(xì)胞分別與1.0 μmol/L Hoechst33342 和 0.3 μmol/L Mito Tracher Green共培養(yǎng)45 min，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）進(jìn)行高內(nèi)涵成像分析，根據(jù)細(xì)胞核數(shù)計算總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)線粒體熒光強(qiáng)度反映線粒體功能。

1.5.4 LDH細(xì)胞毒性實驗 將細(xì)胞模型Ⅰ的4組細(xì)胞上清液，根據(jù)LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組LDH釋放相對值。LDH釋放相對值越大，說明細(xì)胞毒性越強(qiáng)。

1.5.5 信號通路抑制劑作用下BEAS-2B細(xì)胞PGE2和COX2表達(dá)的檢測 采用ELISA法，取細(xì)胞模型Ⅱ的5組上清液按照1.4.2方法測定PGE2質(zhì)量濃度；采用Western blot法，取細(xì)胞模型Ⅱ的5組細(xì)胞按照1.4.3方法，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，檢測COX2的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠支氣管病理形態(tài)改變的比較 PM組支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞變厚，伴隨PM氣道沉積；空白組和FGF10組支氣管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；PM+FGF10組支氣管周圍炎癥較PM組相對緩解，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤程度降低。見圖1a（插頁）。對各組的病理分級評分發(fā)現(xiàn)：相比空白組，PM組炎癥評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組炎癥評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1b（插頁）。

圖1 4組小鼠支氣管病理形態(tài)變化（a）和病理等級評分（b）

2.2 4組小鼠肺泡灌洗液PGE2表達(dá)的比較 相比空白組，PM組肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4組小鼠肺泡灌洗液PGE2表達(dá)的比較

2.3 4組小鼠肺組織COX2蛋白表達(dá)的比較 相比空白組，PM組肺組織COX2蛋白相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組肺組織COX2蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4組小鼠肺組織COX2蛋白電泳圖和相對表達(dá)量比較（a：蛋白電泳圖；b：相對表達(dá)量）

2.4 4組小鼠支氣管上皮COX2表達(dá)的比較 各組支氣管上皮細(xì)胞COX2均有表達(dá)，其中PM組紅色熒光強(qiáng)度較高，說明該組COX2表達(dá)升高，PM+FGF10組COX2熒光強(qiáng)度較PM組降低（圖4a，見插頁），但各組熒光強(qiáng)度差異不顯著（圖4b，見插頁）。

圖4 4組小鼠支氣管上皮COX2熒光染色（a）和熒光強(qiáng)度（b）的比較

2.5 4組BEAS-2B細(xì)胞COX2/PGE2表達(dá)的比較 PM組細(xì)胞上清液中PGE2質(zhì)量濃度高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖5a。各組細(xì)胞的COX2均有表達(dá)見圖5b，其中PM組高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義均P＜0.05，見圖5c。

圖5 4組BEAS-2B細(xì)胞COX2/PGE2表達(dá)的比較（a：PGE2質(zhì)量濃度；b：COX2蛋白電泳圖；c：COX2相對表達(dá)量）

2.6 4組BEAS-2B細(xì)胞生物功能改變的比較 熒光顯微鏡下，PM組細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）數(shù)量減少，PM+FGF10組線粒體（綠色熒光）數(shù)量增多（圖6a，見插頁）。結(jié)合細(xì)胞計數(shù)（圖6b，見插頁）和線粒體熒光強(qiáng)度（圖6c，見插頁）結(jié)果可知：PM組BEAS-2B細(xì)胞數(shù)少于空白組，PM+FGF10組多于PM組；PM組線粒體熒光強(qiáng)度低于空白組，PM+FGF10組高于PM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。LDH釋放相對表達(dá)值實驗（圖6d，見插頁）表明：PM組乳酸脫氫酶水平高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖6 4組BEAS-2B的細(xì)胞生物功能改變的比較（a：細(xì)胞熒光染色；b：BEAS-2B細(xì)胞計數(shù)；c：線粒體熒光強(qiáng)度；d：LDH釋放相對表達(dá)值）

2.7 5組BEAS-2B細(xì)胞COX2/PGE2表達(dá)的比較 不同處理下BEAS-2B細(xì)胞COX2蛋白均有表達(dá)（圖7a）；PM組COX2相對表達(dá)量高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組高于PM+FGF10組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖7b。PM組PGE2質(zhì)量濃度高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組高于PM+FGF10組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖7c。

圖7 5組BEAS-2B細(xì)胞 COX2/PGE2表達(dá)的比較（a：COX2蛋白電泳圖；b：COX2相對表達(dá)量；c：PGE2質(zhì)量濃度）

3 討論

PM作為空氣污染物中的重要成分，是危害中國成人肺部健康、引起氣道疾病的重要因素[7]，主要成分包括碳化合物、烴類物質(zhì)和金屬元素等，其介導(dǎo)的理化損傷是空氣污染和健康效應(yīng)之間的重要聯(lián)系[8-9]。PM可以伴隨呼吸氣流廣泛沉積在氣道上皮和肺泡上皮。其中氣道上皮是呼吸系統(tǒng)抵御PM的首要屏障，支氣管上皮細(xì)胞作為氣道上皮的固有結(jié)構(gòu)細(xì)胞，在氣道炎癥中扮演了啟動細(xì)胞和繼發(fā)受體的雙重角色[10]。

本研究通過氣道滴注PM構(gòu)建動物模型，獲取鼠肺組織模擬人肺及氣道的炎癥變化。病理分級評分發(fā)現(xiàn)：PM導(dǎo)致肺臟組織產(chǎn)生以氣道炎癥為主的病理改變，表現(xiàn)為氣道PM沉積、氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤等；給予FGF10干預(yù)時氣道炎癥得到緩解，與Xu等[11]報道一致。FGF10干預(yù)使得肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度降低，但并沒有觀察到明顯的肺泡炎癥。原因可能是氣道滴注將PM制造成為懸浮液，PM無法沉積到肺泡。本研究以腹腔注射方式注入FGF10，藥物劑量僅為氣道滴注的10%[12]，同樣觀察到了FGF10的抗炎效應(yīng)。值得注意的是，腹腔注射方式給藥，F(xiàn)GF10需要經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肺臟，可能會造成系統(tǒng)性不良反應(yīng)[13]，提示后續(xù)研究可開發(fā)PM霧化造模和FGF10霧化給藥。氣道滴注PM后小鼠全肺組織COX2表達(dá)水平升高，肺泡灌洗液PGE2質(zhì)量濃度升高，F(xiàn)GF10干預(yù)后，COX2/PGE2表達(dá)水平均降低，認(rèn)為FGF10逆轉(zhuǎn)了PM誘導(dǎo)的COX2/PGE2表達(dá)。

細(xì)胞實驗同樣觀察到了上述結(jié)果。本研究以永生化的支氣管上皮細(xì)胞為研究對象，使用PM刺激建立細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PM誘導(dǎo)下，支氣管上皮細(xì)胞COX2/PGE2的表達(dá)水平升高，細(xì)胞膜通透性升高，活細(xì)胞計數(shù)降低，LDH釋放量增加，這充分體現(xiàn)了PM對支氣管上皮細(xì)胞的理化損傷作用。FGF10干預(yù)后COX2/PGE2的表達(dá)水平降低，活細(xì)胞數(shù)增多，線粒體熒光強(qiáng)度增大，LDH釋放量下降，可見FGF10逆轉(zhuǎn)了PM誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

COX2/PGE2是重要的炎癥介質(zhì)，參與了氣道炎癥的起始發(fā)展[14]。關(guān)于PM誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞COX2/PGE2表達(dá)的分子機(jī)制，Wang等[15-16]認(rèn)為是ROS-MAPK-NFκB信號通路和circTXNRD1-miR892a-COX2軸，Zhao等[17]報道了NF-κB信號通路和C/EBPβ信號通路，Song等[18]闡明了PI3K/Akt信號通路。在PM誘導(dǎo)的氣道炎癥中，F(xiàn)GF10主要與上皮細(xì)胞選擇性表達(dá)的成纖維生長因子受體 2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）以配體-受體結(jié)合的方式發(fā)揮調(diào)控作用[19]。FGF10-FGFR2觸發(fā)的信號傳導(dǎo)通路包括MAPK、PI3K/Akt、PLC-γ等[20]。結(jié)合MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路在肺炎癥損傷中的研究基礎(chǔ)[21]，本研究在培養(yǎng)體系中添加了ERK1/2抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此兩者作用下，COX2/PGE2表達(dá)水平重新提高。可見FGF10經(jīng)活化的MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎作用，逆轉(zhuǎn)PM誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞COX2/PGE2的表達(dá)。此外，F(xiàn)ang等[22]發(fā)現(xiàn)：FGF10還可以通過調(diào)控高遷移率族蛋白B1的胞核胞漿轉(zhuǎn)移和PM誘導(dǎo)的自噬流改變發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

FGF10可針對PM誘導(dǎo)的氣道炎癥發(fā)揮抗炎效應(yīng)，但這些研究還處于起步階段，MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路如何介導(dǎo)FGF10的抗炎效應(yīng)還不清楚，后期可圍繞信號通路下游信號蛋白、與經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB的聯(lián)系等展開深入探究。目前，PM氣道滴注和FGF10腹腔給藥方式還不能完全模擬真實事件中PM暴露情況，針對FGF10最優(yōu)化的給藥途徑如霧化吸入的方法還未正式報道；COX2/PGE2作為重要的炎癥介質(zhì)參與了氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，F(xiàn)GF10通過MAPK/ERK或PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，但涉及的介質(zhì)，如下游信號傳導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄翻譯等還未知。

本研究從動物實驗和細(xì)胞實驗兩個層面揭示了FGF10調(diào)控PM誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞COX2/PGE2的表達(dá)，其中分子機(jī)制涉及MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路，初步揭示了間充質(zhì)來源的FGF10在PM誘導(dǎo)氣道炎癥中的抗炎效應(yīng)，為FGF10用于治療PM相關(guān)呼吸道炎癥提供依據(jù)。