馬文斌，薛 娟，涂 華，劉 康，成永之，連增林（通信作者）

（1 北京金康和信藥業(yè)科技有限公司 北京 100176）

（2 連云港金康和信藥業(yè)有限公司 江蘇 連云港 222000）

葉酸是一種必需的水溶性B 族維生素，自然存在于食物當(dāng)中，尤其是水果、綠葉蔬菜和肝臟。由于葉酸最早是從植物葉子中提取出來(lái)的，是機(jī)體內(nèi)重要的一碳單位共體，可以直接介入人體當(dāng)中諸多主要的生長(zhǎng)過(guò)程，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、胚胎生長(zhǎng)及蛋白的合成與代謝。葉酸已經(jīng)成為一種具備醫(yī)療、保健和預(yù)防疾病等多功能藥物。經(jīng)研究表明，葉酸能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)、作為產(chǎn)前維生素降低新生兒神經(jīng)管畸形病變的發(fā)生、治療巨幼紅細(xì)胞貧血癥、影響骨髓中紅細(xì)胞分裂增殖速度。服用葉酸后能降低人體血清中同型半胱氨酸的水平，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生率。對(duì)保護(hù)機(jī)體健康有著重要意義。6S-5 甲基四氫葉酸是葉酸的主要活性成分，本文旨在探討食品原料6S-5-甲基四氫葉酸鈣的食用安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠，SPF 級(jí)，體重180 ～213 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。昆明小鼠，SPF 級(jí)，體重19 ～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006，購(gòu)買(mǎi)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。自然晝夜光線照明，相對(duì)濕度40%～70%，室溫20 ～25 ℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2013-0008。動(dòng)物飼料購(gòu)買(mǎi)于蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技服務(wù)有限公司，登記證號(hào)：蘇飼審（2009）05032。

1.1.2 受試物 6S-5-甲基四氫葉酸鈣（6S-5-MTHF Ca，葉源酸），白色至微黃色粉末，由連云港金康和信藥液有限公司提供。

1.1.3 測(cè)試菌株 試驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100、TA102購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)分子毒理有限公司（MOLECULARTOXICOLOGY，INC.），產(chǎn)品質(zhì)量保證書(shū)批號(hào)分別為：458D、4599D、4600D、4604D,通過(guò)其生物學(xué)特性方面鑒定，試驗(yàn)菌株符合此次實(shí)驗(yàn)的要求。

1.1.4 儀器設(shè)備 電子秤：ACS-3A 90401582；電子天平：BP310S 9100690；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9270 型104307；電子天平：Sartorius CP124S 13806202；全自動(dòng)生化儀：7600-010（日本日立）766-7009；血液分析儀：XT-2000i 希森美康66541；臺(tái)式離心機(jī)：Mikro 22（HETTICH 公司）1105；電子天平：Bp3 100 s（沙多里斯公司）91006823；電子秤：ACS-3 型（上海泰和衡器廠）90401570；切片機(jī)：HM340E（德國(guó)蔡司公司）15782；脫水機(jī)：HMP110，（德國(guó)蔡司公司）15784；包埋機(jī)：AP280（德國(guó)蔡司公司）15787；染色機(jī)：HMS70（德國(guó)蔡司公司）15788。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 選擇體重符合實(shí)驗(yàn)要求的SD大鼠、昆明小鼠，雌、雄，雌、雄各10 只，將雌、雄SD 大鼠、昆明小鼠分別放入鼠籠內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前，雌、雄大鼠不禁水，禁食16 h 以后，實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)最大耐受量試驗(yàn)原則指導(dǎo)，雌、雄大鼠稱(chēng)重，灌胃容量按20 mL/kg BW計(jì)，相應(yīng)劑量的供試液通過(guò)經(jīng)口灌胃方式給予各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，灌胃給藥每次間隔4 h，24 h 內(nèi)分3 次灌胃，動(dòng)物染毒后，每周對(duì)動(dòng)物稱(chēng)重1 次。觀察動(dòng)物體重變化、精神狀態(tài)、反應(yīng)性、毛發(fā)色澤、飲食、排泄?fàn)顩r、中毒表現(xiàn)和死亡只數(shù)等，觀察周期為1 周。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程中如遇死亡動(dòng)物或到期處死的動(dòng)物，及時(shí)進(jìn)行實(shí)體解剖，通過(guò)肉眼觀察，將有病理改變的動(dòng)物組織器官情況均做詳細(xì)記錄。

1.2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 選擇體重合適的雌、雄性昆明小鼠，按體重隨機(jī)分為5 組，每組10 只，雌雄參半。供試液設(shè)定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 組，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg）和溶劑對(duì)照組，雌、雄昆明小鼠逐只稱(chēng)重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 計(jì)，相應(yīng)劑量的樣本通過(guò)經(jīng)口灌胃方式給予各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，灌胃給藥采用30 h 2 次灌胃法，分別對(duì)各組動(dòng)物灌胃。末次灌胃給藥后6 h，采用頸椎脫臼處死動(dòng)物，對(duì)股骨骨髓進(jìn)行取材，然后，加入小牛血清沖洗混勻，沖洗物移至載玻片上，均勻推片，干燥、干燥后放入甲醇中固定5 ～10 min，取出，晾干，涂片用Giemsa 染色20 min，蒸餾水沖洗后待檢。顯微鏡油鏡觀察下，逐只先進(jìn)行計(jì)數(shù)1 000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）的微核數(shù)，微核率通常以千分率表示，再計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞（計(jì)數(shù)200 個(gè)PCE）時(shí)同時(shí)計(jì)數(shù)成熟紅細(xì)胞（NCE）數(shù)，并計(jì)算PCE/NCE值。

1.2.3 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn) 選擇體重合適的雄性昆明小鼠，按體重隨機(jī)分為5 組，每組5 只。供試液設(shè)定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 組，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg）和溶劑對(duì)照組，雌、雄昆明小鼠逐只稱(chēng)重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 計(jì)，相應(yīng)劑量的樣本通過(guò)經(jīng)口灌胃方式給予各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，連續(xù)5 d，每日灌胃給藥1 次。第1 次灌胃給藥后，第35 天采用頸椎脫臼處死動(dòng)物，將兩側(cè)附睪取材后，放入0.9%氯化鈉溶液中，沖洗，剪碎，四層紗布過(guò)濾，取濾液至載玻片上涂片，甲醇固定5 min，2%伊紅水溶液染色制片，室溫干燥。高倍鏡下觀察，逐鼠計(jì)數(shù)1 000 個(gè)精子的畸形數(shù)，并詳細(xì)記錄畸形類(lèi)型。

1.2.4 Ames 試驗(yàn) 從液氮罐中取出一株菌株制作成主平板，準(zhǔn)備15 mL/瓶營(yíng)養(yǎng)肉湯，將分離好的單菌落懸浮其中。實(shí)驗(yàn)菌液濃度控制在1.1 ～1.6×10/mL，溫度控制37 ℃ 120 次/分振蕩暗培養(yǎng)12 h。本次試驗(yàn)按GB15193.4-2003 中鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)中平板摻入法進(jìn)行，依次向保溫的45 ℃ 2 mL 頂層培養(yǎng)基中加入0.1 mLl 受試物和0.1 mL 菌株增菌液，需活化時(shí)，向板中加入0.5 mL S9 混合液，并且充分混勻迅速顛倒底層平板，實(shí)驗(yàn)需要做3 個(gè)平行平板。37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿中的回變菌落數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)1 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間大鼠未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，觀察剖檢主要臟器未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)病變。最大耐受劑量＞15 g/kg，屬無(wú)毒級(jí)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 小鼠急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間各組未見(jiàn)任何不良反應(yīng)和死亡動(dòng)物，所有小鼠均表現(xiàn)正常飲食飲水，毛色光澤良好；實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死動(dòng)物，通過(guò)肉眼觀察每只動(dòng)物的臟器組織，未見(jiàn)異常。樣品經(jīng)口灌胃給藥的雌、雄小鼠，在急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中，最大耐受劑量MTD 均＞15 g/kg，屬無(wú)毒級(jí)，見(jiàn)表2。

表2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

受試物各組劑量組PCE/NCE 比值、微核率與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），且受試物組PCE 占RBC 總數(shù)的比例不少于對(duì)照組的20%，提示受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)抑制作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，6S-5-甲基四氫葉酸鈣（L-5-MTHF Ca）骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

與溶劑對(duì)照組相比較，受試物各劑量組精子畸形率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），該受試物無(wú)致小鼠畸形作用，見(jiàn)表4。

表4 動(dòng)物精子畸形發(fā)生率

2.5 Ames 試驗(yàn)（致突變?cè)囼?yàn)）

在本次實(shí)驗(yàn)條件下的2 次試驗(yàn)中，在加和不加用S9活化系統(tǒng)平板摻入法檢測(cè)的條件下，各劑量組的回復(fù)菌落數(shù)均低于溶劑對(duì)照組的2 倍，故認(rèn)為：該受試物的Ames 試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陰性，見(jiàn)表5。

表5 第1 次試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

3.討論

葉酸在人體內(nèi)無(wú)法自身合成，需要通過(guò)外界補(bǔ)充獲取，一般在機(jī)體內(nèi)處于結(jié)合狀態(tài)，且血漿中含量很低。只有單次口服劑量達(dá)到250 μg 時(shí)，血漿中才會(huì)出現(xiàn)游離的葉酸，6S-5 甲基四氫葉酸是葉酸的主要活性成分，其可以透過(guò)血腦屏障，預(yù)防老年癡呆、細(xì)胞貧血等癥狀。隨著研究深入，葉酸還有許多其他的治療用途，盡管這些用途不如前面提到的那么有效。葉酸可以預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的腫瘤形成，防止宮頸發(fā)育不良，治療白癜風(fēng)，恢復(fù)因葉酸缺乏而引起的大細(xì)胞貧血的造血功能，增加牙齦對(duì)局部刺激物的抵抗力，從而減少炎癥反應(yīng)。為了造福人類(lèi)，提高生活質(zhì)量，我們以《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》GB15193-2003 有關(guān)規(guī)定作為根據(jù)，對(duì)6S-5 甲基四氫葉酸鈣進(jìn)行了安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，以此證明該產(chǎn)品作為保健食品開(kāi)發(fā)的可行性安全性依據(jù)。

本文結(jié)果顯示，樣品對(duì)雌雄大、小鼠的經(jīng)口的最大耐受劑量MTD 均＞15 g/kg，屬于無(wú)毒級(jí)。遺傳毒性實(shí)驗(yàn)中，Ames 試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；生殖毒性試驗(yàn)中，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表明6S-5 甲基四氫葉酸鈣對(duì)體細(xì)胞無(wú)致突變性。因此可以初步認(rèn)為在本次試驗(yàn)的條件下6S-5 甲基四氫葉酸鈣作為藥品和食品使用是安全可靠的。