梁再賦　索德寶　馮曉明　張瑞君　張嘯　趙云玲　高明利

【摘 要】目的：通過TLR/MyD88/IL-1β 信號通路探討雌性紅萊菔對尿酸鈉致急性痛風性關(guān)節(jié)炎（AGA）模型大鼠的抗炎作用機制。方法：通過大鼠右踝脛跗關(guān)節(jié)注射尿酸鈉結(jié)晶溶液（MSUC），建立AGA大鼠模型，雌性紅萊菔低、中和高劑量組和依托考昔組給予相應劑量藥物灌胃，空白對照組、模型對照組給予等量的生理鹽水灌胃，每日1次，療程5 d。末次灌胃1 h后，采血分離血清及大鼠右踝脛跗關(guān)節(jié)組織固定包埋。免疫組化法檢測AGA模型大鼠白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量;HE染色及免疫組化技術(shù)檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理變化、滑膜肥大細胞數(shù)量及活化狀態(tài)變化、P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維數(shù)量和Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）分子的表達。結(jié)果：雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低AGA模型大鼠IL-1β、TNF-α水平（P < 0.01）。雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低AGA模型大鼠滑膜部位肥大細胞數(shù)量、活化肥大細胞數(shù)量及脫顆粒百分率（P < 0.01）。雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低AGA模型大鼠滑膜P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維的分布密度（P < 0.01）。雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低AGA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4和MyD88分子表達（P < 0.01）。結(jié)論：雌性紅萊菔能夠減輕AGA模型大鼠踝關(guān)節(jié)的炎癥反應;滑膜部位肥大細胞活化及P物質(zhì)免疫反應陽性神經(jīng)纖維可能參與痛風性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應及疼痛傳導;雌性紅萊菔可通過降低TLR/MyD88/IL-1β通路分子的表達發(fā)揮其抗炎作用。

【關(guān)鍵詞】 急性痛風性關(guān)節(jié)炎;雌性紅萊菔;抗炎;TLR/MyD88/IL-1β信號通路;作用機制

Anti-inflammatory Effect of Female Red Radish on Model Rats with Acute Gouty Arthritis and Its Mechanism of Activating Signal Pathway TLR/MyD88/IL-1β

LIANG Zai-fu，SUO De-bao，F(xiàn)ENG Xiao-ming，ZHANG Rui-jun，ZHANG Xiao，ZHAO Yun-ling，GAO Ming-li

【ABSTRACT】Objective：Through signal pathway TLR/MyD88/IL-1β，to explore the anti-inflammatory mechanism of female red radish on acute gouty arthritis（AGA）model rats induced by sodium urate.Methods：AGA rats models were established by injecting mono sodium urate crystal（msuc）solution into the tibiotarsal joints of the right ankles of rats.Rats in the low，medium and high dose groups of female red radish and the etocoxib group were given corresponding doses experimental drugs by gavage once a day.The blank control group and model control group were given the same amount of normal saline by gavage.Five days as a course of treatment.One hour after the last gavaging，the blood was taken to separate the serum and the tissue of the tibiotarsal joints of the right ankles of rats were fixed and embedded.The contents of IL-1β and TNF-α in AGA model rats were detected by ELISA.The pathological changes，the number and activation of synovial mast cells，the number of SP positive nerve fibers and the expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 molecules were detected by HE staining and immunohistochemistry.Results：Each dose group of female red radish could reduce the levels of IL-1β and TNF-α in AGA model rats according to the dose change（P < 0.01）.The number of mast cells in synovium，the number of activated mast cells and the percentage of degranulation in AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female red radish（P < 0.01）.The distribution density of SP positive nerve fibers in the synovium of AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female red radish（P < 0.01）.The expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 molecules in articular synovium of AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female radish（P < 0.01）.Conclusion：Female red radish can reduce the inflammatory reaction of ankle joint in AGA model rats.The activation of mast cells and SP immunoreactive nerve fibers in synovium may be involved in the inflammatory response and pain conduction of gouty arthritis.Female red radish can reduce the expression of pathway molecules TLR/MyD88/IL-1β to play its anti-inflammatory role.

【Keywords】acute gouty arthritis;female red radish;anti-inflammatory;signal path TLR/MyD88/IL-1β;

function mechanism

隨著人民生活水平的提高，我國痛風的發(fā)病率逐年上升，目前高達1.1%，給國人健康帶來諸多的不良影響[1]。但現(xiàn)行痛風指南推薦的常規(guī)藥物因存在諸多不良反應，一定程度地限制了臨床應用。因此，研制高效低毒的抗痛風新藥是目前研究的熱點之一。筆者的前期實驗結(jié)果提示，雌性紅萊菔可激活急性痛風性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）大鼠模型核因子NF-E2相關(guān)因子-抗氧化反應元件（Nrf2-ARE）通路，使機體的抗氧化酶產(chǎn)生增加，達到對AGA大鼠模型的抗氧化應激作用[2-3]。筆者擬明確雌性紅萊菔對AGA大鼠模型是否具有抗炎作用及可能的作用機制，揭示雌性紅萊菔治療AGA的作用靶點及機理，為其防治AGA提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取健康SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（320±40）g，購于遼寧（本溪）長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SYXK（遼）2013-0009。大鼠均飼養(yǎng)于正常生活環(huán)境下，飼料喂養(yǎng)，予自由飲食、飲水。

1.2 實驗藥品與儀器 依托考昔片（美國默沙東公司，產(chǎn)品批號N014801，規(guī)格120 mg）;雌性紅萊菔濃縮原粉（沈陽抗風竤生物技術(shù)有限公司，食準字SC11712011603862，規(guī)格1 g）;尿酸鈉鹽（美國Sigma-Aldrich公司）;大鼠IL-1β及TNF-α檢測ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生貿(mào)易有限公司）;兔抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88多克隆抗體、辣根酶標記羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）;1%甲苯胺藍溶液（雷根生物有限公司）;即用型免疫組化SP試劑盒（小鼠/兔）（福州創(chuàng)新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）;小鼠抗SP多克隆抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司];JY5002電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;TDL-40B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）;101-2A數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器公司）;anthos 2010全自動酶標儀（奧地利 AnthosLabtecInstruments）;BA200，4X-100X數(shù)碼顯微系統(tǒng)Ⅱ-顯微鏡（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。實驗儀器均由中國醫(yī)科大學科學實驗中心一部提供。

2 方 法

2.1 動物分組和AGA大鼠模型建立 按文獻[2]方法進行。將48只SD大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，依托考昔組，雌性紅萊菔低、中、高劑量組，每組8只。配置10 mL尿酸鈉結(jié)晶溶液（MSUC）混懸溶液，將10%水合氯醛溶液，按照0.3 mL·（100 g）的劑量大鼠皮下注射，以鎮(zhèn)靜催眠，再以無菌操作的方法，用1 mL注射器針頭分別在模型對照組，依托考昔組，雌性紅萊菔低、中、高劑量組大鼠右踝的脛跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)，以45°注射0.2 mL的MSUC，建立AGA大鼠模型?？瞻讓φ战M在右踝內(nèi)注入相同體積的生理鹽水。

2.2 藥物用量和給藥方式 按文獻[2]方法進行。大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)人和動物的體表面積計算法，雌性紅萊菔低、中、高劑量組分別給予雌性紅萊菔208.33 mg·kg·d、416.67 mg·kg·d、625 mg·kg·d灌胃，依托考昔組給予依托考昔12.5 mg·kg·d灌胃，空白對照組及模型對照組則以生理鹽水灌胃，灌胃量按照大鼠體質(zhì)量計算，每日1次，療程5 d。

在用藥治療的第3天，建立AGA大鼠模型。

2.3 血清中IL-1β和TNF-α含量測定 大鼠于末次灌胃1 h后麻醉處死，經(jīng)腹主動脈采血，置4℃冰箱凝固，再離心后收集上層血清，置-80℃冰箱保存待測。用免疫組化法測定血清中白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。

2.4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的病理變化和TLR2、TLR4、MyD88分子表達的測定 采血后，剪取大鼠右后足內(nèi)踝脛跗關(guān)節(jié)（關(guān)節(jié)近端及遠端各保留約0.5 cm），去皮，常規(guī)組織處理、石蠟包埋切片，HE染色法觀察大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的病理變化。

免疫組化法測定大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）分子的表達，計量方法為每張切片取5個高倍視野（×400）鏡檢，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定各組平均積分光密度值（IOD），計算平均IOD值。

2.5 大鼠關(guān)節(jié)滑膜肥大細胞及脫顆粒觀察 按文獻[4]方法進行。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后，用0.5%甲苯胺藍液染色10 min，水洗后入冰醋酸液化直到胞核和顆粒清晰，常規(guī)脫水、透明后封片。染色切片由1名病理醫(yī)師于光學顯微鏡下盲法觀察滑膜肥大細胞（MC）形態(tài)并計數(shù)。形態(tài)判定方法：細胞膜完整、細胞核染色清楚的為穩(wěn)定狀態(tài)MC;細胞膜破裂、周圍組織中存在藍染狀顆粒的為脫顆粒MC。計數(shù)方法為：每張切片在高倍視野（×400）下選取MC數(shù)目最多的3個視野進行計數(shù)，計算單位面積（mm）內(nèi)MC數(shù)量、活化MC數(shù)量和脫顆粒百分率。脫顆粒百分率=（脫顆粒MC數(shù)/MC總數(shù)）×100%。

2.6 P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維染色 按文獻[4]方法進行。采用免疫組化法測定大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織P物質(zhì)（SP）免疫反應陽性神經(jīng)纖維，計數(shù)方法為：每張切片在高倍視野（×400）下選取SP陽性神經(jīng)纖維數(shù)目最多的3個視野進行計數(shù)，計算單位面積（mm）內(nèi)SP陽性神經(jīng)纖維的分布密度。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法進行多組均數(shù)間的兩兩比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)比較 空白對照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)正常;模型對照組滑膜腫脹，細胞可見明顯增生，結(jié)構(gòu)排列紊亂，并伴有大量白細胞浸潤，可見小血管生成及成纖維細胞;依托考昔組滑膜組織輕度腫脹，細胞輕度增生，結(jié)構(gòu)排列稍顯紊亂，可見少量白細胞浸潤及少量成纖維細胞;雌性紅萊菔低劑量組滑膜組織腫脹，細胞增生，結(jié)構(gòu)排列較紊亂，可見白細胞浸潤及小血管生成;雌性紅萊菔中劑量組滑膜組織腫脹細胞增生，結(jié)構(gòu)排列較紊亂，可見白細胞浸潤及成纖維細胞;雌性紅萊菔高劑量組滑膜組織輕度腫脹，細胞輕度增生，結(jié)構(gòu)排列稍顯紊亂，可見少量白細胞浸潤及少量成纖維細胞。雌性紅萊菔可明顯減輕踝關(guān)節(jié)滑膜組織的炎癥反應。見圖1。

3.2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型對照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于空白對照組（P < 0.01）;依托考昔組、雌性紅萊菔各劑量組血清IL-1β、TNF-α水平均明顯低于模型對照組（P < 0.01）;雌性紅萊菔低、中劑量組血清IL-1β水平高于依托考昔組（P < 0.05），高劑量組與依托考昔組相當;雌性紅萊菔低、中劑量組血清TNF-α水平降低程度與依托考昔組相當，高劑量組TNF-α水平明顯低于依托考昔組（P < 0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88分子表達比較 模型對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4、MyD88分子表達明顯高于空白對照組（P < 0.01）;依托考昔組、雌性紅萊菔各劑量組TLR2、TLR4、MyD88分子表達明顯低于模型對照組（P < 0.01）;雌性紅萊菔低、中劑量組降低TLR2、TLR4、MyD88分子表達效果低于依托考昔組（P < 0.01），而高劑量組降低TLR2、TLR4、MyD88分子表達效果與依托考昔組相當;雌性紅萊菔各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

3.4 AGA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88分子表達與IL-1β、TNF-α水平的相關(guān)性分析 AGA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88分子的表達與血清IL-1β、TNF-α水平均呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表3。

3.5 各組大鼠滑膜MC數(shù)量及脫顆粒百分率比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠滑膜部位的MC數(shù)量、活化MC數(shù)量及脫顆粒百分率明顯增加（P < 0.01）;依托考昔組MC數(shù)量、活化MC數(shù)量及脫顆粒百分率顯著低于模型對照組（P < 0.01），其總數(shù)和脫顆粒百分率接近空白對照組;雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低模型大鼠滑膜部位MC數(shù)量、活化MC數(shù)量及脫顆粒百分率（P < 0.01）;雌性紅萊菔低、中各劑量組降低MC數(shù)量及其脫顆粒效果低于依托考昔組（P < 0.01），而雌性紅萊菔高劑量組降低滑膜MC數(shù)量及其脫顆粒效果與依托考昔組相當;雌性紅萊菔各劑量組間降低大鼠滑膜MC數(shù)量及其脫顆粒效果差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表4。

3.6 各組大鼠滑膜SP陽性神經(jīng)纖維數(shù)比較 空白對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中有一定數(shù)量SP陽性神經(jīng)纖維的分布;模型對照組大鼠滑膜部位的SP陽性神經(jīng)纖維數(shù)量顯著增加（P < 0.01）;依托考昔組SP陽性神經(jīng)纖維顯著減少，但仍高于空白對照組，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;雌性紅萊菔各劑量組可依劑量變化相應地降低模型大鼠SP陽性神經(jīng)纖維的分布密度（P < 0.01）;低、中劑量組降低效果低于依托考昔組（P < 0.01），而高劑量組降低效果與依托考昔組相當;雌性紅萊菔各劑量組間降低大鼠滑膜SP陽性神經(jīng)纖維的分布密度效果差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表5。

4 討 論

中醫(yī)學認為，痛風內(nèi)因先天稟賦不足，外因風寒濕熱等外邪入侵，致濕熱內(nèi)蘊濁毒或臟腑積熱蘊毒，熱毒、濁毒攻注著附骨節(jié)、留滯血脈而發(fā)病[5]。萊菔是蘿卜的炮制品，其功效為驅(qū)寒除濕、活血化瘀、滋陰補腎、理氣健脾等，可廣泛用于風寒濕痹、風濕熱痹及痹證久病不愈導致的正氣不足[6]。因此，萊菔具有防治痛風的理論基礎(chǔ)。

萊菔中含有豐富的萊菔硫烷（SFA）[7]、萊菔素（SFE）[8]、類黃酮、烯酸等活性物質(zhì)，均具有較強的抗氧化性[9-10]，可在抗AGA中發(fā)揮重要作用。

MSU能類似于外源性的佐劑被TLR所識別，激活的TLRs募集MyD88后，相繼活化IL-1受體相關(guān)激酶、TGF-β活化激酶，進而激發(fā)IκB激酶級聯(lián)反應，激活核轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動與炎癥免疫有關(guān)的IL-1β、TNF-α等基因的表達，產(chǎn)生大量IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子[11]。王婧等[12]發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷可抑制TLR/MyD88信號通路，明顯降低TNF-α含量。本實驗結(jié)果也表明，雌性紅萊菔能夠抑制AGA大鼠模型滑膜組織中TLR2、TLR4、MyD88分子的表達，降低AGA大鼠IL-1β、TNF-α水平，AGA大鼠模型滑膜組織中TLR2、TLR4、MyD88分子的表達與AGA大鼠IL-1β、TNF-α水平呈正相關(guān)。因此，筆者認為雌性紅萊菔中的萊菔硫烷可能通過抑制AGA大鼠模型滑膜組織中TLRs/MyD88/IL-1β信號通路，降低IL-1β、TNF-α水平，減輕AGA大鼠踝關(guān)節(jié)的炎癥反應。

SP物質(zhì)是機體受傷害后傳入末梢釋放的一種興奮性遞質(zhì)，與疼痛直接相關(guān)。SP表達及其受體分布在骨關(guān)節(jié)患者出現(xiàn)異常改變，DIRMEIER等[13]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎和類風濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)SP含量升高，表明SP在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的重要作用。

MC在痛風的病變過程中起著重要的作用，可通過釋放組胺、蛋白水解酶、花生四烯酸產(chǎn)物以及細胞因子等炎性介質(zhì)，維持或加重滑膜炎癥及對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞[14]。有研究表明，某些類黃酮物質(zhì)可抑制SP的釋放[15]，同時抑制MC的活化[16]。本實驗結(jié)果也顯示，雌性紅萊菔可不同程度的減少AGA模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中MC數(shù)量、脫顆粒百分率及SP陽性神經(jīng)纖維數(shù)，這可能是雌性紅萊菔中類黃酮物質(zhì)作用的體現(xiàn)。

綜上所述，雌性紅萊菔可能是通過其含有的多種有效成分，多靶點、綜合作用于機體，發(fā)揮抗炎、止痛的治療作用。

中藥通常是通過多層次、多靶點、多環(huán)節(jié)作用于機體而發(fā)揮作用，而由于條件限制，雌性紅萊菔中有效物質(zhì)的定量分析尚未開展，其治療AGA的作用機制尚未完全闡明，應選用高尿酸血癥、尿酸性腎病等動物模型從尿酸生成、排泄等方面進行深入研究，通過血清藥理學、網(wǎng)絡藥理學、代謝組學等技術(shù)從細胞、基因、分子層面進一步探討雌性紅萊菔的藥效物質(zhì)及作用靶點，目前上述研究工作正在進行中。本研究的意義不僅是豐富和完善中醫(yī)藥防治痛風性關(guān)節(jié)炎理論，闡明臨床中藥有效的科學內(nèi)涵，且目前國內(nèi)外類似研究報道尚少，故本研究可能為開發(fā)能夠抗痛風的中藥新藥奠定理論基礎(chǔ)，因而具有重要的理論意義和臨床應用價值。

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