武 坤 郭 翀 馬曉波 李云濤 張學(xué)美 李林燕 羅 珊 史明霞

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650032）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leu?kemia，ALL）是一種源自淋巴系造血細(xì)胞前體的惡性血液病，其中，急性T 淋巴細(xì)胞白血?。═ cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）由T 細(xì)胞祖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化所致，發(fā)病率在兒科ALL 中占10%～15%，在成人中占25%［1-2］。雖然T-ALL 的治療效果在逐漸改善，但原發(fā)性耐藥或復(fù)發(fā)性T-ALL 患者預(yù)后仍較差［3-4］。Notch1 是一種跨膜受體，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、血管生成和轉(zhuǎn)移［5］。Notch1 信號激活在包括T-ALL在內(nèi)的大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。有研究提示，Notch 通路激活后，可通過NF-κB 通路抑制細(xì)胞凋亡，在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥過程中發(fā)揮作用［7-8］。然而，關(guān)于Notch1 與T-ALL 臨床指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性，及其在T-ALL 細(xì)胞中與NF-κB 通路的相互作用目前尚不明確。本研究旨在分析Notch1 在T-ALL 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的表達(dá)，明確Notch1 與T-ALL 臨床特征和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上明確沉默Notch1 對NF-κB 通路的影響。本研究有望為T-ALL提供新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2016 年1 月至2019 年1 月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科收治的初診為T-ALL 的患者67 例作為試驗(yàn)組，包括男性28 例，女性39 例，年齡19～72 歲；同時(shí)選取67 例健康體檢者作為對照，包括男性33 例，女性34 例，年齡20～75 歲。T-ALL 患者均經(jīng)過骨髓學(xué)、細(xì)胞免疫分型和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查確診，排除合并其他腫瘤或急慢性感染性疾病患者。靜脈采集研究對象外周血5 ml，收集于含EDTA 的抗凝管。收集患者臨床資料，包括年齡、性別、LDH水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級。T-ALL 危險(xiǎn)度分級為標(biāo)危組、中危組、高危組。標(biāo)危組必須同時(shí)滿足以下所有條件：①年齡≥1 歲且<10 歲；②WBC<50×109L-1；③潑尼松反應(yīng)良好；④非T-ALL；⑤非成熟B-ALL；⑥無t（9；22）或BCR/ABL 融合基因；⑦無t（4；11）或MLL/AF4 融合基因；⑧無t（1；19）或E2A/PBX1融合基因；⑨治療第15天骨髓呈M1（原幼淋細(xì)胞<5%）或M2（原幼淋細(xì)胞5%～25%），第33 天骨髓完全緩解。中危組必須同時(shí)滿足以下4個(gè)條件：①無t（9；22）或BCR/ABL融合基因；②潑尼松反應(yīng)良好（第8 天外周血白血病細(xì)胞<1×109L-1）；③標(biāo)危誘導(dǎo)緩解治療第15 天骨髓呈M3（原幼淋細(xì)胞>25%）或中危誘導(dǎo)緩解治療第15天骨髓呈M1/M2；④如有條件進(jìn)行微小殘留?。∕RD）檢測，則第33天MRD<10-2。同時(shí)至少符合以下條件之一：⑤WBC≥50×109L-1；⑥年齡≥10 歲；⑦T-ALL；⑧t（1；19）或E2A/PBX1 融合基因陽性；⑨年齡<1 歲且無MLL 基因重排。高危組必須滿足下列條件之一：①潑尼松反應(yīng)不良（第8 天外周血白血病細(xì)胞>1×109L-1）；②t（9；22）或BCR/ABL 融合基因陽性；③t（4；11）或MLL/AF4融合基因陽性。

對67例患者進(jìn)行電話隨訪或門診隨訪，隨訪起點(diǎn)時(shí)間為確診日期，總隨訪時(shí)間為24個(gè)月。本研究已獲得昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。所有研究對象均知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll?PM 400，Sigma-Aldrich，美國）；TRIzol 試劑（RNAiso Plus，TaKaRa，大連）；RPMI1640 完全培養(yǎng)基、Revert-Aid Reverse Transcriptase（Thermo Scientific，美國）；SGExcel FastSYBR Mixture、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海生工）；RIPA 裂解液（Sigma）；硝酸纖維素膜（Millipore）；Notch1、p-IκBα、IKKβ、GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG 抗體（OmnimAbs）。NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國）；StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

1.2 方法

1.2.1 Ficoll 密度梯度離心法分析PBMC 取外周血5 ml，加入5 ml 淋巴細(xì)胞分離液，再加入2 倍體積的PBS 緩沖液吹打混勻。將混合液以300 g 離心30 min。分離PBMC，PBS 緩沖液洗滌2 次，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 PBMC 總RNA 提取 采用TRIzol 試劑提取PBMC 總RNA。向細(xì)胞中加入1 ml TRIzol 試劑，加入200 μl 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置2 min，于4 ℃、400 g下離心15 min。取上層水相置于新管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，于4 ℃、400 g 下離心15 min，去上清。以70%的乙醇洗滌2 次，4 ℃、200 g 離心5 min，去上清，自然干燥。加入30～50 μl DEPC 水溶解，采用NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)分析RNA 的純度及濃度。A260/A280>2.0，A230/A260>1.8表明RNA質(zhì)量達(dá)到要求。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 將T-ALL 細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)。設(shè)計(jì)靶向Notch1 的siRNA 序列（si-Notch1：5′-GCCAAATTCAACGGGCTCTTG-3′），委托上海漢恒生物構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒載體并包裝為慢病毒顆粒，以空白慢病毒載體作為陰性對照（si-NC）。采用慢病毒感染細(xì)胞，24 h后進(jìn)行后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)分組：正常PBMC 組、Jurkat 細(xì)胞組、Jurkat 細(xì)胞+si-NC（陰性對照）組和Jurkat細(xì)胞+si-Notch1組。

1.2.4 qRT-PCR 采用RevertAid Reverse Tran?scriptase 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照2×SGExcel FastSYBR Mixture 說明書，配制qPCR 反應(yīng)體系（25 μl 2×SGExcel FastSYBR Mixture+1 μl 正向引物+1 μl 反向引物+1 μl cDNA，加入超純水補(bǔ)齊至50 μl），上機(jī)檢測，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，20 s；變性95 ℃，3 s；退火/延伸60 ℃，30 s；35 個(gè)循環(huán)。引物均由上海生工合成。Notch1 正向引物：5'-GAT?GTTGGCAAGGTAGTCGAT-3'，反向引物：5'-GCTCCCTGTGTTCTCATTGAT-3'；IκBα 正向引物：5'-GCCTGGACTCCATGAAAGACGA-3'，反向引物：5'-CAATTTCTGGCTGGTTGGTGAT-3'；IKKβ 正向引物：5'-GAAGACTTGAATGGAACGGT-3'，反向引物：5'-CACTGAGTGGCAGGCTTATC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，GAPDH 正向引物：5'-ACGGGAAGCTTGTCAT?CAATGG-3'；反向引物：5'-ATGGTGGTGAAGACGC?CAGTGG-3'。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。以Notch1 mRNA 在T-ALL 患者PBMC 中相對表達(dá)量中位數(shù)為界，將T-ALL 組分為Notch1 高表達(dá)組和Notch1低表達(dá)組。

1.2.5 Western blot 離心收集各組細(xì)胞，采用1×RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白定量。取50 μg 蛋白樣品與凝膠緩沖液混合，煮沸10 min 后，行SDS-PAGE 電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，非特異性抗體采用含5%脫脂牛奶的1×Tris 緩沖液封閉，室溫下孵育2 h。在4 ℃下，膜與Notch1、p-IκBα、IKKβ或Notch1 GAPDH 抗體在含5%脫脂牛奶的1×TBS 緩沖液中孵育過夜。采用1×TBS 洗滌3 次后，膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG 抗體在室溫下孵育2 h。在Fluor Chem Systems（ProteinSimple）下觀察結(jié)果，采用系統(tǒng)自帶的軟件（Alpha View Software）分析目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示。采用t檢驗(yàn)或ANOVA檢驗(yàn)分析組間基因表達(dá)差異。采用Spearman 相關(guān)性分析確定Notch1 的表達(dá)水平與T-ALL 患者LDH 水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級等臨床指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)；Kaplan-Meier 法分析Notch1 表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch1 在T-ALL 患者PBMC 中的表達(dá) qRTPCR 分析T-ALL 組和健康組（各67 例）PBMC 中Notch1 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示，與健康組相比，T-ALL組Notch1表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 健康組和T-ALL組PBMC中Notch1 mRNA表達(dá)分析Fig.1 Analysis of Notch1 mRNA expression in PBMC of healthy group and T-ALL group

2.2 Notch1 表達(dá)水平與T-ALL 臨床指標(biāo)和NF-κB通路間的相關(guān)性 Notch1表達(dá)水平與T-ALL臨床指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果如表1 所示，Notch1 表達(dá)水平與LDH 水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級之間呈正相關(guān)（r=0.102，P=0.025；r=0.247，P=0.019；r=0.429，P=0.006），而與年齡和性別無顯著相關(guān)性。Notch1 與NF-κB 通路抑制性蛋白IκBα mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.754，P=0.039），與NF-κB 通路激活性蛋白IKKβ mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.738，P=0.002）。提示Notch1 可能在T-ALL 疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而NF-κB通路是其作用靶點(diǎn)。

表1 Notch1表達(dá)水平與T-ALL患者臨床指標(biāo)和NF-κB通路間的相關(guān)性Tab.1 Correlation between Notch1 expression and clinical characteristics and NF-κB pathway in T-ALL patients

2.3 Notch1 表達(dá)水平與T-ALL 患者生存時(shí)間的關(guān)聯(lián) 對67例患者進(jìn)行電話隨訪或門診隨訪，未出現(xiàn)失訪病例。通過Kaplan-Meier 法分析Notch1 表達(dá)水平與T-ALL 患者生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明，Notch1 高表達(dá)組［（12.7±3.4）個(gè)月］的中位總生存時(shí)間低于Notch1 低表達(dá)組［（18.5±2.2）個(gè)月］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.677，P=0.038），見圖2。表明Notch1表達(dá)水平與T-ALL患者生存時(shí)間有關(guān)。

圖2 Notch1表達(dá)水平與T-ALL患者生存時(shí)間的關(guān)聯(lián)Fig.2 Associations between Notch1 expression level and survival time in patients with T-ALL

2.4 沉默Notch1 基因?qū)κBα 和IKKβ mRNA 表達(dá)的影響 qRT-PCR 分析各組mRNA 的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，Jurkat 細(xì)胞Notch1 mRNA 的表達(dá)水平高于正常PBMC（P<0.05），下調(diào)Notch1基因表達(dá)后，與Jurkat 細(xì)胞+si-NC 組相比，IκBα mRNA 水平顯著上調(diào)（P<0.05），而IKKβ mRNA 顯著下調(diào)（P<0.05）。見圖3。以上結(jié)果表明沉默Notch1 基因可在mRNA水平上抑制NF-κB通路。

圖3 沉默Notch1基因后Notch1、IκBα、IKKβ mRNA表達(dá)的變化Fig.3 Changes of Notch1，IκBα，IKKβ mRNA expressions after silencing Notch1 gene

2.5 沉默Notch1 基因?qū)κBα 和IKKβ 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果表明，Jurkat 細(xì)胞Notch1 蛋白表達(dá)水平高于正常PBMC，下調(diào)Notch1 基因的表達(dá)后，與Jurkat 細(xì)胞+si-NC 組相比，p-IκBα 水平上調(diào)，而p-IKKβ 下調(diào)（圖4）。以上結(jié)果表明，沉默Notch1基因可在蛋白質(zhì)水平上抑制NF-κB通路。

圖4 沉默Notch1基因?qū)κBα和IKKβ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of silencing Notch1 gene on expressions of IκBα and IKKβ protein

3 討論

T-ALL 是一種T 淋巴細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤。近年來，隨著化療治療手段的進(jìn)步，T-ALL患者完全緩解率有了一定的改善［9-10］。然而，其總體生存率仍然較低。復(fù)發(fā)是當(dāng)前治療T-ALL 面臨的主要挑戰(zhàn)［11-12］。因此，深入了解T-ALL 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對于改善T-ALL患者預(yù)后至關(guān)重要。

Notch1 是一種廣為人知的調(diào)節(jié)因子，在許多惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用［13］。Notch1 主要分布在造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面，參與了造血細(xì)胞的自我更新。Notch1 的突變或過度激活可能會(huì)導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞異常［14］。在小鼠模型中，Notch1信號通路的組成性激活可誘導(dǎo)T-ALL 的發(fā)生，而抑制Notch1 信號通路可抑制T-ALL 細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。此外，Notch1 與化療耐藥有關(guān)，這是T-ALL 預(yù)后不良的主要原因［16］。Notch 信號通路由Notch 受體、配體、DNA 結(jié)合蛋白和靶分子構(gòu)成，當(dāng)Notch 通路被激活后，胞內(nèi)片段可進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，Notch1 的靶基因主要包括Hes1、c-myc和NF-κB等［17］。

在T-ALL 中，IKK/I-κB/NF-κB 通路是Notch1 主要的下游通路。NF-κB 是一種序列特異性DNA 結(jié)合蛋白，可誘導(dǎo)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB 通路可降低Notch1 突變的白細(xì)胞數(shù)量，提示NF-κB 可能是Notch1 的靶點(diǎn)［18］。通過抑制Nocth1 受體的活化調(diào)控下游靶基因，在T-ALL臨床治療中已經(jīng)展現(xiàn)出良好的前景［19］。

本研究共納入67 例T-ALL 患者，收集其年齡、性別、LDH 水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級等臨床資料。分離其PBMC并提取RNA，分析Notch1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與健康人相比，T-ALL 組PBMC中Notch1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）。提示Notch1 在T-ALL 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。此外，課題組分析了Notch1 表達(dá)與T-ALL 臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1 與LDH 水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級呈正相關(guān)（r=0.102，P=0.025；r=0.247，P=0.019；r=0.429，P=0.006），而與年齡和性別無顯著相關(guān)性，提示Notch1 mRNA 表達(dá)水平可能是T-ALL診斷及預(yù)后評估的重要因素之一。本研究納入的樣本量有限，有關(guān)結(jié)論還需更多驗(yàn)證。課題組進(jìn)一步在細(xì)胞水平上分析了Notch1 對NF-κB通路的影響，通過RNA 干擾技術(shù)成功下調(diào)Notch1在mRNA 和蛋白水平上的表達(dá)，結(jié)果表明沉默Notch1可明顯上調(diào)IκBα mRNA 和p-IκBα 蛋白水平，明顯下調(diào)IKKβ mRNA 和p-IKKβ 蛋白水平，提示NF-κB通路是Notch1 的重要靶點(diǎn)之一，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Notch1 基因在T-ALL 患者血漿PBMC 中高表達(dá)，與患者LDH 水平、白細(xì)胞水平和危險(xiǎn)度分級等臨床指標(biāo)和生存率相關(guān)，Notch1 mRNA 有望成為T-ALL 早期診斷和預(yù)后評估的重要指標(biāo)。此外，Notch1 可能通過NF-κB 通路發(fā)揮調(diào)控作用。但本研究中的病例數(shù)有限，下一步工作還需要擴(kuò)大樣本量對文中結(jié)論做進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)對Notch1參與T-ALL發(fā)展的分子機(jī)制做深入探討。