李傳榮 趙子明 陳 儉 董加建 崔留義

（鄭州市第七人民醫(yī)院，鄭州市心血管病醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000）

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，心血管疾病在全球均是致死的主要原因。在歐洲，每年有超過400 萬人因心血管疾病死亡，約占所有死亡人數(shù)的45%，其中冠心病占20%［1］。在美國，2015 年有超過270 萬人死于心血管疾病，其中44%死于冠心?。?］。在中國大陸，2015 年冠心病的病死率為110/100 000，且此比例仍在逐年上升［3］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠心病中最危險和最致命的一種類型［4］。發(fā)生AMI后骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）會動員至外周血，然后外周血EPCs向缺血心臟歸巢并分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，啟動血管新生過程來修復(fù)損傷［5］。已有研究顯示，與健康人相比，AMI 患者EPCs 的增殖和遷移能力減弱，提高EPCs的增殖和遷移能力能夠改善梗死后的血管新生和心肌功能［6-7］。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-37 是重要的抗炎因子，其在冠心病患者血清中表達升高，且表達量與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［8］。但IL-37 與AMI 患者EPCs 的關(guān)系目前尚無相關(guān)報道。因此，本研究探究IL-37 對AMI患者外周血EPCs 增殖和遷移的影響和可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 納入對象 收集2019 年3 月在鄭州市第七人民醫(yī)院新確診的6 例AMI 患者外周靜脈血各10 ml，患者年齡為30～67 歲?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：既往具有冠心病史，冠脈造影檢查至少具有1 支冠脈的狹窄程度>50%；具有典型的胸痛史，胸痛至少持續(xù)15 min；心電圖檢查具有2個或2個以上的相鄰導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高或壓低、出現(xiàn)病理性Q 波；肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白等血清心臟標(biāo)志物活性較正常值至少增加2倍。排除指標(biāo)：3周內(nèi)接受過大手術(shù)或受過外傷；心力衰竭和嚴(yán)重的心臟瓣膜疾??；嚴(yán)重的全身性疾病、慢性腎病、肝病、惡性腫瘤、炎癥性疾病；既往有精神疾病病史、認(rèn)知功能障礙。另外收集同期進行體檢的年齡、性別和身體質(zhì)量指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義的6例健康志愿者的外周靜脈血各10 ml。

1.1.2 主要試劑 Ficoll Paque PLUS 淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE 公司；胎牛血清、人纖維連接蛋白、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Life technology；CCK-8 試劑盒、ECL 試劑和RIPA 裂解液購自上海碧云天；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗和1，1'-雙十八酯基-3，3，3，3，四甲基-吲哚碳菁高氯酸鹽標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）購自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso plus 購自大連寶生物工程有限公司；HiFiScript 快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒和RealSYBR Mixture 試劑盒購自北京康為世紀(jì)；Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑、IL-37兔抗人多克隆抗體（1∶1 000）和熒光標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ［fluorescein-labelled ulex europaeus agglutininⅠ（UEAⅠ），F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ］購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）兔多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9 兔多克隆抗體、磷酸化Akt（phospho-Akt，p-Akt）兔單克隆抗體、Akt 兔單克隆抗體、磷酸化mTOR（p-mTOR）兔單克隆抗體、mTOR 兔單克隆抗體、磷酸化p70S6K 兔單克隆抗體（p-p70S6K）、p70S6K 兔單克隆抗體、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）兔單克隆抗體和ERK1/2兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 EPCs 的分離和培養(yǎng) 根據(jù)文獻［9］中的方法，從外周血單個核細(xì)胞中分離EPCs。使用Ficoll分離液將單個核細(xì)胞從AMI 患者和健康志愿者外周靜脈血中分離出來。無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次后300 g 離心10 min。將收集的細(xì)胞接種至包被有10 mg/L人纖維連接蛋白的60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入5 ml 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（含5 mmol/L D-葡萄糖、20%胎牛血清、3.0 mg/L 內(nèi)皮細(xì)胞生長補充劑、100 kU/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素）。在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，去除未貼壁細(xì)胞并換成新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換1 次培養(yǎng)基。待細(xì)胞達到80%左右融合時，胰蛋白酶消化后按1∶3 比例傳代。參考文獻［10］，用DiI-Ac-LDL 和FITC-UEA-Ⅰ免疫熒光雙標(biāo)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。后續(xù)實驗選擇第3～6代細(xì)胞。

1.2.2 AMI患者外周血EPCs的分組和處理 將接種后充分貼壁的AMI 患者外周血EPCs 隨機分為3 組：對照組、pcDNA3.1 組和IL-37 組。其中對照組不進行任何處理，pcDNA3.1 組和IL-37 組分別使用Lipofectamine3000 試劑轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 質(zhì)粒和構(gòu)建的pcDNA3.1-IL-37質(zhì)粒。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測 將2×103個AMI 患者外周血EPCs 接種于96 孔板，待細(xì)胞充分貼壁后，根據(jù)

1.2.2 方法將細(xì)胞分組，分別在轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h和72 h時每孔加入10μl CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，波長設(shè)置為450 nm。

1.2.4 細(xì)胞遷移檢測 使用24孔板的Transwell小室進行EPCs 的遷移檢測。胰蛋白酶消化未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/pcDNA3.1-IL-37 質(zhì)粒24 h 的EPCs，并將2×104個細(xì)胞接種于上室，加入200μl不含血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基；下室加入600μl 含20%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，用棉簽將膜上表面未遷移的細(xì)胞擦去，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡拍攝遷移過膜的細(xì)胞，并計算各組細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5 RNA 提取和qRT-PCR 轉(zhuǎn)染72 h 后，按照RNAiso Plus 說明書提取各組細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA 去除基因組DNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μl cDNA 為模板，設(shè)置25 μl qRT-PCR 反應(yīng)體系：正反向引物各1μl，12.5μl RealSYBR Mixture，ddH2O 補足至25 μl。按照以下程序進行PCR 反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40 個循環(huán)。IL-37 正向引物：5'-GCTTAGAAGACCCGGCTGGAAG-3'，反向引物：5'-GCAAAGAA?GATCTCTGGGCGTA-3'；MMP9 正向引物：5'-TTC?CAAACCTTTGAGGGCGA-3'，反向引物：5'-CTGTA?CACGCGAGTGAAGGT-3'。GAPDH 正向引物：5'-CACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3'，反向引物：5'-CTGATTTTGGAGGGATCTCGCC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.2.6 Western blot 蛋白檢測 收集各組細(xì)胞，用含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等量各樣品總蛋白行SDS-PAGE 分離不同分子量的蛋白，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉2 h 后加入一抗，包括IL-37（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、p-Akt（1∶800）、Akt（1∶1 000）、p-mTOR（1∶800）、mTOR（1∶800）、p-p70S6K（1∶800）、p70S6K（1∶800）、p-ERK1/2（1∶1 500）和ERK1/2（1∶1 500），4 ℃過夜孵育，然后加入二抗室溫孵育1 h。最后進行ECL顯色。Image J 軟件分析條帶的凈光密度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 IL-37 在AMI 患者外周血EPCs 中高表達 熒光顯微鏡觀察所分離培養(yǎng)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出DiI-Ac-LDL 和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性（圖1A），表明成功分離并培養(yǎng)出了EPCs。檢測IL-37在健康志愿者和AMI患者外周血EPCs中的表達，結(jié)果見圖1B、C：與健康志愿者相比，IL-37 mRNA 和蛋白水平在AMI患者EPCs中均升高（P<0.01）。

圖1 IL-37在AMI患者外周血EPCs中高表達Fig.1 IL-37 expression was elevated in peripheral blood EPCs in patients with AMI

2.2 IL-37 過表達可促進AMI 患者EPCs 增殖Western blot 結(jié)果表明，與對照組相比，IL-37 在IL-37 組中表達升高（P<0.001），在pcDNA3.1 組中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2A、B；與對照組相比，IL-37 組中PCNA 蛋白表達增加（P<0.001），pcDNA3.1組中PCNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2A、C。CCK-8 檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見圖2D，與對照組相比，IL-37 組中細(xì)胞活力增加（P<0.01），pcDNA3.1 組中細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 IL-37過表達可促進AMI患者EPCs增殖Fig.2 IL-37 overexpression promotes proliferation of EPCs from patients with AMI

2.3 IL-37過表達可促進細(xì)胞遷移 Transwell檢測各組細(xì)胞遷移，結(jié)果見圖3A，與對照組相比，IL-37組中遷移細(xì)胞數(shù)目增加（P<0.001），pcDNA3.1 組中遷移細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；檢測MMP9 蛋白和mRNA 表達，結(jié)果見圖3B、C，與對照組相比，IL-37 組中MMP9 蛋白和mRNA 表達均上調(diào)（P<0.001），pcDNA3.1 組中MMP9 蛋白和mRNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 IL-37過表達可促進AMI患者EPCs遷移Fig.3 IL-37 overexpression promotes migration of EPCs from patients with AMI

2.4 IL-37過表達對Akt/mTOR 和ERK1/2通路的影響 Western blot 檢測Akt/mTOR 和ERK1/2 通路相關(guān)蛋白表達，結(jié)果如圖4 所示：與對照組相比，IL-37組中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 和p-p70S6K/p70S6K均增加（P<0.05 或P<0.01），pcDNA3.1 組中以上指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與對照組相比，p-ERK1/2/ERK1/2在IL-37組和pcDNA3.1組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 IL-37過表達對Akt/mTOR和ERK1/2通路的影響Fig.4 Effect of IL-37 overexpression on activation of Akt/mTOR and ERK1/2 signaling pathways

3 討論

IL-37是IL-1家族成員，在許多炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎作用［11-12］。IL-37 在動脈粥樣硬化斑塊中表達增加，過表達IL-37 可減少動脈粥樣硬化斑塊擴張［13］。研究報道IL-37 在心衰、動脈粥樣硬化和急性冠狀動脈綜合征患者血清中的表達均增加［12］。XU 等［14］的研究顯示，在AMI 小鼠中過表達IL-37 可通過減少左室短軸縮短率改善心肌功能。但目前IL-37與AMI患者EPCs的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，IL-37 在AMI 患者外周血EPCs 中表達上調(diào)，表明IL-37 與AMI 患者的EPCs可能存在某種聯(lián)系。

近年來，心血管疾病的相關(guān)研究越來越多的聚焦于EPCs。心血管疾病中EPCs 的增殖和遷移能力受損，因此，如何增加其增殖和遷移能力是治療心血管疾病的一個重要方向［6，15］。AMI患者EPCs的增殖和遷移能力減弱，因此提高此類型患者EPCs的增殖和遷移能力為AMI 的治療提供了方向。本研究發(fā)現(xiàn)過表達IL-37能增加AMI患者外周血EPCs的細(xì)胞活力。PCNA 是協(xié)助DNA 復(fù)制的DNA 滑動鉗家族成員，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物之一［16］。本研究結(jié)果顯示，過表達IL-37 明顯增加了EPCs 中PCNA 的蛋白表達。Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)IL-37 過表達顯著增加了EPCs 遷移細(xì)胞數(shù)目。MMPs 是鋅離子依賴的蛋白酶家族，至少包括20 個成員，能夠降解所有已知的細(xì)胞外基質(zhì)成分，可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。MMP9 是MMPs 家族成員，在組織缺血后表達上調(diào)，且在缺血條件下可通過促進細(xì)胞遷移啟始血管生成［17］。本研究進一步探究了IL-37對MMP9表達水平的影響。結(jié)果顯示IL-37 過表達明顯增加了MMP9 mRNA 和蛋白表達，表明IL-37 過表達能增強AMI 患者外周血EPCs的增殖和遷移。

Akt/mTOR和ERK1/2通路被普遍認(rèn)為是細(xì)胞增殖和遷移的啟動因子，EPCs的增殖和遷移也與這兩條通路的活化有關(guān)［15，18-19］。已有研究顯示IL-37在肝癌中通過抑制Akt/mTOR 通路從而抑制肝癌細(xì)胞生長［20］，但IL-37 通過激活A(yù)kt 通路促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［21］，表明IL-37 在不同疾病中對Akt通路的作用不同。此外，IL-37 可抑制ERK1/2 通路緩解塵螨誘導(dǎo)的小鼠慢性過敏性哮喘［22］。因此，本研究中進一步探究了IL-37 與Akt/mTOR 和ERK1/2通路的關(guān)系。結(jié)果顯示，IL-37 過表達明顯增加了Akt 和mTOR 的磷酸化以及mTOR 下游p70S6K 的磷酸化，但對ERK1/2 的磷酸化水平影響不大。提示在AMI 患者外周血EPCs 中，IL-37 過表達可激活A(yù)kt/mTOR通路，但對ERK1/2通路沒有影響。總之，本研究表明IL-37 過表達能夠增加AMI 患者外周血EPCs 的增殖和遷移，這可能是通過激活A(yù)kt/mTOR通路發(fā)揮作用的。在探究IL-37 的作用時，本文僅從IL-37 過表達的角度探究了IL-37 對AMI 患者外周血EPCs 增殖和遷移的影響，而未考慮下調(diào)IL-37表達的影響，這是本研究的一個不足之處，課題組將對其進行進一步研究。