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        定量檢測破傷風(fēng)類毒素酶聯(lián)免疫吸附法的建立及初步應(yīng)用

        2022-07-21 09:15:28祝傳順周振發(fā)朱衛(wèi)華
        中國免疫學(xué)雜志 2022年10期
        關(guān)鍵詞:聯(lián)合疫苗絮狀夾心

        祝傳順 周振發(fā) 洪 禹 薛 瑩 姚 雷 朱衛(wèi)華

        (北京智飛綠竹生物制藥有限公司,北京市細(xì)菌性疫苗工程技術(shù)研究中心,北京 100176)

        無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗作為計(jì)劃免疫品種,在我國得到了廣泛應(yīng)用,可有效預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng),其中破傷風(fēng)疫苗的主要成分為破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid,TT)[1]。2020 版《中國藥典》三部采用絮狀單位測定法檢測TT抗原含量,結(jié)果判定為肉眼觀察,較為主觀,存在一定誤差[2]。建立和完善TT 抗原的ELISA 方法是非常必要的。目前歐美國家吸附無細(xì)胞百白破(組分)聯(lián)合疫苗(DTaP)生產(chǎn)工藝過程中均采用ELISA 法進(jìn)行質(zhì)量控制,而國內(nèi)許多廠家主要側(cè)重于構(gòu)建百日咳類毒素(pertussis toxoid,PT)、百日咳絲狀血凝素(filamentous hemag?glutinin,F(xiàn)HA)與百日咳黏附素(pertactin,PRN)抗原的ELISA檢測方法[3-5]。本文采用TT為包被抗體,建立雙抗體夾心ELISA 法精確定量TT抗原含量,以期為破傷風(fēng)疫苗質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 TT 抗毒素絮狀反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品(0022,950 Lf/支)購自中國食品藥品檢定研究院;大鼠抗TT抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備;羊抗大鼠IgG-HRP 購自Sigma-Aldrich;TT 抗原標(biāo)準(zhǔn)品(04/150,690 Lf/支)購自英國國家生物制品研究所,稀釋至2 Lf/ml 備用;TT 抗原(批 號(hào):20190505T-1、20190505T-2、20190505T-3、20190505T-4、20190505T-5、20190505T-6)、DTaP 實(shí)驗(yàn) 樣 品(批 號(hào):20180101、20180102、20180103、20200101、202004002、202005003、202005004)和氫氧化鋁佐劑均由本實(shí)驗(yàn)室提供;DTaP市售品(批號(hào):R3L38、U3D57、ROC941M)購自賽諾菲-巴斯德公司;405LSR 型洗板機(jī)購自美國伯騰儀器有限公司;Spectra Max 190 型酶標(biāo)儀購自美國美谷分子儀器有限公司;Legend Micro17 型臺(tái)式離心機(jī)購自Thermo Fisher;DPX-9272132 型恒溫培養(yǎng)箱購自上海?,斣O(shè)備有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 包被抗體和檢測抗體工作濃度確定 將TT抗毒素(100 Lf/ml)分別稀釋為2、1、0.5、0.25 Lf/ml包被酶標(biāo)板,大鼠抗TT 檢測抗體分別稀釋2 000、5 000、10 000、20 000 倍進(jìn)行棋盤滴定,羊抗大鼠IgG-HRP 抗體10 000 倍稀釋,檢測0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 813、0.003 906、0.001 953、0.000 976 7、0.000 488 35 Lf/ml 系列稀釋TT 抗原標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)0.125 Lf/ml標(biāo)準(zhǔn)品450 nm處吸光度A450>1.0、0~0.062 5 Lf/ml TT 抗原濃度區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)>0.99、陰性對照(NC)A450<0.1 這3 條標(biāo)準(zhǔn)篩選最佳包被濃度和檢測抗體濃度[6-7]。

        1.2.2 雙抗體夾心ELISA 法構(gòu)建 采用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)將TT(100 Lf/ml)稀釋至0.25 Lf/ml,包被酶標(biāo)板,37 ℃孵育1 h,按照常規(guī)ELISA 操作步驟進(jìn)行,加入TMB底物液顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測定A450[6-7]。

        1.2.3 雙抗夾心ELISA法驗(yàn)證

        1.2.3.1 線性關(guān)系的重復(fù)性 建立絮狀單位(Lf/ml)對應(yīng)A450的log-log 直線回歸方程,確定最佳線性關(guān)系,實(shí)驗(yàn)重復(fù)8 次,計(jì)算8 次檢測的r值,r2均應(yīng)>0.99,考察線性關(guān)系的重復(fù)性。

        1.2.3.2 特異性 將高濃度TT 抗原和DT 抗原及100 ng/ml PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原作為待檢品,磷酸鹽緩沖液作為陰性對照,進(jìn)行雙抗體夾心ELISA法特異性評價(jià)。以陰性對照(NC)A450的2.1倍作為判定陰性與陽性的標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。

        1.2.3.3 準(zhǔn)確度、精密度驗(yàn)及定量限確定 定量限:檢測準(zhǔn)確稀釋的0.002 5、0.0012 5、0.000 625、0.000 312 5 Lf/ml 的TT 抗原標(biāo)準(zhǔn)品,各濃度同批次檢測8 次,批間檢測3 次,計(jì)算實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)間檢測的回收率、均值xˉ、標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)及變異系數(shù)(CV);準(zhǔn)確度及精密度:在磷酸鹽緩沖液中分別添加已知的TT抗原標(biāo)準(zhǔn)品至絮狀濃度為0.04、0.01、0.002 5 Lf/ml,再進(jìn)行雙抗體夾心ELISA 法檢測,各濃度批內(nèi)重復(fù)測 定8 次,批 間 測 定3 次,計(jì) 算 檢 測 回 收 率、xˉ、s及CV[10]。

        1.2.4 氫氧化鋁佐劑對TT 抗原的吸附能力測定向TT 抗原中加入氫氧化鋁佐劑和0.85%氯化鈉溶液,使鋁離子終濃度達(dá)到0.5 mg/ml,絮狀單位分別達(dá)到7、21、70、140、350、700、1 400 Lf/ml,攪拌吸附18~24 h,8 000 g 離心5 min,取上清,測定上清TT 抗原含量,結(jié)合TT 抗原理論量計(jì)算吸附率(%)=(TT 抗原理論量-上清TT 抗原量)/TT 抗原理論量×100%。

        1.2.5 抗原吸附率測定 取6 批TT 抗原經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附,使鋁離子終濃度達(dá)到0.5 mg/ml,TT抗原吸附后濃度分別達(dá)到200 Lf/ml,10 mg/ml 加入檸檬酸鈉混勻,37 ℃孵育24 h 進(jìn)行解吸附,解吸附后的供試品和未經(jīng)解吸附供試品同時(shí)8 000 g 離心5 min,分別取上清檢測TT 抗原含量,計(jì)算抗原吸附率(%)=(解吸附抗原量-未解吸附上清抗原量)/解吸附抗原量×100%,解吸附回收率(%)=解吸附抗原量/理論量×100%。

        1.2.6 TT 抗原含量測定 采用已建立的雙抗體夾心ELISA 法對6 批TT 抗原含量進(jìn)行測定,同時(shí)與類毒素絮狀單位測定法檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

        1.2.7 DTaP 中TT 抗原含量及吸附率測定 采用雙 抗 體 夾 心ELISA 法 對7 批DTaP 實(shí) 驗(yàn) 樣 品、3 批DTaP 市售品的TT 抗原含量及TT 抗原吸附率進(jìn)行測定。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,雙抗體夾心ELISA 法與絮狀單位測定法相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性分析,判定標(biāo)準(zhǔn):相關(guān)系數(shù)r的絕對值在0.5~0.8呈顯著相關(guān)(或中等程度相關(guān)),>0.8 呈高度相關(guān)[8,10]。組間比較采用配對t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 雙抗體夾心ELISA 法建立 檢測抗體濃度10 000 倍稀釋,包被抗體濃度為0.25 Lf/ml 時(shí),建立的雙抗體夾心ELISA 法在TT 抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0~0.062 5 Lf/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r2>0.99,圖1)。

        圖1 TT雙抗體夾心ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Fig.1 Establishment of TT double antibody sandwich ELISA standard curve

        2.2 雙抗體夾心ELISA法驗(yàn)證結(jié)果

        2.2.1 線性關(guān)系的重復(fù)性驗(yàn)證 重復(fù)試驗(yàn)8 次,r和r2均>0.99,說明建立的線性關(guān)系可重復(fù)性較好(表1)。

        表1 雙抗體夾心ELISA法線性重復(fù)性驗(yàn)證Tab.1 Verification for linearity repetitive of double anti?body sandwich ELISA method

        2.2.2 特異性驗(yàn)證 建立的雙抗體夾心ELISA 法對高濃度DT 抗原、PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原的檢測結(jié)果均為陰性,而對0.2 Lf/ml TT 抗原檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性(表2),表明該方法特異性較好。

        表2 特異性驗(yàn)證Tab.2 Specificity verification

        2.2.3 準(zhǔn)確度、精密度及定量限驗(yàn)證

        2.2.3.1 定量限 不同濃度TT 抗原檢測結(jié)果見表3。TT 抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.000 625 Lf/ml 時(shí),批內(nèi)和批間回收率分別為102.40%和99.09%,CV分別為4.089%和5.092%,準(zhǔn)確度和精密度較好;TT抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.000 312 5 Lf/ml 時(shí),批內(nèi)和批間回收率分別為77.59% 和72.00%,CV分別為14.44%和15.56%,準(zhǔn)確度和精密度較差。因此確定該方法準(zhǔn)確檢測的最低濃度為0.000 625 Lf/ml。

        2.2.3.2 準(zhǔn)確度和中間精密度 雙抗體夾心ELISA法檢測0.0400 0、0.0100 0、0.002 5 Lf/ml 3 個(gè)濃度TT 抗原批內(nèi)回收率分別為89.90%、106.60%、105.20%,批間回收率分別為90.65%、102.87%、103.96%,均在85%~115%范圍內(nèi),同時(shí)3 個(gè)濃度批內(nèi)和批間檢測CV均<10%(表3)。表明該檢測方法準(zhǔn)確度和精密度較好。

        表3 精密度及準(zhǔn)確度驗(yàn)證Tab.3 Precision and accuracy verification

        2.3 雙抗體夾心ELISA法檢測TT抗原的實(shí)際應(yīng)用

        2.3.1 氫氧化鋁佐劑對TT 抗原吸附能力的測定鋁離子濃度為0.5 mg/ml 時(shí),7~700 Lf/ml 范圍內(nèi)TT抗原吸附率均>90%。隨著樣品含量增加,吸附率略有下降,TT 抗原含量為1 400 Lf/ml 時(shí),吸附率下降為81.4%(表4)。

        表4 佐劑對TT抗原的吸附能力Tab.4 Adsorption capacity of adjuvant to TT antigen

        2.3.2 TT 抗原吸附率測定 6 批TT 抗原佐劑吸附后解吸附,絮狀單位回收率為97.6%~112.1%,表明該解吸附方法可將TT 抗原從氫氧化鋁佐劑上解吸附,解吸附回收率>95%,同時(shí)不對雙抗體夾心ELISA法測定TT 抗原造成干擾。連續(xù)6 批TT 抗原原液吸附率均>98%(表5)。

        表5 TT抗原吸附率Tab.5 TT antigen adsorption rate

        2.3.3 兩種不同方法檢測TT 抗原含量結(jié)果比較雙抗體夾心ELISA法和絮狀單位測定法檢測結(jié)果間變異系數(shù)<15%,兩種方法檢測結(jié)果比值為0.93~1.15。采用Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)2 種方法測定結(jié)果高度相關(guān)(r=0.94)。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,2 種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.13,P>0.05,表6)。

        2.3.4 聯(lián)合疫苗中TT抗原加入量及吸附率 采用雙抗體夾心ELISA 法對7 批DTaP 實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合疫苗樣品、3 批市售DTaP 聯(lián)合疫苗成品經(jīng)解吸附處理測定TT 抗原含量,已知理論加入量為7 Lf/ml,10 批樣品均值為7.93 Lf/ml,CV為9.82%。同時(shí)測定聯(lián)合疫苗的TT 抗原吸附率均>99%,說明TT 抗原與DT抗原、PT抗原、FHA抗原、PRN抗原混合,TT抗原未發(fā)生解離(表7)。

        3 討論

        DTaP聯(lián)合疫苗已在國內(nèi)外推廣應(yīng)用,而抗原定量控制已成為質(zhì)量控制的工作重點(diǎn)。為制備合格的無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗,建立和完善各種抗原的檢測方法是必需的[8]。TT 抗毒素有效抗原含量測定是破傷風(fēng)疫苗質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。本文采用TT 和相應(yīng)酶標(biāo)抗體建立的雙抗體夾心ELISA 法在0~0.062 5 Lf/ml 范圍能夠建立較理想的線性關(guān)系(r2>0.99),方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法可重復(fù)性、特異性和穩(wěn)定性良好,可靠測量范圍為0.000 625~0.040 000 Lf/ml,定量限為0.000 625 Lf/ml。分別采用雙抗體夾心ELISA 法和絮狀單位測定法測定6 批TT 抗原,配對t檢驗(yàn)顯示結(jié)果間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Pearson相關(guān)性分析也顯示兩種檢測方法高度相關(guān)。

        本研究探索了雙抗體夾心ELISA 法在TT 抗原質(zhì)量控制過程中的應(yīng)用,通過檢測氫氧化鋁佐劑對TT抗原的吸附能力發(fā)現(xiàn),1 mg鋁離子可吸附1 400 Lf TT 抗原,而成品中對應(yīng)的TT 含量為7 Lf/ml,鋁離子含量為0.5 mg/ml,這一結(jié)果對于制備高吸附率的多聯(lián)多價(jià)疫苗意義重大。同時(shí)探索了雙抗體夾心ELISA 法在TT 吸附原液和百白破聯(lián)合疫苗中的應(yīng)用。

        《中國藥典》2020 版中的絮狀單位測定法是檢測人員以肉眼觀察的半定量方法,較為主觀,敏感度低,不適用于TT 抗原吸附后的含量測定,難以完成對原液和成品的檢測要求[2];而雙抗體夾心ELISA 法能夠?qū)乖焦に嚽昂筮M(jìn)行精確定量,可適用于原液和成品檢測工作。

        綜上,本研究建立的雙抗體夾心ELISA 法更有利于聯(lián)合疫苗制備過程中TT抗原的質(zhì)量控制,對提高我國破傷風(fēng)疫苗品質(zhì)具有重要意義。

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