畢銘轅 李建輝 康 文 孫永濤 (中國人民解放軍空醫(yī)軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院傳染病科,西安 710038)
白細胞介素(interleukin,IL)是由多種細胞產(chǎn)生,參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、免疫應答、免疫激活、信息傳遞等多種過程的一類細胞因子[1]。由于IL作用廣泛,IL 家族根據(jù)其主要性質(zhì)分為IL-1、IL-2、趨化因子、IL-10、IL-12及IL-17等。IL家族中與HIV-1感染及感染后患者免疫炎癥激活狀態(tài)相關(guān)的因子較多,包括主要為促炎癥因子的IL-1 家族中的IL-1β、IL-6和IL-18[2-4];具有趨化作用的IL-8[5];主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的IL-10家族中的IL-10、IL-16等[6-7]。盡管已有研究表明HIV-1 感染后,患者體內(nèi)這些IL 表達會有一定改變,但其在血漿中的表達與未治療HIV-1感染者的病毒學水平,尤其是與HIV-1 DNA 水平是否相關(guān)鮮有報道。本研究根據(jù)HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平對HIV-1 感染者進行分組,觀察不同組間IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達差異,并分析其與HIV-1 RNA及HIV-1 DNA的相關(guān)性。
1.1 資料
1.1.1 研究對象 選取空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院就診的HIV-1 感染者75 例,所有HIV-1 感染者均經(jīng)初篩和HIV-1抗體確認試驗,無HBV/HCV 合并感染或腫瘤,一般狀況良好,采血前均未接受過任何抗病毒治療。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(201911-04),患者血液樣本僅用于科研,75例患者一般資料及部分檢測結(jié)果見表1。
表1 未治療HIV患者基本信息Tab.1 Basic information of untreated patients with HIV
1.1.2 主要試劑與儀器 QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN);HIV-1 核酸檢測試劑盒、DNA 定量檢測試劑盒(廣州海力特);CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒(同生時代);Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte 試劑盒(R&D公司);FACSAria Ⅱ流式細胞儀(BD公司);
1.2 方法
1.2.1 PBMC 中DNA 提取 抽取受試者EDTA 抗凝的外周血10 ml用于PBMC 分離、流式細胞檢測和病毒核酸定量檢測。采用密度梯度離心法分離得到PBMC,用于后續(xù)檢測。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取PBMC樣本總DNA,嚴格按照試劑盒說明書進行,采用50 μl buffer AE 洗脫DNA 并保存于滅菌的200 μl EP 管。采用ScanDrop 儀檢測提取的DNA 核濃度,直接進行HIV-1 DNA 定量檢測或-20 ℃凍存。
1.2.2 HIV-1 RNA 定量檢測 采用HIV-1 核酸檢測試劑盒,在ABI 7500 熒光PCR 儀上對血漿樣本中HIV-1 RNA 進行定量檢測,嚴格按照試劑盒說明操作,結(jié)果以U/ml表示,最低檢測限為20 U/ml。
1.2.3 HIV-1 DNA 定量檢測 采用HIV-1 DNA 定量檢測試劑盒,在ABI 7500 熒光PCR 儀上對PBMC樣本中提取的HIV-1 DNA 進行定量檢測,嚴格按照試劑盒說明操作,結(jié)果以copies/106cells 表示,最低檢測限為20 copies/106cells。
1.2.4 外周血CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數(shù) 采用CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP 熒光單克隆抗體試劑盒和BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞、CD8+T 細胞數(shù),取50 μl 全血,采用20 μl 單克隆混合抗體混合物孵育20 min,紅細胞裂解液裂解紅細胞,上機檢測,結(jié)果采用Flowjo軟件進行分析。
1.2.5 Luminex 液相芯片檢測趨化因子 選取IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18并訂制對應的Luminex Assay Human Premixed Multi-Analyte Kit 試劑盒。取50 μl 血漿樣本并嚴格按照說明書操作,Luminex 200儀檢測。
1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0 軟件和Graph Pad Prism 8 軟件進行統(tǒng)計學處理、分析及繪圖。一般資料采用描述性分析,計量資料以±s表示。組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗,兩兩比較采用q檢驗。由于HIV-1 DNA 及HIV-1 RNA 分布差異較大,取對數(shù)后進行相關(guān)性分析。相關(guān)性分析采用散點圖及Pearson 相關(guān)分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 各組病毒學水平及外周血CD4+T 細胞、CD8+T細胞計數(shù)比較 根據(jù)患者HIV-1 DNA是否<103copies/106cells 或HIV-1 RNA 是 否<106 U/ml 分 為4 組:DNA 高水平組(DHG)、DNA 低水平組(DLG)、RNA高水平組(RHG)和RNA 低水平組(RLG),各組患者一般資料、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數(shù)和CD4+/CD8+差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2、表3)。
表2 HIV-1 DNA高、低組間差異Tab.2 Differences between high and low HIV-1 DNA groups
表3 HIV-1 RNA高、低組間差異Tab.3 Differences between high and low HIV-1 RNA groups
2.2 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 表達比較 根據(jù)以上分組方法,對DLG 與DHG、RLG與RHG 組患者IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18表達進行比較,結(jié)果表明IL-8 表達在兩種分組方法下差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),DHG 組與DLG組IL-1β 水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1)。
圖1 各組IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達Fig.1 Expressions of IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-16 and IL-18 in each group
2.3 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 與病毒學指標相關(guān)性分析 上述結(jié)果表明不同HIV-1 RNA或HIV-1 DNA 水平組間趨化因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16和IL-18表達存在差異。進一步相關(guān)性分析表明,IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與lgDNA 相關(guān)(r=-0.420、0.271、-0.332 和0.294,P<0.05),IL-1β和IL-8表達則與lgDNA 無關(guān)(r=-0.121和0.123,P>0.05)。同時,IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與lgRNA 相關(guān)(r=-0.298、-0.462、0.299、-0.229 和0.269,P<0.05),而IL-8 表 達 與lgRNA 無 關(guān)(r=0.123,P>0.05,圖2)。
圖2 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表達與病毒學指標相關(guān)性Fig.2 Correlation between expressions of IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-16 and IL-18 and virological indicators
IL-1β 是一種重要的炎癥細胞因子,主要由外周血單核細胞和巨噬細胞分泌產(chǎn)生,與細胞凋亡密切相關(guān)[8]。炎癥、感染等刺激往往會誘導IL-1β水平升高,如HIV-1感染者腸道相關(guān)淋巴組織中IL-1β基因表達較健康人明顯增高[2]。但也有研究表明,IL-1β在體外可抑制淋巴細胞系、Jurkat 細胞和分離的PBMC 中HIV-1 復制,且可能通過阻斷caspase-3 表達和激活進而抑制病毒復制[4,9]。
IL-6 為促炎細胞因子,參與調(diào)節(jié)多種生理學過程,尤其是在急性炎癥反應和從急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用[10]。長期以來,HIV-1 感染已被證明可誘導單核細胞和巨噬細胞表達和分泌IL-6,即使在病毒學抑制情況下,接受治療的HIV 感染者血漿IL-6 水平也明顯高于匹配良好的未感染對照組[11-12]。最近研究表明,HIV-1感染者血漿IL-6水平升高與貧血、心血管疾病、癌癥等不良臨床結(jié)果相關(guān)[13-15]。IL-6 水平持續(xù)升高證明活動性炎癥可能對HIV-1 感染者預后具有重要臨床意義,但其是否參與并影響病毒復制過程尚無定論[3]。
IL-10 被認為是可由多種類型免疫細胞產(chǎn)生的Th2 型細胞因子,具有間接抑制Th1 反應的功能。研究表明,HIV-1、HBV、HCV 等多種病毒導致的慢性感染狀態(tài)下,IL-10 表現(xiàn)出對T 細胞的持續(xù)抑制作用,進而促進病毒感染活性[16]。IL-10可直接作用于抗原提呈細胞,減少刺激分子表達,阻止初始T細胞成熟,或直接作用于T 細胞以限制其增殖、功能分化[6]。HIV 感染者PBMC 產(chǎn)生的IL-10 可抑制CD4+和CD8+T細胞增殖及細胞因子產(chǎn)生,而阻斷IL-10可有效地在體外恢復這些細胞的功能[17]。
IL-16是一種淋巴細胞趨化因子,作為CD4的天然可溶性配體,具有促炎和免疫調(diào)節(jié)特性,對CD4+T細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞也具有趨化作用[7]。IL-16 的抗病毒活性最初是在分離培養(yǎng)的CD8+T 細胞中發(fā)現(xiàn)的,可抑制HIV-1和SIV復制[18]。盡管IL-16和HIV-1 均以CD4 為受體,但研究表明其并不共享共同結(jié)合位點[19]。因此,IL-16作為一種內(nèi)源性抗病毒因子,在抑制HIV-1復制過程中發(fā)揮重要作用。
IL-18是一種促炎癥、促凋亡和致動脈粥樣硬化的細胞因子,屬于IL-1 細胞因子家族,關(guān)于其對HIV-1復制的影響一直頗有爭議。有研究認為IL-18通過誘導嗜堿性粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5等Th2 型細胞因子,促進初始CD4+T 細胞發(fā)育和分化為Th2 效應細胞,從而抑制抗HIV-1 的免疫作用,間接促進HIV-1 復制[20]。也有研究認為IL-18 通過介導IFN-γ 產(chǎn)生及上調(diào)SAMHD1 表達限制HIV-1 在初始巨噬細胞中的復制,或通過抑制caspase-3 激活和表達抑制HIV-1復制[4,21]。
本研究通過對75例未治療HIV患者血漿IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16 和IL-18 水平進行檢測,并根據(jù)患者HIV-1 RNA 或HIV-1 DNA 水平進行分組,比較組間各IL 水平,結(jié)果表明除病毒學指標有差異外,組間患者一般情況及免疫學指標,如CD4+T 細胞、CD8+T 細胞計數(shù)和CD4+/CD8+差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),患者免疫學背景相似。相對于低病毒載量患者,高病毒載量患者血漿IL-10 和IL-18 表達升高,IL-1β、IL-6和IL-16表達降低,而兩組間IL-8表達差異無統(tǒng)計學意義。相關(guān)性分析也表明IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與病毒載量相關(guān),與既往研究提出的IL與HIV-1感染程度相關(guān)的結(jié)論一致[2-7]。此外,高HIV-1 DNA 患者血漿IL-10 和IL-18表達高于低HIV-1 DNA患者,IL-6和IL-16表達則低于低HIV-1 DNA 患者,而IL-1β 和IL-8 水平差異無統(tǒng)計學意義。相關(guān)性分析結(jié)果也表明IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達與HIV-1 DNA 相關(guān)。由 于HIV-1 DNA 被認為是衡量患者病毒儲存庫大小的重要指標,因此本研究認為IL-6、IL-10、IL-16 和IL-18 表達不僅與病毒載量有關(guān),還可能與病毒儲存庫規(guī)模有關(guān)。由此可知,IL在HIV-1感染中扮演重要角色,是否有其他IL亞族因子也與HIV-1病毒儲存庫規(guī)模相關(guān),以及這些趨化因子可能影響病毒儲存庫的具體機制有待進一步探索。