韓曉晴 吳景東 侯殿東 張小卿 王靚怡 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110000）

痤瘡又稱粉刺，是一種毛囊皮脂腺阻塞引發(fā)的慢性炎癥性疾病，各年齡段均可患病，青少年發(fā)病率較高，近年來(lái)發(fā)病年齡有向中年波及的趨勢(shì)，痤瘡是一種損美性疾病，讓患者承受經(jīng)濟(jì)壓力的同時(shí)，也帶來(lái)一定的心理負(fù)擔(dān)［1-2］。臨床數(shù)據(jù)研究表明，在西醫(yī)治療痤瘡的基礎(chǔ)上配合中醫(yī)辨證治療，能取得更好的治療效果，經(jīng)方枇杷清肺飲源自《醫(yī)宗金鑒》，臨床上用來(lái)治療肺經(jīng)風(fēng)熱型痤瘡，取得了較好的臨床效果［3-5］。中醫(yī)藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，目前針對(duì)枇杷清肺飲治療痤瘡的機(jī)制尚未完全闡明，本研究采用LPS 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證揭示枇杷清肺飲治療痤瘡的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療痤瘡提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化表皮細(xì)胞HaCaT（武漢典藏中心，1101HUM-PUMC000373）；枇杷清肺飲（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司）；大鼠血清（北京斯貝福公司）；LPS（Aladdin 公司）；PBS（雙螺旋公司）；CCK-8（碧云天有限公司）；TNF-α、IL-1β、IL-4、ELISA檢測(cè)試劑盒（萬(wàn)類生物有限公司）；AKR1B1 ELISA檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)生物公司）；TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix 及SYBR Green 試劑（北京BioTeke 公司）；NF-κBp65 抗體、P38 抗體、JNK 抗體、p-JNK 抗體、p-P38 抗體（美國(guó)CST 公司）；羊抗兔IgG-HRP（美國(guó)Thermo 公司）；內(nèi)參抗體GAPDH（Bioss公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；ELX-800酶標(biāo)儀（BioTek 公司）；倒置相差顯微鏡（麥克奧迪公司）；CO2培養(yǎng)箱（上海力申公司）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；熒光定量PCR儀（韓國(guó)BIONEER公司）；雙垂直蛋白電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 枇杷清肺飲與痤瘡共同靶點(diǎn)篩選 以化合物類藥性（drug-likeness，DL）>0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%為條件，使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（簡(jiǎn)稱TCMSP）篩選枇杷清肺飲中的中藥化學(xué)成分，獲取藥物的活性成分。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并建立藥物活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。在數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards（https：//www.gen?ecards. org/）中檢索痤瘡（acne）相關(guān)基因。采用Draw Venny Diagram 在線程序（http：//bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/Venn/）取枇杷清肺飲和痤瘡靶基因交集，獲得枇杷清肺飲與痤瘡的共同靶點(diǎn)。

DL 和OB 是評(píng)判藥物有效利用度的相關(guān)指標(biāo)，一般認(rèn)為OB≥30%且DL≥0.18 的藥物化學(xué)成分可被認(rèn)為是該藥物的有效成分［6］。

1.2.2 藥物間交集化合物及蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)藥物Venny圖得出各藥物間的交集化合物。將枇杷清肺飲與痤瘡共同靶點(diǎn)基因提交至String 網(wǎng)站（https：//string-db.org/），生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理分析。

1.2.3 GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析與KEGG 信號(hào)通路富集分析 導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，利用R3.6.0 軟件，安裝colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview 等程集包，獲取交集基因的生物功能及其在信號(hào)通路中的作用；對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，獲得條圖、氣泡圖；進(jìn)行KEGG分析，獲得條圖、氣泡圖及關(guān)鍵信號(hào)通路圖（只展示前20條統(tǒng)計(jì)學(xué)最顯著的結(jié)果）。

1.2.4 疾病-化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 結(jié)合枇杷清肺飲與痤瘡的共同靶點(diǎn)，以及KEGG 信號(hào)通路富集分析，構(gòu)建疾病-化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理分析。

1.2.5 HaCaT細(xì)胞體外驗(yàn)證

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及HaCaT細(xì)胞炎癥模型 HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度為90%左右，細(xì)胞正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，狀態(tài)良好，可傳代培養(yǎng)。依據(jù)文獻(xiàn)選用20 μg/ml 的LPS刺激HaCaT細(xì)胞，模擬痤瘡炎癥模型［7］。

1.2.5.2 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度枇杷清肺飲含藥血清及LPS對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響 消化正常的HaCaT 細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，每孔100 μl 的細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。除去正常組（250 μl 正常鼠血清）與對(duì)照組（250 μl正常鼠血清+20 μg/ml的LPS），設(shè)置8 組不同濃度含藥血清實(shí)驗(yàn)組（組1：243.75 μl正常鼠血清+6.25 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組2：237.5 μl正常鼠血清+12.5 μl枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組3：225 μl 正常鼠血清+25 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組4：200 μl 正常鼠血清+50 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組5：175 μl 正常鼠血清+75 μl枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組6：150 μl正常鼠血清+100 μl枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組7：100 μl正常鼠血清+150 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS；組8：50 μl 正常鼠血清+200 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS），實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，接種24 h 后進(jìn)行細(xì)胞加藥，將加藥后的細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中。分別培養(yǎng)24 h 后向96 孔板中加入CCK-8 溶液10 μl 混勻，將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后檢測(cè)OD450值。

1.2.5.3 細(xì)胞分組 依據(jù)不同濃度枇杷清肺飲含藥血清及LPS 對(duì)HaCaT 細(xì)胞活性影響結(jié)果，將細(xì)胞分為5 組，A 組為正常對(duì)照組，B 組為L(zhǎng)PS 模型組，C 組為枇杷清肺飲低劑量干預(yù)組（225 μl 正常鼠血清+25 μl枇杷清肺飲含藥血清+LPS）、D組為枇杷清肺飲中劑量干預(yù)組（200 μl 正常鼠血清+50 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS）、E組為枇杷清肺飲高劑量干預(yù)組（175 μl 正常鼠血清+75 μl 枇杷清肺飲含藥血清+LPS）。

1.2.5.4 ELISA檢測(cè)IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-80 ℃保存待測(cè)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α含量。

1.2.5.5 qPCR 檢測(cè)IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA表達(dá) Trizol法提取總RNA，對(duì)樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qPCR。qPCR 方法如下：以cDNA 1 μl為模板，GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。變性94 ℃2 min；變性95 ℃15 s，退火延伸60 ℃15 s，72 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)為反應(yīng)條件。每種樣本每個(gè)基因進(jìn)行4個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，分析方法利用2-ΔΔCt法。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5.6 Western blot 檢測(cè)JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65 蛋白表達(dá) 以4 ℃、10 000 g 離心10 min，分離上清即為所得的蛋白質(zhì)抽提物，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣本蛋白抽提物1 μl與19 μl PBS緩沖液混勻，取上清液，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。制備蛋白上樣液后SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，封閉后加入JNK、p-JNK、P38、p-P38 和NF-κBp65 孵育一抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜后，孵育二抗（37 ℃60 min），ECL 底物發(fā)光，應(yīng)用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS25.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以±s表示，組間比較用單因素方差分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枇杷清肺飲與痤瘡靶標(biāo)蛋白交集分析 TCMSP檢索枇杷清肺飲中的化合物，篩選出主要活性化合物153 個(gè)（已刪除重復(fù)值），將153 個(gè)活性成分輸入Drugbank 中（剔除無(wú)靶點(diǎn)成分），得到枇杷清肺飲中潛在作用靶標(biāo)304 個(gè)（已刪除重復(fù)值）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到acne相關(guān)靶點(diǎn)1 395個(gè)，采用Draw Venny Diagram 在線程序?qū)㈣凌饲宸物嫼宛畀彴谢蛉〗患?，得到靶點(diǎn)118個(gè)，枇杷清肺飲與痤瘡共同靶點(diǎn)韋恩圖見(jiàn)圖1。

圖1 維恩圖和PPI網(wǎng)絡(luò)確定枇杷清肺飲對(duì)痤瘡作用的共有基因Fig.1 Common genes of PIPA Qingfei Yin on acne were determined by Venn diagram and PPI network

2.2 藥物間交集化合物及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)枇杷清肺飲中藥重合韋恩圖見(jiàn)圖2。結(jié)合化合物-靶標(biāo)-KEGG-疾病網(wǎng)絡(luò)及圖2，對(duì)獲取的153 種具有相關(guān)生物活性的化學(xué)成分進(jìn)行分析，其中有較多作用靶點(diǎn)的成分主要有MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山奈酚）、MOL003896（7-甲氧基-2甲基異黃酮）、MOL004328（柚皮素），其可能是枇杷清肺飲發(fā)揮治療作用的重要成分。

圖2 枇杷清肺飲藥物重合韋恩圖Fig.2 Overlapping Wayne diagram of PIPA Qingfei Yin

分析結(jié)果可知，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中含118 個(gè)節(jié)點(diǎn)。拓?fù)浞治鏊脭?shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、IL-4、PTGS2（前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶）、TP53（P53 基因）、TNF（腫瘤壞死因子）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）、ESR1（雌激素受體1）、AKR1B1（重組人醛糖還原酶）和IL-1β 的節(jié)點(diǎn)度排名靠前，這些蛋白主要在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡和雌激素受體等方面發(fā)揮作用，提示其可能是枇杷清肺飲治療痤瘡的重要作用靶點(diǎn)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。

圖3 枇杷清肺飲治療痤瘡相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of PIPA Qingfei Yin in treatment of acne related targets

2.3 功能富集分析 對(duì)枇杷清肺飲和痤瘡共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，得到GO 條目1 922 個(gè)（P<0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目1 750 個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目39 個(gè)，分子功能（MF）條目133 個(gè)，分別占比91.05%、2.03%、6.92%，各組排名前10的條目見(jiàn)圖4。BP 條目中，排名前3 的為response to lipopoly?saccharide（脂多糖應(yīng)答反應(yīng)）、steroid metabolic pro?cess（類固醇代謝過(guò)程）、response to molecule of bac?terial origin（對(duì)細(xì)菌應(yīng)激原分子的反應(yīng)），提示枇杷清肺飲的靶點(diǎn)可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥與應(yīng)激等密切相關(guān)。

圖4 枇杷清肺飲與痤瘡交集基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of PIPA Qingfei Yin and acne intersection gene

KEGG 富集篩選到131 條信號(hào)通路（P<0.05），這些通路主要與炎癥信號(hào)通路、細(xì)胞因子相互作用和癌癥信號(hào)通路等有關(guān)，說(shuō)明枇杷清肺飲可通過(guò)多條通路發(fā)揮治療痤瘡的作用，尤其是PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路，見(jiàn)圖5。

圖5 枇杷清肺飲與痤瘡交集基因KEGG富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG gene between PIPA Qingfei Decoction and acne

2.4 疾病-化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將枇杷清肺飲治療痤瘡靶點(diǎn)和藥物活性成分、KEGG 通路構(gòu)建“疾病-化合物-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。網(wǎng)絡(luò)共有292個(gè)節(jié)點(diǎn)（1種疾病、153個(gè)活性成分、118個(gè)潛在治療靶點(diǎn)、20條通路），枇杷清肺飲網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)化合物作用多個(gè)靶點(diǎn)，也存在不同化合物作用于1 個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這正是中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)的重要證據(jù)。枇杷清肺飲的疾病-化合物-靶標(biāo)-通路圖見(jiàn)圖6。網(wǎng)絡(luò)中倒三角代表KEGG 通路，左邊同心圓代表中藥活性成分（小圓形顏色復(fù)合表示復(fù)合多種中藥活性成分），右邊同心圓代表枇杷清肺飲治療痤瘡的靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。

圖6 活性成分-靶點(diǎn)-KEGG-痤瘡相互作用關(guān)系Fig.6 Interaction between active ingredient-target-KEGGacne

2.5 HaCaT細(xì)胞體外細(xì)胞驗(yàn)證

2.5.1 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT 細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣，呈梭形及短梭形（圖7），生長(zhǎng)相對(duì)較快，接種后約2～3 d即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底的90%，HaCaT的接種密度均為1∶2，生長(zhǎng)2 d可傳代1次。

圖7 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)圖（×100）Fig.7 Diagram of HaCaT cell culture（×100）

2.5.2 不同濃度枇杷清肺飲含藥血清及LPS 對(duì)HaCaT 細(xì)胞活性影響 除正常組和對(duì)照組外，設(shè)置8 組不同濃度的含藥血清為實(shí)驗(yàn)組，觀察不同濃度枇杷清肺飲含藥血清對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，與正常組相比，加入LPS 后，對(duì)照組細(xì)胞OD 值顯著增高，提示LPS 對(duì)細(xì)胞存活率有刺激作用。加入枇杷清肺飲含藥血清后，含藥血清分組的細(xì)胞OD 值顯著降低，提示枇杷清肺飲含藥血清對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率有抑制作用，考慮到枇杷清肺飲含藥血清為25 μl、50 μl、75 μl 時(shí)，這3 組的細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此選定這3 組作為低、中、高劑量組濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖8。

圖8 不同濃度枇杷清肺飲含藥血清及LPS 對(duì)HaCaT 細(xì)胞活性的影響Fig.8 Effects of different concentrations of PIPA Qingfei Yin containing serum and LPS on HaCaT cell activity

2.5.3 枇杷清肺飲對(duì)HaCaT 細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 表達(dá)的影響 由表2 ELISA 結(jié)果分析可見(jiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，LPS 可顯著上調(diào)HaCaT細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 的表達(dá)；與LPS 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞相比，枇杷清肺飲可顯著下調(diào)IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α的表達(dá)。

表2 各組HaCaT細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α表達(dá)比較（±s）Tab.2 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α expressions comparison of HaCaT cells in each group（±s）

表2 各組HaCaT細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α表達(dá)比較（±s）Tab.2 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α expressions comparison of HaCaT cells in each group（±s）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with low dose group，3）P<0.05；compared withmiddle dose group，4）P<0.05.

TNF-α 40.32±9.80 142.35±8.291）134.48±2.75 77.96±12.712）3）49.62±8.252）3）4）Groups Normal Model Low dose Middle dose High dose IL-1β 97.12±22.72 333.04±38.881）279.69±28.902）200.38±7.242）3）145.82±18.782）3）4）AKR1B1 4.13±0.65 11.89±1.031）6.36±0.872）5.39±0.082）3）5.28±0.292）3）IL-4 23.60±2.49 78.00±3.431）59.70±6.732）38.12±7.672）3）30.18±5.012）3）

2.5.4 枇杷清肺飲對(duì)HaCaT 細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 由圖9 qPCR 結(jié)果分析可見(jiàn)，與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，LPS可顯著上調(diào)HaCaT 細(xì)胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA 的表達(dá)；與LPS誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞相比，枇杷清肺飲可顯著下調(diào)IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA的表達(dá)。

圖9 各 組HaCaT 細(xì) 胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF- α mRNA ΔCt均值對(duì)比Fig.9 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α mRNA ΔCt mean comparison of HaCaT cells in each group

2.5.5 枇杷清肺飲對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞中JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65 蛋白表達(dá)影響與正常對(duì)照組相比，LPS 可顯著上調(diào)HaCaT 細(xì)胞中JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65蛋白表達(dá)；與LPS誘導(dǎo)的模型組相比，枇杷清肺飲含藥血清可抑制P38-MAPK 和JNK-MAPK 的磷酸化以及NF-κBp65的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖10。

圖10 各 組HaCaT 細(xì) 胞JNK、p-JNK、P38、p-P38、NFκBp65蛋白表達(dá)Fig.10 Expressions of JNK，p-JNK，P38，p-P38 and NFκBp65 proteins in HaCaT cells of each group

3 討論

枇杷清肺飲是由枇杷葉、桑白皮、黃連、黃柏、人參、甘草組成的經(jīng)典名方，方中枇杷葉清瀉肺熱、桑白皮宣肺利氣，合以黃連、黃柏清燥濕熱，人參益氣托毒外出，甘草調(diào)和諸藥，是治療肺經(jīng)風(fēng)熱型痤瘡的經(jīng)方，相關(guān)臨床試驗(yàn)均證實(shí)該方治療痤瘡有顯著效果［8-9］，但枇杷清肺飲治療痤瘡的發(fā)病機(jī)制并沒(méi)有深入的實(shí)驗(yàn)研究，故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究并預(yù)測(cè)其作用機(jī)制，并進(jìn)行進(jìn)一步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果共獲取153種具有相關(guān)生物活性的化學(xué)成分，其中有較多作用靶點(diǎn)的成分主要含MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山奈酚）、MOL003896（7-甲氧基-2 甲基異黃酮）、MOL004328（柚皮素），提示以上成分可能是枇杷清肺飲發(fā)揮治療作用的有效成分。

槲皮素具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化等藥理作用。痤瘡發(fā)病機(jī)制與皮脂腺細(xì)胞的脂質(zhì)分泌、代謝紊亂密切相關(guān)。在人原始脂肪細(xì)胞中，槲皮素具有抗炎、改善胰島素抵抗的作用［10］。山奈酚具有良好的抗炎、抗癌、改善胰島素抵抗等藥理活性，研究表明，槲皮素、山奈酚通過(guò)抑制痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)紅霉素的抗炎作用，從而發(fā)揮治療痤瘡的作用［11］。柚皮素的生物學(xué)作用廣泛，具有抗炎、抗菌、清除自由基、抗氧化、抗癌、降血脂、解痙、預(yù)防和治療肝病、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用［12］；由此枇杷清肺飲防治痤瘡的活性成分主要通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化等發(fā)揮作用。

枇杷清肺飲與痤瘡共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)VEGFA、IL-4、PTGS2、TP53、TNF、EGFR、ESR1、AKR1B1和IL-1β節(jié)點(diǎn)度值排名靠前，這些蛋白主要在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡和雌激素受體等方面發(fā)揮作用；GO 功能富集分析結(jié)果得到BP 排名前3的條目為脂多糖應(yīng)答反應(yīng)、類固醇代謝過(guò)程、對(duì)細(xì)菌應(yīng)激原分子的反應(yīng)，提示枇杷清肺飲的靶點(diǎn)可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥與應(yīng)激等密切相關(guān)；KEGG 富集篩選得到131條信號(hào)通路，前幾條為PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路及IL-17 信號(hào)通路，與炎癥信號(hào)通路、細(xì)胞因子相互作用及癌癥信號(hào)通路等密切相關(guān)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果選定IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 靶點(diǎn)蛋白，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行研究。

MAPK 信號(hào)通路在生長(zhǎng)因子、炎癥因子等各種刺激因素作用下，通過(guò)一系列激酶磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、氧化應(yīng)激和凋亡等多種生理及病理過(guò)程［13］。根據(jù)信號(hào)通路激酶亞類的不同，MAPKs分為ERK1/2、JNK、P38和ERK5 4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。P38-MAPK 和JNK-MAPK 通過(guò)轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)激活，以促進(jìn)下游底物磷酸化來(lái)快速傳遞信號(hào)，MAPK 的激活能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6 等炎癥因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14-15］。

NF-κB是一種調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)表達(dá)的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示有TNF-α、IL-6、IL-8 等至少27 種不同炎癥反應(yīng)靶基因可被NF-κB 激活，產(chǎn)生大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，聚集于炎癥反應(yīng)部位［16-17］。另外NF-κB 還可刺激IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子表達(dá)，且細(xì)胞因子還可刺激NF-κB，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB 活化，使炎癥反應(yīng)持續(xù)、放大［18］。

IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子均由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)先天免疫，這些因子又稱前炎癥細(xì)胞因子，在固有性免疫應(yīng)答反應(yīng)的啟動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。Th2 介導(dǎo)體液免疫，分泌IL-4、和IL-13 等細(xì)胞因子。Th1 和Th2 彼此之間通過(guò)分泌細(xì)胞因子進(jìn)行相互調(diào)節(jié)和抑制，若Th1/Th2 分化失衡，則會(huì)引起細(xì)胞因子的分泌異常［20］。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制AKR1B1 后，NF-κBp65 入核比例明顯下降，提示AKR1B1可影響NF-κB通路的傳導(dǎo)［21］。

體外實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞，建立HaCaT細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)枇杷清肺飲能不同程度地抑制HaCaT 細(xì)胞炎癥模型中IL-1β、IL-4、TNF-α、AKR1B1 mRNA及蛋白的表達(dá)，抑制P38-MAPK和JNK-MAPK的磷酸化以及NF-κBp65 向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。提示枇杷清肺飲可能通過(guò)作用于IL-1β、IL-4、TNF-α、AKR1B1 等靶點(diǎn)，調(diào)控NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。