張祥凝 黨國徽 馮 娟 (北京大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,北京 100191)
我國心血管疾病發(fā)生率逐年上升,對國民健康造成極大危害。在多種心血管疾病相關免疫調(diào)節(jié)、組織重構(gòu)和代謝調(diào)節(jié)中,巨噬細胞均起關鍵作用[1]。巨噬細胞在不同刺激下表現(xiàn)為不同類型,誘導性表達更多的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide syn?thase,iNOS)或精氨酸酶,并相應地被稱為M1 型及M2 型巨噬細胞。其中M1 型巨噬細胞活化時分泌IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-10 等促炎細胞因子;M2 型巨噬細胞活化時分泌IL-23 等抑炎細胞因子,具有免疫抑制作用,參與組織器官重塑。心血管疾病發(fā)生發(fā)展的原因之一即促炎M1 型巨噬細胞和抑炎M2 型巨噬細胞調(diào)控失衡。相對于M1 型巨噬細胞,M2型巨噬細胞與心血管疾病關系的研究起始相對較晚,認識不夠充分。外泌體作為細胞間信號傳導的遞質(zhì),參與調(diào)節(jié)巨噬細胞極化,并參與M2 型巨噬細胞與其他細胞的信息傳遞及其介導的抑制炎癥、組織修復等過程,在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本文將綜述外泌體對M2 型巨噬細胞的調(diào)控及其與心血管疾病的聯(lián)系及相關研究進展。
M2型巨噬細胞具有高度表型異質(zhì)性,調(diào)控機體免疫與代謝,維持正常組織穩(wěn)態(tài)。如Kupffer細胞與脂肪組織巨噬細胞等組織駐留巨噬細胞通常維持M2 型[2]。M2 型巨噬細胞在心血管疾病中具有重要保護作用,如抑制血管炎癥反應,從而抵抗動脈粥樣硬化,調(diào)控高血壓時的血管重塑等。早期動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞主要為M2 型,因此不易發(fā)生過度急性炎癥。斑塊中巨噬細胞隨疾病進展逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訫1 型為主,也提示M2 型巨噬細胞在調(diào)控正常血管穩(wěn)態(tài)中的作用[3]。此外,M2 型巨噬細胞利于炎癥消退與細胞外基質(zhì)降解,為組織修復創(chuàng)造有利條件,或誘導成纖維細胞活化及遷移,以及通過上調(diào)TGF-β1 水平促進炎癥損傷后期纖維增生性修復[4-6]。M2 型巨噬細胞在組織浸潤巨噬細胞中的比例影響多種心血管疾病進程。
外泌體是一種細胞外囊泡,攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等作用于靶細胞,進而實現(xiàn)細胞間信息傳遞。心血管疾病中,包含于外泌體中的微小RNA(microRNA,miRNA)、轉(zhuǎn)錄因子及其他非編碼RNA調(diào)控M2型巨噬細胞極化和功能。
外泌體對M2 型巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)與外泌體組織來源有關。心血管系統(tǒng)中,內(nèi)皮細胞、干細胞與脂肪細胞等為參與疾病發(fā)展的重要細胞類型。本文將根據(jù)外泌體組織來源對其分類,分別討論每種細胞來源的外泌體所含物質(zhì)、對M2 型巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)、相關信號通路及其對心血管疾病的影響。
2.1 內(nèi)皮細胞來源外泌體 血管內(nèi)皮細胞來源外泌體調(diào)節(jié)靶細胞增殖、凋亡及遷移過程,對血管生成、免疫應答具有重要調(diào)控作用。內(nèi)皮細胞釋放的外泌體中miR-155與肺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1(metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT-1)調(diào)控M2 型巨噬細胞極化,在動脈粥樣硬化等多種心血管疾病及缺血再灌注損傷中具有重要意義。
2.1.1 miR-155抑制M2型巨噬細胞極化 miR-155在炎癥刺激、心臟疾病、動脈粥樣硬化等條件下表達增加,抑制M2 型巨噬細胞極化,促進M1 型巨噬細胞極化,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[7]。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中,氧化低密度脂蛋白(oxidation low-density lipopro?tein,ox-LDL)及Krueppel 樣 因 子2(Krueppel-like factor 2,KLF2)是調(diào)節(jié)miR-155 表達的重要分子[8]。ox-LDL 通過上調(diào)核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路活性促進miR-155表達,使外泌體中miR-155 含量增加;KLF2 通過競爭cAMP 反應元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein,CBP)/p300 抑 制NF-κB 信 號 通 路,使 外 泌 體 中miR-155 含量減少,且KLF2 介導的miR-155 表達調(diào)控、M2型巨噬細胞極化調(diào)控與動脈粥樣硬化斑塊形成相關[8]。
2.1.2 MALAT1促進M2型巨噬細胞極化 HUVEC來源外泌體MALAT1 促進M2 型巨噬細胞極化,可能與MALAT1 誘導的巨噬細胞內(nèi)吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase1,IDO)表達增加有關[9]。MALAT1 促進血管內(nèi)皮細胞增殖,參與血管內(nèi)皮損傷修復,而血管內(nèi)皮損傷被認為是早期動脈粥樣硬化與糖尿病微血管病變發(fā)生過程中的關鍵步驟。同時MALAT1 在心肌細胞凋亡、炎癥反應、纖維修復及心臟重構(gòu)等過程中具有重要意義,與心肌梗死引發(fā)的心肌損傷、纖維化及糖尿病性心肌病心肌重構(gòu)密切相關[10]。
2.2 間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exo)促進M2 型巨噬細胞極化 干細胞促進心肌細胞修復再生、改善其收縮功能,在冠狀動脈疾病、心肌梗死、心肌衰竭等心血管疾病的治療中具有良好應用前景[11]。MSC具有多向分化、造血支持、免疫調(diào)控等特點,在心血管疾病治療中報道較多[12]。MSC 及MSC-Exo 能夠使M1 型巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化,促進心臟組織修復,發(fā)揮心臟保護作用[13]。
骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesen?chymal stem cells,BMSCs)、人臍帶間充質(zhì)干細胞、脂肪源性間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)等多種MSC及其來源外泌體在心血管疾病中具有重要意義。其中,BMSCs 應用最為廣泛,其來源的外泌體通過IL-6 等促進M2 型巨噬細胞極化,影響T細胞免疫應答過程,進而發(fā)揮心肌保護效應[11]。
MSC-Exo 中包括miR-let7、miR-182、miR-146a、miR-223 等,目前研究較多的是miR-223。miR-223在人外周血單核細胞及BMSCs 中均呈高表達,并被包裝進入外泌體,是介導過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)在巨噬細胞內(nèi)作用的重要分子;PPARγ 與miR-223 基因啟動子上的PPARγ 調(diào)控元件結(jié)合,上調(diào)miR-223 表達[14-16]。研究指出,miR-223 存在于MSC-Exo,抑制Pknox1基因表達而促進M2型巨噬細胞極化[14]。同時,YING 等[16]發(fā)現(xiàn)Pknox1 是miR-223的一個靶基因,但Pknox1 表達上調(diào)與下調(diào)僅影響M1型巨噬細胞活性,對M2型巨噬細胞影響有限,隨后,其找到了miR-223 新的靶基因,即Ras GTP 酶激活蛋白1(Ras GTPase activating protein 1,Rasa1)與活化T 細胞核因子5(nuclear factor of activated Tcells 5,Nfat5),并最終證實miR-223 通過下調(diào)Rasa1與Nfat5 表達實現(xiàn)對M2 型巨噬細胞的調(diào)節(jié)。此外,miR-let7 可促進巨噬細胞遷移與M2 巨噬細胞極化,改善動脈粥樣硬化,參與M2 型巨噬細胞相關組織修復過程[17-18];miR-182促進心肌缺血再灌注早期心肌內(nèi)M1 型巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化[19];miR-146a 在動脈粥樣硬化的血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、斑塊中的單核巨噬細胞內(nèi)均有表達,具有抗炎作用[20]。高水平的miR-146a可緩解動脈粥樣硬化[21]。
ADSCs 來源外泌體作用于STAT6 及V-MAF 肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B(V-maf musculoapo?neurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MafB),從而促進M2 型巨噬細胞極化[22]。其中,STAT6 促進M2 型巨噬細胞極化,抑制炎癥,穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊;MafB 作用于編碼補體C1q、黑色素瘤缺乏因子(absent in melanoma,AIM)、巨噬細胞清道夫受體1(macrophage scavenger receptor type Ⅰ,MSR1)、嘌呤受體P2X 配體門控離子通道4(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 4,P2RX4)等多種蛋白的基因,在自身免疫病、動脈粥樣硬化等疾病中發(fā)揮調(diào)控作用。
2.3 脂肪細胞來源外泌體 脂肪細胞可釋放外泌體miRNA,調(diào)節(jié)外周其他組織基因表達,同時也是循環(huán)血中miRNA 的主要來源。脂肪細胞誘導骨髓前體細胞向脂肪組織巨噬細胞分化,同時調(diào)節(jié)巨噬細胞功能[23-24]。脂肪細胞外泌體中miR-34a 通過抑制KLF4、肝X 受體α(liver X receptor alpha,LXRα)表達而抑制M2型巨噬細胞極化[25-26]。此外,miR-34a作用于組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1),調(diào)控組蛋白H3第9位賴氨酸殘基(H3K9)乙酰化,與泡沫細胞中脂質(zhì)積累相關;抑制miR-34a將促進巨噬細胞膽固醇流出,有利于動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定[27-28]。
來源于外泌體的上述不同種類miRNA、轉(zhuǎn)錄因子及其他非編碼RNA 通過不同信號通路調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞極化,相關信號通路包括Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB 信號通路、磷脂酰 肌 醇-3- 激 酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serinethreonine kinase,AKT)信號通路、Notch 信號通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信號通路、TGF-β信號通路和鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1 phosphate,S1P)信號通路等,總結(jié)如下。
3.1 TLR4/NF-κB 信號通路 NF-κB 在炎癥反應中發(fā)揮核心調(diào)控作用。非激活狀態(tài)下,NF-κB 活性受IκB 抑制;而受到TLR 及TNF 受體等細胞因子受體刺激后,IκB 激酶激活將使IκB 磷酸化,進而使蛋白酶體降解并釋放NF-κB 向核內(nèi)轉(zhuǎn)運,激活相應基因轉(zhuǎn)錄[29]。MSC-Exo 使IκBα 表達增加、p-IκBα 表達減少,下調(diào)NF-κB信號通路可抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位,促進M2 型巨噬細胞極化,同時促進抑炎細胞因子IL-10釋放,使促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著降低,最終抑制炎癥[13]。這些外泌體內(nèi)物質(zhì)主要包括miR-146a、miR-let7、miR-182、miR-223等,分述如下。
MSC-Exo 中的miR-146a 抑制巨噬細胞內(nèi)白細胞介素-1受體相關激酶1(IL-1 receptor associated ki?nase,IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關蛋白6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)及干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory 5,IRF5)表達,抑制NF-κB通路活性,促進M2 型巨噬細胞極化,從而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成、減輕心臟缺血再灌注損傷等[20]。miR-146a 與IRAK-1、TRAF6、磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-acti?vated protein kinase,p-p38 MAPK)等相互作用,抑制p38 MAPK介導的RNA結(jié)合基序蛋白4(RNA-binding motif protein 4,RBM4)Ser309 磷酸化與RBM4 在細胞核內(nèi)重新定位并發(fā)揮功能,從而減少TNF-α、IL-6等促炎細胞因子合成,抑制過度炎癥發(fā)生。其中,RBM4 磷酸化能夠抵消TLR4 導致的促炎細胞因子翻譯抑制。miR-146a 也通過誘導MAPK 磷酸酶表達下調(diào)MAPK 通路活性,同時使IRAK1 與TRAF6 表達減少,從而抑制NF-κB活化[30]。
miR-let7 作用于高遷移率族AT-hook 蛋白2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)基因,抑制NF-κB 信號通路,促進M2 巨噬細胞極化[17]。同時,miR-let7 調(diào) 控miR-let7/HMGA2/NF-κB 通 路 而 促 進M2 巨噬細胞極化而使ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化得以改善。此外,miR-let7 調(diào)控miR-let7/胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1,IGF2BP1)/磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)通路而抑制動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞浸潤[17]。miR-182 下調(diào)TLR4/髓樣分化因子(myeloid dif?ferentiation factor 88,MyD88)/NF-κB 通路使巨噬細胞內(nèi)iNOS、TLR4、MyD88 和NF-κB p-P65 表達顯著下降,從而抑制巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化[19]。miR-223 抑制NF-κB p65 磷酸化,從而抑制巨噬細胞NF-κB 通路。miR-223 減少將上調(diào)Ras 同源基因家族、Rho 相關GTP 結(jié) 合 蛋 白(Rho-related GTP-binding protein,Rho B)基因表達,誘導NF-κB 及MAPK 信號通路活化,使LPS 誘導下巨噬細胞中TNF-α、IL-6 及IL-1β合成增加[25]。
3.2 PI3K/Akt 信號通路 PI3K/Akt 信號通路是巨噬細胞功能調(diào)節(jié)的中心,與TGF-β、IL-10 等多種細胞因子對M2 型巨噬細胞調(diào)節(jié)相關。PI3K/Akt 信號通路可由TLR4 激活,同時作為TLR 與NF-κB 信號通路抑制物,促進M2 型巨噬細胞極化。結(jié)節(jié)性硬化復合體(tuberous sclerosis complex,TSC)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of ra?pamycin complex-1,mTORC1)通路位于PI3K/Akt通路下游,但其對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)方向尚無定論[31]。MSC外泌體miR-182可上調(diào)p-PI3K與p-AKT表達,其可能機制為miR-182抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,從而反饋性激活PI3K/Akt 通路,促進M2 型巨噬細胞極化[19]。MSC-Exo 也可使M2 型巨噬細胞中AKT1 基因及M1 型巨噬細胞中AKT2 基因表達增加,使M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化[13]。此外,miR-let7作用于IGF2BP1 基因,通過miR-let7/IGF2BP1/PTEN調(diào)節(jié)軸抑制動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞浸潤;其中PTEN 將3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為4,5-二磷酸磷脂酰肌醇,拮抗PI3K作用[31]。
3.3 Notch 信號通路 Notch 活化可通過其下游的發(fā)狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)抑制信號調(diào)節(jié)蛋白(signal regulatory protein α,SIRPα)表達,從而抑制M2 型巨噬細胞極化[32]。Notch1 抑制可完全抵消LPS 誘導的IL-1β、IL-6 和趨化因子(C-C 基序)配體2[chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL-2]表達增加及NF-κB 通路激活[33]。MSC-Exo 通過miR-146a 抑制Notch1 信號途徑,或通過miR-146a 抑制Notch 信號通路的下游基因Hes1部分抑制Notch1,促進M2型巨噬細胞極化[34-35]。
3.4 JAK/STAT 信號通路 STAT6是巨噬細胞重要的轉(zhuǎn)錄因子。ADSC 來源外泌體作用于STAT6,磷酸化STAT6 活化Wnt-catenin 信號通路,促進M2 型巨噬細胞極化[22,36]。STAT6也可與三重基序蛋白24(tripartite motif-containing 24,Trim24)、環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)結(jié) 合 蛋 白(CREB-binding protein,CBP)形成復合物,再由CBP 催化STAT6 的Lys383乙?;瑥亩种芃2型巨噬細胞極化[37]。
脂肪細胞外泌體miR-34a 促進脂肪組織巨噬細胞胞質(zhì)中的STAT3 向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,進而促進iNOS 合成,抑制M2 型巨噬細胞極化,促進脂肪組織炎癥反應[25]。另外,STAT3 可直接通過外泌體運輸進入靶細胞。脂肪源性干細胞來源外泌體通過轉(zhuǎn)運磷酸化信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3,p-STAT3)上調(diào)精氨酸酶1(arginase 1,Arg-1)表達,促進M2 型巨噬細胞極化,進而緩解由LPS 與IFN-γ 引發(fā)的炎癥反應[38]。
3.5 TGF-β 信號通路 TGF-β 在細胞與組織生長、發(fā)育及分化中起關鍵作用。TGF-β上調(diào)抑炎細胞因子IL-10、下調(diào)促炎細胞因子TNF-α 及IL-12表達,促進M2 型巨噬細胞極化。這個過程由TGF-β 誘導的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子SNAIL 過表達實現(xiàn),而TGF-β 誘導SNAIL 過表達又需要SMAD2/3 及PI3K/Akt 信號通路參與[39]。
ADSC 來源外泌體促進M2 型巨噬細胞極化,同時抑制TGF-β1 表達,抑制TGF-β/Smad 信號通路介導的Ⅰ型、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin,α-SMA)參與的心肌纖維化,發(fā)揮心肌保護作用[40]。
3.6 S1P 信號通路 鞘氨醇激酶1 和2(sphingosine Kinase1/2,SphK1/2)可催化鞘氨醇磷酸化,產(chǎn)生S1P;SphK/S1P 在血管內(nèi)皮細胞功能調(diào)節(jié)、血管新生等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。S1P 通過多種機制誘導M2 型巨噬細胞極化,包括磷酸化STAT6,從而誘導細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)表達增加、SOCS3 表達減少,以及通過活化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracel?lular regulated protein kinases,ERK)、抑制p38 MAPK與c-Jun 氨 基 末 端 激 酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)使IL-4 分泌增加。體內(nèi)實驗中,經(jīng)S1P 處理的M2 型巨噬細胞在ox-LDL 誘導下的脂質(zhì)積累被顯著抑制[41]。血清中S1P 與高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)結(jié)合,在HDL中含量為所有脂蛋白中最高。PARK 等[41]認為,S1P 誘導的M2 型巨噬細胞極化與HDL抗動脈粥樣硬化作用密切相關。ADSC來源外泌體可促進M2 型巨噬細胞極化,抵抗心肌梗死引發(fā)的炎癥反應及心肌纖維化。下調(diào)S1PR1表達使NF-κB 與TGF-β 表達增加,抵消上述作用。有實驗表明S1pr1 沉默將促進M1 型巨噬細胞極化,且與NF-κB表達增加有關[42]。
近年我國心血管疾病發(fā)生率呈上升趨勢。調(diào)節(jié)心血管疾病的各種組織細胞中,巨噬細胞參與動脈粥樣硬化、心肌梗死等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程。M2型巨噬細胞可抑制炎癥反應、促進細胞外基質(zhì)降解,在心血管疾病中為組織修復、血管重塑等創(chuàng)造有利條件。M2 型巨噬細胞已成為心血管疾病新藥物的靶點,如人參皂苷Rb1、他汀類藥物、谷氨酰胺和2-脫氧葡萄糖等多種藥物均可通過促進M2型巨噬細胞極化治療動脈粥樣硬化[43-45]。
M2 型巨噬細胞極化及其生理功能可由外泌體調(diào)控。外泌體內(nèi)容物多樣性使其具有多重生物學功能,可通過多種信號通路調(diào)控M2 型巨噬細胞極化、巨噬細胞代謝與功能,這樣的多向靶點調(diào)節(jié)優(yōu)勢使外泌體能夠?qū)κ荏w細胞產(chǎn)生整體調(diào)節(jié)效應,進而調(diào)節(jié)心血管疾病炎癥反應及組織修復等。相關研究通過檢測心血管疾病患者與健康人群體內(nèi)外泌體內(nèi)容物表達差異,探尋潛在生物標志物,從而為心血管疾病診療提供更精準的靶標提供了思路,在心血管疾病治療中具有良好應用前景[46]。此外,外泌體的相對穩(wěn)定性與天然物質(zhì)轉(zhuǎn)運特性使外泌體作為新型藥物載體、發(fā)揮靶向給藥作用成為可能。
外泌體成分多樣性及其作用特異性是外泌體在心血管疾病應用中的優(yōu)勢,同時也增加了相關研究的復雜性,對分子機制研究的精確性、全面性及外泌體純化及鑒定技術均提出了更高要求,需要對現(xiàn)有分離富集、鑒定分析技術具有更加充分的了解,尋找更加精確的分析技術及手段。