李玉立,邵天舒,趙璇,李瀟,何歡,梅婕,李文東（北京市藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）最早由瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的Engvall和Perlmann于1971年建立[1]。Engvall等4位研究者基于一種非放射性標(biāo)記的免疫分析技術(shù)，建立了酶聯(lián)免疫分析方法[2]。他們將抗原或抗體與酶偶聯(lián)，通過免疫熒光檢測(cè)，于1970年獲得第一個(gè)ELISA校準(zhǔn)曲線[3]。早期的ELISA由于特異性不高而妨礙了其在實(shí)際中應(yīng)用的步伐，隨著單克隆抗體技術(shù)發(fā)展，用于測(cè)量抗原的“夾心”ELISA試驗(yàn)被開發(fā)出來，該方法快速、簡(jiǎn)單且具有很好的靈敏度[4]。加之多功能酶標(biāo)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，如今ELISA方法已涉及多種細(xì)菌和病毒的檢測(cè)，被用于疾病的診斷（如HIV檢測(cè)[5]）、動(dòng)物檢疫、疫苗效力檢測(cè)等方面，成為應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法之一。

隨著自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，全自動(dòng)酶免工作站開始被熟知和使用，我國(guó)引入自動(dòng)化酶免工作站的歷史可以追溯到上世紀(jì)90年代末期[6]。本文所使用工作站為瑞士帝肯（Tecan）制造，該公司全自動(dòng)酶免工作站自20世紀(jì)初被引入[7-9]，至今用途廣泛，涉及獸醫(yī)衛(wèi)生領(lǐng)域[10]、臨床疾病篩查[11]、血液樣本分析[12]等。該工作站目前在國(guó)內(nèi)用戶較多，在多領(lǐng)域進(jìn)行廣泛使用[13-15]，它可以根據(jù)用戶的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行配置，同時(shí)滿足高通量和靈活性的要求。

本文所采用“雙抗體夾心法”是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的一種，是指將能夠與抗原特異性結(jié)合的抗體與固相載體結(jié)合后，再與抗原反應(yīng)，然后與辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記物結(jié)合，形成夾心。最后加入TMB底物顯色，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)抗原呈正相關(guān)。雙抗體夾心法測(cè)定抗原含量，特別是當(dāng)抗原含量較低需要二次放大信號(hào)的情況下，操作步驟多、過程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。本文中所測(cè)定的抗原樣本就是此類情況。一般情況下，技術(shù)熟練的實(shí)驗(yàn)員每天可完成1-2塊酶標(biāo)板，即10-20批次的實(shí)驗(yàn)任務(wù)，耗時(shí)較長(zhǎng)，效率較低。本文以全自動(dòng)酶免工作站為依托設(shè)計(jì)了全自動(dòng)化的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了除解吸附步驟以外的實(shí)驗(yàn)全過程的自動(dòng)化操作。在此基礎(chǔ)上，通過人機(jī)比對(duì)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了全自動(dòng)方法的可行性，并考察了諸多影響因素，最終建立了一種準(zhǔn)確、高效，精密度良好的全自動(dòng)檢測(cè)方法以替代手工操作，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率，避免了手工操作的人員差異，更好地實(shí)現(xiàn)了雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)化操作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原樣本：滅活疫苗。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及主要試劑 全滅活疫苗抗原含量檢測(cè)試劑盒（ELISA）（疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供），具體包括96孔酶聯(lián)反應(yīng)板、檢測(cè)抗體工作液、酶標(biāo)抗體工作液、20倍洗滌液、顯色液A、顯色液B、終止液、解吸附劑、參考品。

1.1.3 儀器設(shè)備 Freedom EVO-2 150全自動(dòng)酶免工作站（包括操作平臺(tái)，Hydrospeed洗板機(jī)和Sunrise酶標(biāo)儀）（瑞士Tecan公司）；50TS8洗板機(jī)（美國(guó)BioTek公司）；Varioskan? LUX酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司）。

1.1.4 Freedom EVO-2 150全自動(dòng)酶免工作站主要參數(shù)和布局圖主機(jī)平臺(tái)詳見圖1。

圖1 Freedom EVO-2 150全自動(dòng)酶免工作站臺(tái)面布局圖。注：工作站臺(tái)面包括3×3個(gè)槍頭位；4個(gè)儲(chǔ)板位；2×6個(gè)孵育位；6個(gè)試劑位；3個(gè)加樣板位；洗板模塊；讀數(shù)模塊；2組微孔板堆棧

1.2 方法

1.2.1 試劑和樣本準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)開始前，所有滅活疫苗樣本恢復(fù)至室溫，取樣前輕柔震蕩予以混勻。準(zhǔn)備好試劑盒，取出參考品恢復(fù)至室溫，并將濃縮洗板液用純水進(jìn)行20倍稀釋，配置成工作濃度的洗板液。

1.2.2 待測(cè)樣本的解吸附及稀釋 取參考品和抗原樣品各400μl，分別與400μl生理鹽水混合，加入800μl的解吸附劑混勻，放置在室溫25℃條件下反應(yīng)1小時(shí)，其間每隔20分鐘輕柔震蕩混勻。

將解吸附后的參考品及樣品用生理鹽水再進(jìn)行1倍、2倍、4倍、8倍稀釋。稀釋步驟分別由全自動(dòng)酶免工作站完成和實(shí)驗(yàn)員手工操作完成。

1.2.3 雙抗體夾心法手工操作規(guī)程 將稀釋后的4個(gè)濃度梯度的參考品與樣品分別加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，平行2孔，陰性對(duì)照（生理鹽水）平行8孔，輕柔震蕩混勻后，將酶標(biāo)板用封板膜封好后放入潔凈密封袋中，置于37℃恒溫水浴箱中孵育120分鐘。

在中職教育以及旅游業(yè)快速發(fā)展的過程中，中職旅游專業(yè)教育也進(jìn)一步擴(kuò)張。當(dāng)前，中職旅游管理專業(yè)已經(jīng)慢慢發(fā)展成為較為成熟的發(fā)展體系，不過在教學(xué)過程中并沒有徹底擺脫傳統(tǒng)的灌輸式教學(xué)模式，這樣就導(dǎo)致培養(yǎng)的人才不能滿足社會(huì)發(fā)展需要。因此，旅游業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的問題是各院校如何培養(yǎng)適應(yīng)社會(huì)需要的旅游管理專業(yè)人才。通過實(shí)踐調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)當(dāng)前在旅游管理專業(yè)人才培養(yǎng)以及教育改革方面的研究比較少，特別是在“互聯(lián)網(wǎng)+”時(shí)代，更應(yīng)該加強(qiáng)此方面的探索。

取出酶標(biāo)板，用洗板機(jī)清洗5次后拍干。用多道移液器將檢測(cè)抗體工作液加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘。再次取出酶標(biāo)板，清洗5次后拍干，加入酶標(biāo)抗體工作液，每孔100μl，37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘。取出酶標(biāo)板，清洗5次后拍干，加入顯色A液，每孔50μl，再加入顯色B液，每孔50μl，輕柔震蕩混勻后，37℃恒溫水浴箱中孵育15分鐘。

取出酶標(biāo)板，用多道移液器將終止液加入酶標(biāo)板中，每孔50μl。酶標(biāo)儀于450/630nm雙波長(zhǎng)下讀數(shù)，測(cè)定每孔OD值。

1.2.4 雙抗體夾心法全自動(dòng)酶免工作站操作規(guī)程 全自動(dòng)酶免工作站操作規(guī)程的建立首先是對(duì)工作站主機(jī)平臺(tái)布局的設(shè)計(jì)，在有限的空間內(nèi)，需要實(shí)現(xiàn)多個(gè)步驟多種試劑多份耗材及多塊酶標(biāo)板的協(xié)同處理。該過程需要考慮諸多因素，如機(jī)械臂和加樣通道的資源利用率，槍頭位點(diǎn)的利用率及廢棄槍頭的處理等，因此，經(jīng)過2個(gè)多月的數(shù)輪調(diào)試及硬件升級(jí)，最終實(shí)現(xiàn)了硬件完備，布局完善，流程設(shè)計(jì)高效。

首先，按照試劑盒操作規(guī)程結(jié)合工作站硬件結(jié)構(gòu)進(jìn)行編程，具體涉及步驟包括：四級(jí)稀釋、孵育、洗板、加液、讀數(shù)。各步驟之間的移板操作主要由機(jī)械臂（ROMA）完成，加液由96通道機(jī)械臂完成。其中四級(jí)稀釋的編程較為復(fù)雜，除考慮兩組樣品的平行外，還需在盡量短的時(shí)間內(nèi)完成稀釋及上樣操作。針對(duì)于多板測(cè)試的情況下，各板“四級(jí)稀釋”需依次順序進(jìn)行，所以還需考慮期間的延時(shí)等待及后續(xù)步驟之間資源占用沖突等問題，最后，經(jīng)過數(shù)十次的調(diào)試及測(cè)試，實(shí)現(xiàn)了六塊酶標(biāo)板（60批樣品）同時(shí)進(jìn)行“雙抗體夾心法”測(cè)定體外效力。具體實(shí)驗(yàn)步驟流程詳見圖2。

圖2 A：?jiǎn)伟鍖?shí)驗(yàn)進(jìn)程圖（色帶說明詳見備注），B：六板實(shí)驗(yàn)進(jìn)程圖（色帶說明詳見備注）

全自動(dòng)操作實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)員按照提示運(yùn)行相應(yīng)程序直至檢測(cè)完成即可。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Statistic Analysis統(tǒng)計(jì)軟件分析參考品與樣品結(jié)果，選擇連續(xù)3-4個(gè)稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，OD值平均值的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性分析。計(jì)算樣品體外相對(duì)效力。

2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和結(jié)果

2.1.1“雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”人機(jī)比對(duì)單板實(shí)驗(yàn) 按照上述方法，實(shí)驗(yàn)員和TECAN全自動(dòng)酶免工作站分別對(duì)相同批號(hào)的5批次疫苗樣本進(jìn)行“雙抗體夾心法”測(cè)定體外相對(duì)效力實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)方式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析，以確認(rèn)TECAN全自動(dòng)酶免工作站可替代手工操作進(jìn)行“雙抗體夾心法”的體外相對(duì)效力實(shí)驗(yàn)并給出可信結(jié)果，兩份實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)偏差應(yīng)不大于15%[16]。

2.1.2 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”人機(jī)比對(duì)多板實(shí)驗(yàn) 同時(shí)測(cè)試多塊酶標(biāo)板的情況下，全自動(dòng)酶免工作站需依次按順序?qū)γ恳粔K酶標(biāo)板進(jìn)行稀釋，這一過程會(huì)導(dǎo)致最后一塊酶標(biāo)板的解吸附時(shí)間較第一塊酶標(biāo)板有所延長(zhǎng)，為排除這段時(shí)間差可能導(dǎo)致的結(jié)果誤差，設(shè)計(jì)了多板實(shí)驗(yàn)的比對(duì)。在全自動(dòng)酶免工作站同時(shí)進(jìn)行六塊酶標(biāo)板實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)員手工進(jìn)行第六塊酶標(biāo)板的平行實(shí)驗(yàn)，比對(duì)結(jié)果偏差。

2.1.3 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”避光情況考察顯色液AB液為辣根過氧化物酶HRP的反應(yīng)底物，暴露在光源下會(huì)發(fā)生變色，手工操作時(shí)需避光實(shí)驗(yàn)，即時(shí)加樣；如進(jìn)行全自動(dòng)操作程序設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)即時(shí)加樣需要中斷程序，手工操作。為了全面實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，考察了提前放置顯色液AB情況下光照導(dǎo)致的變色是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。分別設(shè)計(jì)“即時(shí)加樣”和“提前放置”兩種加顯色液的方式，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否存在偏差。

2.1.4 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”回收試劑考察酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)中使用的試劑一般有關(guān)鍵試劑和非關(guān)鍵試劑[16]，本試驗(yàn)中所考察的回收試劑屬于關(guān)鍵試劑，包括抗體溶液、顯色液等，其成分或穩(wěn)定性有細(xì)小變化即會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)抗體制備困難，供應(yīng)緊張且成本較高，采用全自動(dòng)酶免工作站實(shí)驗(yàn)各類試劑均不可避免地存在檢測(cè)死體積，通過優(yōu)化試劑盒的尺寸，已將死體積從30ml調(diào)整為10ml，為了進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)成本，節(jié)約試劑，考察了回收試劑進(jìn)行二次使用對(duì)結(jié)果的影響。

2.1.5 全自動(dòng)酶免工作站儀器精密度和方法精密度考察 采用全自動(dòng)酶免工作站六板程序?qū)?批樣品進(jìn)行了平行6次測(cè)定，分別對(duì)6次測(cè)定檢測(cè)結(jié)果的原倍濃度的OD值和檢測(cè)所得體外相對(duì)效力進(jìn)行了比對(duì)，以確認(rèn)工作站的操作精密度和方法精密度。

2.2 結(jié)果

2.2.1 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”人機(jī)比對(duì)單板實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表1，從表1可以看出5批樣品的人機(jī)比對(duì)結(jié)果的相對(duì)偏差均小于15%，符合要求。

表1 人機(jī)比對(duì)單板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”人機(jī)比對(duì)多板實(shí)驗(yàn)詳見表2，從表2可以看出5批樣品設(shè)置到全自動(dòng)酶免工作站第六塊板進(jìn)行檢測(cè)與手工操作檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差均小于15%，符合要求。

表2 人機(jī)比對(duì)多板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”避光情況考察結(jié)果詳見表3，從表3可以看出，5批樣品在顯色液A和顯色液B的即時(shí)加樣和提前放置的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差均小于15%，符合要求，表明采用全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行60批樣品檢測(cè)時(shí)，可以提前放置顯色液，不需中斷程序，進(jìn)行即時(shí)加樣，更好地實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化操作。

表3 A/B液變色影響考察結(jié)果

2.2.4 “雙抗體夾心法測(cè)定樣品體外相對(duì)效力”回收試劑考察結(jié)果詳見表4，從表4可以看出5批樣品采用新鮮試劑和回收試劑的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差均小15%，符合要求，表明使用回收試劑進(jìn)行樣品檢測(cè)對(duì)結(jié)果的影響符合規(guī)定。采用回收試劑進(jìn)行檢驗(yàn)可以降低檢驗(yàn)成本，節(jié)約檢驗(yàn)資源，對(duì)于后續(xù)大批量檢驗(yàn)具有重要意義。同時(shí)對(duì)回收試劑的存放期限進(jìn)行了進(jìn)一步的考察，結(jié)果表明首次試劑回收后于4℃冰箱保存1周，進(jìn)行第二次實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本無影響。后續(xù)筆者又進(jìn)行了試劑第二次回收的考察，數(shù)據(jù)顯示1個(gè)月內(nèi)，多次重復(fù)回收的試劑均可正常使用。

表4 回收試劑考察結(jié)果

2.2.5 全自動(dòng)酶免工作站儀器精密度和方法精密度考察結(jié)果詳見表5和表6，從表5可以看出，9批樣品采用六板程序平行檢測(cè)6次的原倍濃度的檢測(cè)OD值的變異系數(shù)符合《中國(guó)藥典》2020年版四部《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[16]中批內(nèi)變異系數(shù)不超過15%的要求，該結(jié)果表明全自動(dòng)酶免工作站在樣品的稀釋操作，加樣操作，洗板操作及酶標(biāo)儀檢測(cè)的精密度均符合要求。

表5 儀器操作精密度考察結(jié)果

表6 自動(dòng)化方法精密度考察結(jié)果

表6為9批樣品平行檢測(cè)6次的體外相對(duì)效力結(jié)果，該結(jié)果的變異系數(shù)也符合以上指導(dǎo)原則的要求，該結(jié)果表明采用全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行體外相對(duì)效力檢測(cè)的方法精密度符合規(guī)定，可以很好地替代手工操作，減少人工操作的偏差。

3 討論

3.1 雙抗體夾心法為半定量的檢測(cè)方法，操作步驟多，不同人員操作對(duì)結(jié)果影響因素較大，通過采用多類型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用全自動(dòng)酶免工作站和手工操作檢測(cè)結(jié)果偏差符合要求，結(jié)果平行性良好，可替代手工操作。

3.2 六板結(jié)果比對(duì)表明，第六塊酶標(biāo)板的四級(jí)稀釋較第一塊有50分鐘左右的延遲，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果基本無影響。

3.3 回收試劑考察結(jié)果表明，提前放置顯色液A/B變色后，不影響效力檢測(cè)結(jié)果。后續(xù)按照提前放置顯色液A/B的方法進(jìn)行了近百批樣品的檢測(cè)，結(jié)果均正常。

3.4 精密度考察結(jié)果表明采用全自動(dòng)酶免工作站在大批量樣品檢測(cè)中具有平行性良好、結(jié)果準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)。

3.5 為了后續(xù)擴(kuò)展將解吸附操作實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，本文對(duì)室溫下疫苗的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步考察，結(jié)果表明在室溫24小時(shí)內(nèi)，疫苗的體外相對(duì)效力結(jié)果穩(wěn)定，為后續(xù)大批量樣品的解吸附自動(dòng)化操作提供了數(shù)據(jù)支撐。

當(dāng)前新冠疫情仍在全球肆虐，變異毒株的不斷出現(xiàn)更加大了防疫防控的難度，疫苗作為有效遏制疫情蔓延的最有利的武器，國(guó)內(nèi)及國(guó)際的需求量急劇增加。為了全力配合疫情防控的要求，國(guó)內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)均進(jìn)行了全面的擴(kuò)產(chǎn)，必然導(dǎo)致原液、半成品和成品的效力檢驗(yàn)任務(wù)的大幅度增加，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)和批簽發(fā)機(jī)構(gòu)均提出了巨大的挑戰(zhàn)。酶聯(lián)免疫法作為當(dāng)前測(cè)定疫苗效力指標(biāo)的主要方法，開發(fā)全自動(dòng)酶免工作站替代手工操作具有重要的意義，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化操作，減少了人工操作的偏差，對(duì)于提升檢驗(yàn)效率、保障疫苗供應(yīng)具有積極的作用，希望以上研究?jī)?nèi)容為開發(fā)全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行多種疫苗的效力檢測(cè)提供有效的借鑒作用。