江一峰,周雪雪,2,黃盈盈,張華峰,2*,王紅霞
(1 中俄食品與健康科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心 陜西省漢陰縣富有機(jī)硒食品科技創(chuàng)新試驗(yàn)示范站陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 西安 710119 2 西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 西安 710119)
糖尿病是威脅人體健康的重要慢性疾病,也是引起死亡的十大病因之一[1-3]。全球糖尿病患者接近4 億,而我國(guó)約為1 億,且呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)[4-5]。糖尿病以糖代謝紊亂為主要特征,常伴隨氧化應(yīng)激和脂代謝紊亂,并可能產(chǎn)生肝臟、腎臟等臟器損傷或并發(fā)癥[6]。臨床上常用的二甲雙胍、胰島素(INS)、格列美脲等藥物雖然具有明顯的降血糖效果,但是長(zhǎng)期使用可能對(duì)患者產(chǎn)生副作用[7-8]。從藥食同源植物中獲取天然、高效、安全的降糖因子成為糖尿病相關(guān)研究的新方向[1]。
菊花是我國(guó)著名的藥食同源植物,具有降血糖、抗氧化、降血壓、抗癌、抑菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用[9-12],在飲料、藥膳、休閑食品加工中具有廣泛用途[9]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),菊花中含有較豐富的香葉木素(diosmetin)、異綠原酸C(isochlorogenic acid C)、木犀草苷(cynaroside)和蒙花苷(buddleo side)[13]。異綠原酸C 具有清除自由基、抗炎等功效[14-15];木犀草苷具有抗菌、保護(hù)神經(jīng)等功效[16-17];蒙花苷具有抗氧化、抗炎等功效[18-19];香葉木素具有抗氧化、抗癌和保護(hù)視網(wǎng)膜等功效[20-22]。目前鮮見(jiàn)關(guān)于這4 種酚類(lèi)化合物單體降血糖作用的研究報(bào)道。為了揭示菊花降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ),了解香葉木素的降血糖活性,本研究通過(guò)體外試驗(yàn)篩選活性較高的單體,在此基礎(chǔ)上利用高糖、高脂飼料結(jié)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠模型,探究其降血糖作用以及對(duì)脂代謝、氧化應(yīng)激等的效應(yīng)。
4~6 周齡雄性昆明小鼠[SCXK(陜)2012-001,SPF 級(jí)],西安交通大學(xué);普通飼料,西安晶博公司;高糖、高脂飼料(65%小鼠維持飼料、20%蔗糖、10%豬脂肪、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉、1%礦物質(zhì)混合物、0.5%維生素混合物),北京博愛(ài)港公司;異綠原酸C(HPLC 級(jí),純度≥98%)、木犀草苷(HPLC級(jí),純度≥98%)、香葉木素(HPLC 級(jí),純度≥98%)、蒙花苷(HPLC 級(jí)、純度≥98%)、阿卡波糖(Acarbose,HPLC 級(jí),純度≥98%)、α-淀粉酶(4 000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(10 U/mg)、α-D-葡萄糖苷(PNPG),上海源葉公司;INS、糖原、糖化血清蛋白(GSP)、總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)試劑盒或ELISA 試劑,南京建成生物工程研究所;STZ,美國(guó)Sigma 公司;格列美脲,天安公司;二甲雙胍,中美上海施貴寶公司。
2.1 分子對(duì)接分析
參照周雪雪[1]的方法,選用異綠原酸C、木犀草苷、香葉木素、蒙花苷4 種酚類(lèi)化合物單體,以阿卡波糖為對(duì)照,進(jìn)行α-葡萄糖苷酶蛋白分子對(duì)接分析。
2.2 α-淀粉酶抑制作用分析
參照聶坤倫等[23]的方法分析4 種酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-淀粉酶的抑制作用,以阿卡波糖為對(duì)照。用Multiskan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron 公司)測(cè)定吸光值。計(jì)算各單體對(duì)α-淀粉酶的抑制率以及25%抑制質(zhì)量濃度(IC25)和半抑制質(zhì)量濃度(IC50)。
2.3 α-葡萄糖苷酶抑制作用分析
參照Thi 等[24]的方法分析4 種酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,以阿卡波糖為對(duì)照。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。計(jì)算各單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率以及25%抑制質(zhì)量濃度和半抑制質(zhì)量濃度。
2.4 Ⅱ型糖尿病模型建立與分組處理
取雄性昆明小鼠100 只,用普通飼料喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常類(lèi)群和模型類(lèi)群。模型類(lèi)群飼喂高糖、高脂飼料,正常類(lèi)群仍然飼喂普通飼料[25]。4 周后,所有小鼠禁食(不禁水)12 h,給模型類(lèi)群、正常類(lèi)群小鼠分別注射STZ、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h 后,所有小鼠禁食(不禁水)12 h,測(cè)定空腹血糖(FBG),結(jié)合糖尿病高飲水量等典型癥狀將FBG≥11.1 mmol/L 的小鼠認(rèn)定為造模成功[26]。對(duì)未成模小鼠,繼續(xù)補(bǔ)充注射STZ。按照表1對(duì)小鼠進(jìn)行分組處理。
表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Table 1 Group of experimental animals
2.5.1 小鼠攝食量、飲水量、體重和FBG 測(cè)定干預(yù)(灌胃)試驗(yàn)期間,除正常組(N 組)外,其余各組進(jìn)行高糖、高脂飼喂。連續(xù)干預(yù)30 d,期間每天觀察小鼠的飲水量、攝食量、體征變化、精神狀態(tài)、墊料潮濕程度(排尿量變化)等,每隔6 d 測(cè)量1次體重和FBG,用平均值繪圖。
2.5.2 葡萄糖耐受量(OGTT)測(cè)定 參考Liu 等[27]的方法測(cè)定小鼠的OGTT。小鼠禁食(不禁水)12 h后,測(cè)定各組小鼠的FBG(0 h)。N 組、模型組(M組)給予生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組1(P1 組)、陽(yáng)性對(duì)照組2(P2 組)分別給予二甲雙胍、格列美脲,高劑量干預(yù)組(D50 組)、中劑量干預(yù)組(D30 組)和低劑量干預(yù)組(D15 組)分別給予高、中、低劑量的香葉木素。各組小鼠給予葡萄糖后測(cè)定0.5,2 h 的血糖值,求得曲線(xiàn)下面積(AUC)。
2.5.3 樣本收集與臟器指數(shù)測(cè)定 干預(yù)試驗(yàn)結(jié)束后,參照周雪雪[1]和Yuan 等[26]的方法進(jìn)行樣本收集和臟器指數(shù)測(cè)定。
2.5.4 GSP 含量測(cè)定 取-20 ℃凍存的血清樣本,化凍,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSP 含量。
2.5.5 INS 含量測(cè)定 取-20 ℃凍存的血清樣本,化凍,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定INS 含量,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)[28]。
2.5.6 脂代謝指標(biāo)測(cè)定 取-20 ℃凍存的血清樣本,化凍,測(cè)定小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量[29-30]。
2.5.7 肝臟指標(biāo)測(cè)定
2.5.7.1 肝糖原含量測(cè)定 取-20 ℃凍存的肝臟組織樣本,化凍,測(cè)定肝糖原含量[31]。
2.5.7.2 肝功能相關(guān)酶活力測(cè)定 取-20 ℃凍存的血清樣本,化凍,測(cè)定ALT 和AST 活力[32]。
2.5.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定 取-20 ℃凍存的血清和肝組織樣本,化凍,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清和肝臟中抗氧化酶(SOD、GSH-Px) 活力、TAOC 與MDA 含量[30,33]。
3.1 分子對(duì)接試驗(yàn)
異綠原酸C 能夠與α-葡萄糖苷酶蛋白的氨基酸殘基ASP232、ASP357、GLU603、ASP630 形成分子間氫鍵,與 ASP469、ALA602、GLU603、ASP630 形成疏水作用力,配體與蛋白所形成的復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定(圖1a);木犀草苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、MET470、ASN496、SER505、ARG552 形成分子間氫鍵,與ALA231、ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力,但是與MET470 之間產(chǎn)生了一個(gè)非特異性排斥力(圖1b);香葉木素能夠與酶蛋白的ASP232、ASP469、ARG552、ASP630 形成分子間氫鍵,與TRP329、TRP432、MET470、ASP568、PHE601、ALA602、ALA628 形成疏水作用力,配體與蛋白所形成的復(fù)合物結(jié)合較穩(wěn)定(圖1c),相互作用能量得分較好(表1);蒙花苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、ASP469、MET470、ASN496、ARG552、ASP568、ASP630 形成分子間氫鍵,與ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力(圖1d)。由表2可知,4 種酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-葡萄糖苷酶蛋白均有一定的親和活力,其分子對(duì)接能力依次為:異綠原酸C>香葉木素>木犀草苷>蒙花苷。
表2 酚類(lèi)化合物單體與α-葡萄糖苷酶蛋白的分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of phenolic compounds to α-glucosidase protein
圖1 酚類(lèi)化合物單體與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接模式Fig.1 Molecular docking mode of phenolic compounds to α-glucosidase
3.2 酶學(xué)試驗(yàn)
3.2.1 α-淀粉酶抑制活性 如圖2所示,4 種酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-淀粉酶的抑制率均隨著其濃度的增大而增加。由表3可得,4 種單體濃度與α-淀粉酶抑制率擬合方程的相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9006~0.9605 之間,反映出較好的量效關(guān)系。4 種單體對(duì)α-淀粉酶的抑制能力依次為:木犀草苷>香葉木素>蒙花苷>異綠原酸C。
圖2 酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-淀粉酶的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of phenolic compounds against α-amylase
3.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 如圖3所示,4種酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率均隨著濃度的增大而增加。4 種單體濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率擬合方程的R2在0.9165~0.9626 之間,反映出較好的量效關(guān)系(表3)??梢钥闯觯? 種單體對(duì)α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出抑制活性,但弱于阿卡波糖。不同單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力依次為:香葉木素>木犀草苷>異綠原酸C>蒙花苷。綜合分析4 種單體的分子對(duì)接以及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶試驗(yàn)結(jié)果,選擇香葉木素進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探究其體內(nèi)降血糖作用。
表3 酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性及其量效關(guān)系數(shù)學(xué)模型Table 3 Inhibitory activities of phenolic compounds against α-amylase and α-glucosidase and mathematical model of dose-effect relationship
圖3 酚類(lèi)化合物單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.3 Inhibitory rate of phenolic compounds againist α-glucosidase
3.3 小鼠攝食量、飲水量與體重變化分析
觀測(cè)發(fā)現(xiàn),Ⅱ型糖尿病模型小鼠行動(dòng)遲緩,精神萎靡,墊料易濕且臭味明顯,而N 組小鼠體型健碩,行動(dòng)敏捷。干預(yù)30 d 后,除D15 組外,其余各干預(yù)組小鼠的上述不良狀況均有所緩解。由圖4可知,造模成功后,小鼠攝食量、飲水量增加,體重減輕。干預(yù)30 d 后,與M 組相比,D15、D30、D50、P1、P2 組小鼠的攝食量和飲水量皆有所降低;除D15 組外,其余各干預(yù)組小鼠體重減輕的趨向也逐漸減緩。可見(jiàn),香葉木素對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠高攝食量、高飲水量和低體重的病征具有一定的緩解作用。
圖4 香葉木素對(duì)小鼠攝食量、飲水量和體重的影響Fig.4 Effect of diosmetin on food intake,water intake and body weight of mice
3.4 香葉木素對(duì)小鼠FBG、HOMA-IR 和INS含量的影響
由表4可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),N 組小鼠的FBG 一直遠(yuǎn)低于11.1 mmol/L,而M 組的FBG 則持續(xù)上升。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 在干預(yù)12 d 后開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的下降,在干預(yù)12,18,24,30 d 的FBG 均顯著低于M 組(P<0.05)。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 隨著香葉木素濃度的增大而降低,呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。由圖5和圖6可見(jiàn),與N 組相比,M 組小鼠的INS 含 、HOMA-IR 均極顯著提高(P<0.01),說(shuō)明Ⅱ型糖尿病小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗癥狀[34]。干預(yù)30 d后,與M 組相比,D15、D30、D50 組小鼠的INS 含量、HOMA-IR 均顯著降低(P<0.05),并且INS 含量、HOMA-IR 均隨著香葉木素濃度的增大而降低,顯示出較好的劑量依賴(lài)性??梢钥闯觯闳~木素能夠降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG,緩解其胰島素抵抗癥狀。
圖5 香葉木素對(duì)小鼠胰島素含量的影響Fig.5 Effect of diosmetin on insulin content in mice
圖6 香葉木素對(duì)小鼠HOMA-IR 的影響Fig.6 Effect of diosmetin on HOMA-IR in mice
表4 香葉木素對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠FBG 的影響Table 4 Effect of diosmetin on FBG in type Ⅱdiabetic mice
3.5 香葉木素對(duì)小鼠GSP 含量的影響
GSP 可以反映糖尿病患者在過(guò)去1~2 周內(nèi)血糖的控制情況[29]。由圖7可見(jiàn),M 組小鼠血清中GSP 含量極顯著地高于N 組(P<0.01)。干預(yù)30 d后,與M 組相比,D15 組小鼠的GSP 含量略有下降(P>0.05),D30、D50、P1、P2 組GSP 含量顯著下降(P<0.05)。
圖7 香葉木素對(duì)小鼠GSP 含量的影響Fig.7 Effect of diosmetin on GSP content in mice
3.6 香葉木素對(duì)小鼠OGTT 的影響
OGTT 主要反映機(jī)體血糖調(diào)節(jié)能力和胰島素敏感性[35]。由表5可知,與N 組對(duì)比,M 組小鼠的血糖值在給予葡萄糖前(0 h)和給予葡萄糖后(0.5,2 h)均極顯著增高(P<0.01);與M 組對(duì)比,D30、D50 組小鼠在0.5,2 h 的血糖值皆顯著降低(P<0.05);D15 組在0.5 h 的血糖值與M 組相比沒(méi)有顯著差別(P>0.05),而在2 h 的血糖值顯著低于M 組(P<0.05)。由圖8可見(jiàn),M 組小鼠的AUC 極顯著高于N 組小鼠(P<0.01);D30、D50 組小鼠的AUC 顯著低于M 組(P<0.05),D15 組的AUC 略低于M 組(P>0.05)??梢?jiàn),香葉木素可以緩解小鼠OGTT 異常。
表5 香葉木素對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠OGTT 的影響Table 5 Effect of diosmetin on OGTT in type Ⅱdiabetic mice
圖8 香葉木素對(duì)小鼠AUC 的影響Fig.8 Effect of diosmetin on AUC of mice
3.7 香葉木素對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響
糖尿病往往會(huì)引起肝、腎等臟器的傷害,通常臟器指數(shù)增大說(shuō)明臟器可能出現(xiàn)了損傷[27,32]。由表6可知,與N 組對(duì)比,M 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數(shù)皆顯著提高(P<0.05)。干預(yù)30 d 后,與M 組相比,D30、D50 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數(shù)皆顯著降低(P<0.05);D15 組的腎臟指數(shù)與M 組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),肝臟、脾臟指數(shù)皆顯著低于M 組(P<0.05)。由此推測(cè),香葉木素具有緩解Ⅱ型糖尿病小鼠肝、脾和腎損傷的作用。
表6 香葉木素對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Table 6 Effect of diosmetin on organ index of type Ⅱdiabetic mice
3.8 香葉木素對(duì)小鼠脂代謝指標(biāo)的影響
糖代謝與脂代謝密切關(guān)聯(lián),糖尿病患者容易出現(xiàn)脂代謝紊亂,隨著病情加重甚至?xí)饎?dòng)脈粥樣硬化[36-37]。由圖9可知,與N 組對(duì)比,M 組小鼠TG、TC、LDL-C 含量均極顯著上升(P<0.01),HDL-C 含量極顯著降低(P<0.01)。干預(yù)30 d 后,與M 組相比,D30、D50 組小鼠血清中TG、TC、LDL-C 含量皆明顯降低(P<0.05),HDL-C 含量明顯提高(P<0.05);D15、D30、D50 組小鼠的TG、TC、LDL-C 含量均隨著香葉木素劑量的增大而降低,HDL-C 含量隨著香葉木素劑量的增大而升高,顯示出較好的量效關(guān)系??梢钥闯觯闳~木素對(duì)小鼠脂代謝紊亂表現(xiàn)出較好的緩解作用。
圖9 香葉木素對(duì)小鼠脂代謝的影響Fig.9 Effect of diosmetin on lipid metabolism in mice
3.9 香葉木素對(duì)小鼠肝糖原的影響
肝糖原的合成與分解可以反映機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收和利用情況[27]。由圖10可見(jiàn),與N 組對(duì)比,M 組小鼠肝糖原含量極顯著降低(P<0.01)。干預(yù)30 d 后,與M 組對(duì)比,D15、D30、D50 組小鼠的肝糖原含量皆明顯提高(P<0.05);隨著香葉木素劑量的提升,小鼠肝糖原積累量逐漸增多。
圖10 香葉木素對(duì)小鼠肝糖原含量的影響Fig.10 Effect of diosmetin on liver glycogen in mice
3.10 香葉木素對(duì)小鼠肝功能的影響
AST 和ALT 是衡量肝功能的重要標(biāo)志物[1]。由圖11可見(jiàn),與N 組對(duì)比,M 組小鼠血清中AST、ALT 活力極顯著升高(P<0.01)。干預(yù)30 d 后,與M組對(duì)比,D15、D30、D50 組小鼠AST、ALT 活力皆明顯下降(P<0.05)。小鼠ALT、AST 活力隨著香葉木素劑量的增大而減弱,顯示出較好的量效關(guān)系。香葉木素可以減弱Ⅱ型糖尿病小鼠血清AST、ALT 活力,降低小鼠肝臟指數(shù)(表6),提示其能夠緩解糖尿病小鼠的肝功能損傷。
圖11 香葉木素對(duì)小鼠肝功能相關(guān)酶活力的影響Fig.11 Effect of diosmetin on enzymes related to liver function in mice
3.11 香葉木素對(duì)小鼠抗氧化能力的影響 由圖12、13 可見(jiàn),與N 組相比,M 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量極顯著上升(P<0.01),T-AOC 以及SOD、GSH-Px 活力極顯著降低(P<0.01)。30 d 干預(yù)后,與M 組對(duì)比,D15、D30、D50 組小鼠肝臟和血清中T-AOC 明顯提升(P<0.05),T-AOC 隨著香葉木素濃度的增大而升高;D30、D50 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量均明顯低于M 組(P<0.05),D15 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量略低于M 組(P>0.05),MDA 含量隨著香葉木素劑量的增大而變少;D30、D50 組小鼠血清和肝臟的抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活力皆明顯高于M 組(P<0.05),D15 組抗氧化酶活力略高于M 組。氧化應(yīng)激與糖尿病緊密聯(lián)系[38]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)血糖濃度過(guò)高時(shí),會(huì)刺激組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),可能破壞胰島B 細(xì)胞功能,使胰島素分泌不足[38-39]。香葉木素有助于改善小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài),對(duì)于Ⅱ型糖尿病防治具有積極作用。
圖12 香葉木素對(duì)小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.12 Effect of diosmetin on oxidative stress of serum in mice
圖13 香葉木素對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.13 Effect of diosmetin on oxidative stress of liver in mice
本研究分析了香葉木素與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接能力及其對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性,在此基礎(chǔ)上通過(guò)Ⅱ型糖尿病小鼠模型研究了香葉木素的降血糖活性,并探究了其對(duì)脂代謝、氧化應(yīng)激等的效應(yīng)。香葉木素干預(yù)30 d 后,糖尿病小鼠多食、多飲和體重減輕等病征得到緩解,同時(shí),香葉木素還可降低小鼠的FBG 與GSP含量,緩解OGTT 異常與胰島素抵抗。MDA、TAOC 和SOD 等分析結(jié)果證明,香葉木素具有緩解糖尿病氧化應(yīng)激的作用。TC 和HDL-C 等分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),香葉木素可以改善小鼠的脂代謝紊亂。肝臟指數(shù)和AST、ALT 分析結(jié)果顯示,香葉木素可以緩解Ⅱ型糖尿病引起的肝功能受損。綜上,香葉木素對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠具有較好的降血糖作用,但其具體機(jī)制尚需通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探究。