申 瑾，譚 睿，郭家俊，陳 翔，吳 珊，包軍鵬，章 中

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021）

芽孢是細菌營養(yǎng)體在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境條件下形成的休眠態(tài)，可以休眠幾萬年以上而復(fù)活[1]。在食品工業(yè)中，常因殺菌強度不夠而引發(fā)由芽孢導(dǎo)致的食品腐敗和食物中毒問題時有發(fā)生[2]。高抗性芽孢的殺滅是低酸性食品安全的一個關(guān)鍵問題[3]?？莶輻U菌芽孢是高抗性的細菌芽孢之一，其芽孢含水量極低，高度脫水及芽孢內(nèi)膜的極端不通透性是其具有極強抗逆性的重要原因之一[4-7]。即使在室溫、很高的壓力水平（1 000 MPa）也不能有效滅活細菌芽孢。有研究指出，始終需要超高壓和溫度相結(jié)合才能有效地滅活枯草桿菌芽孢[8-10]。

高壓熱殺菌（High-pressure thermal sterilization，HPTS） 是指將靜態(tài)超高壓和熱耦合起來用于殺菌，是一種新興的生產(chǎn)貨架穩(wěn)定食品的技術(shù)。和傳統(tǒng)高溫?zé)釟⒕啾?，HPTS 使用的溫度較低、時間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)素和功能性成分[3，11]，受到國內(nèi)外食品科學(xué)家的廣泛關(guān)注[12-13]。目前關(guān)于HPTS 對細菌芽孢的良好殺滅作用已得到公認(rèn)，然而HPTS 殺滅芽孢的機理鮮有報道，限制了該技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用。

本試驗采用平板計數(shù)法、紫外分光光度法、流式細胞術(shù)研究HPTS 對芽孢存活率、紫外泄漏量、內(nèi)膜通透性的變化規(guī)律，同時利用傅里葉紅外光譜結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜及主成分分析分析HPTS 處理枯草桿菌芽孢前、后芽孢脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖的變化，闡明HPTS 殺滅芽孢的作用機理。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號As 1.433；營養(yǎng)瓊脂，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸錳（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；碘化丙啶（PI），北京索萊寶科技有限公司；TSA-YE 培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9000S 型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；CyFlow Cube 8 流式細胞儀，日本SYSMEX（希森美康）株式會社；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；DSX-280B 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Scientz-1LS 真空冷凍干燥濃縮儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；CyFlow Cube 8 流式細胞儀，日本SYSMEX（希森美康） 株式會社；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer 公司；超高壓設(shè)備5L HPP 600 MPa，內(nèi)蒙古包頭科發(fā)高壓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備 芽孢的制備，將活化的枯草桿菌芽孢接入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，用無菌去離子水振蕩、洗滌、收集，將收集好的芽孢用無菌去離子水離心洗滌（4 ℃、8 000 r/min、15 min）芽孢3 次，洗滌后的芽孢重懸在無菌去離子水，調(diào)節(jié)芽孢濃度約為108CFU/mL，4 ℃保存，1 個月內(nèi)使用。

1.3.2 枯草桿菌芽孢懸浮液的HPTS 處理 取1.3.1 節(jié)制備的芽孢懸浮液放入滅菌好的包裝袋并置于超高壓加壓釜中，放入超高壓儀器中，處理介質(zhì)為水，作為壓力傳遞介質(zhì)對樣品加壓。對樣品進行溫壓處理：壓力為200，550 MPa 結(jié)合處理溫度25，65，75 ℃，保壓處理20 min，處理時間不包括升壓和卸壓所需時間，每個樣品平行3 次。壓力水平，時間和溫度由計算機控制。在加壓過程中，通過K 型熱電偶測量壓力容器中介質(zhì)的溫度。減壓后，將樣品在冰浴中冷卻，并在計數(shù)前4 ℃下保存6 h。

1.3.3 枯草桿菌芽孢平板計數(shù)方法 將處理前、后的芽孢懸浮液進行梯度稀釋，用移液槍分別吸取1 mL 稀釋液，用TSA-YE 培養(yǎng)基進行傾注平板計數(shù)。37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，計算菌落總數(shù)對數(shù)值。

1.3.4 枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測定 將處理前后的菌懸液于4 ℃、9 000×g 離心15 min，收集上清液，使用紫外分光光度計測定260 nm（核酸）和280 nm（蛋白質(zhì)）處的吸光值，每組設(shè)置3 個平行，未處理的菌懸液為對照組，無菌水為空白對照。

1.3.5 流式細胞儀檢測枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性 取處理前后的枯草芽孢桿菌芽孢懸浮液，稀釋到菌液濃度為106～107CFU/mL。使用PI（Propidium iodide，碘化丙啶）染色，在1 mL 芽孢懸浮液中加入0.75 μL 20 mmol/L 的PI 染色液，在室溫下暗處孵育15 min。用流式細胞儀檢測前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）、熒光通道FL2和FL3。采用488 nm 激發(fā)光，PI 標(biāo)記細胞在615 nm 處發(fā)紅色熒光（FL3）。數(shù)據(jù)采集后用FSC Express Version 3.0 軟件（De Novo software，Canada）分析。

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析 將1.3.2 節(jié)的枯草桿菌芽孢懸浮液進行冷凍干燥，通過傅里葉紅外光譜儀在室溫下進行測定，加入樣品質(zhì)量50～100倍的KBr 后進行研磨，壓片后，選用空白KBr 片作為對照。置于傅里葉紅外光譜儀上，于4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行掃描，掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

樣品的傅里葉變換紅外光譜圖利用PeakFitv 4.12 軟件在譜帶范圍內(nèi)（酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1）校正基線，然后用Gaussian 去卷積，做二階導(dǎo)數(shù)擬合，多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計算枯草桿菌芽孢蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)含量。利用Origin 分析所采集的紅外數(shù)據(jù)中3 300～2 800 cm-1脂質(zhì)波段、1 700～1 600 cm-1蛋白質(zhì)波段、1 300～900 cm-1核酸波段的數(shù)據(jù)進行歸一化并進行二階求導(dǎo)。將校正基線后的紅外光譜數(shù)據(jù)在SIMCA14.0 軟件中進行PCA 分析。

所有試驗至少重復(fù)3 次，試驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。用Origin 2018.0 軟件對試驗結(jié)果進行作圖及數(shù)據(jù)分析，用SPSS24 進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05 為顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。表中不同的標(biāo)注字母表示有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPTS 處理對枯草桿菌芽孢的殺滅作用

通過測量枯草桿菌芽孢的存活濃度來探究HPTS 殺菌的效果。圖1為HPTS（200，550 MPa 分別結(jié)合25，65，75 ℃）處理前后枯草桿菌芽孢存活濃度的變化?？莶輻U菌芽孢處理前的初始計數(shù)約為1×7 lg（CFU/mL）。與未處理的枯草桿菌芽孢存活濃度相比，200 MPa-25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢分別下降0.02，1.61，4.2 lg（CFU/mL）；550 MPa-25 ℃/65 ℃/75 ℃處理枯草桿菌芽孢分別下降0.04，2.85，5.2 lg（CFU/mL），結(jié)果表明單一壓力不能滅活芽孢，這與前人研究結(jié)果一致[14]；HPTS 處理能顯著降低枯草桿菌芽孢的存活率。

圖1 HPTS 處理前后對枯草桿菌芽孢存活濃度的影響Fig.1 Effect of HPTS on the survival concentration of Bacillus subtilis

2.2 HPTS 處理前后枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測定

由于核酸中含有嘌呤、嘧啶堿基，蛋白質(zhì)中含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)，這些結(jié)構(gòu)都具有共軛雙鍵（-C-C=C-C=C-），所以在紫外光區(qū)有強烈的光吸收作用。核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收峰分別在260 nm 和280 nm 附近。因此采用紫外線吸收來測量細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)物質(zhì)的泄漏情況，以表明芽孢內(nèi)膜受損[15]。處理條件不同導(dǎo)致所有處理樣品中紫外線吸收物質(zhì)的泄漏量不同（表1）。

表1 HPTS 對枯草芽孢桿菌紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響Table 1 Effect of HPTS on the leakage of ultraviolet absorbing substances of Bacillus subtilis

由表中可以看出，枯草桿菌芽孢經(jīng)HPTS 處理上清液中的核酸與蛋白的泄漏量都顯著增加（P＜0.05），說明HPTS 處理使得芽孢內(nèi)膜的受損程度不斷增加，通透性不斷升高，使更多的核酸蛋白物質(zhì)流出到細胞外。

2.3 HPTS 處理對枯草桿菌芽孢細胞膜損傷的流式細胞儀檢測

進一步采用流式細胞術(shù)PI 熒光染料研究芽孢內(nèi)膜通透性的改變[16]。熒光染料PI 是一種溴化乙啶的類似物，當(dāng)膜受到損傷時，PI 能夠透過受損的細胞膜進入到細胞內(nèi)部，結(jié)合DNA 后發(fā)出強烈的熒光。流式細胞儀直方圖可分為兩個區(qū)域M1和M2，M1 區(qū)是陰性區(qū)域，表明芽孢的內(nèi)膜沒有遭到的破壞，PI 無法透過芽孢內(nèi)膜，M2 是陽性區(qū)域，表明PI 和芽孢DNA 結(jié)合且發(fā)射強熒光。與未處理芽孢相比，經(jīng)HPTS 處理后，熒光分布都極顯著的向M2 區(qū)移動，說明芽孢受到一定程度的損傷，芽孢內(nèi)膜通透性增加，與紫外吸收泄漏量的結(jié)果相一致。HPTS 導(dǎo)致芽孢滅活機制與芽孢內(nèi)膜通透性有關(guān)。

圖2 HPTS 處理對枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的影響Fig.2 The effect of HPTS treatment on the permeability of the endometrial membrane of Bacillus spores

2.4 HPTS 處理枯草桿菌芽孢的紅外光譜分析

圖3a 反映不同條件下處理枯草桿菌芽孢樣品進行傅里葉紅外檢測的譜圖，紅外檢測的波長范圍為4 000～400 cm-1，可以看出不同條件處理枯草桿菌芽孢光譜的峰形、峰高等基本相似反映出不同條件處理后枯草桿菌芽孢的化學(xué)組分基本相似，主要包括3 000～2 800 cm-1，1 700～1 600 cm-1，1 300～900 cm-1處的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸[17]。

圖3 HPTS 處理前后枯草桿菌芽孢的紅外及二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.3 Infrared and second-derivative of Bacillus spores before and after HPTS treatment

由圖3b 可見，HPTS 處理前后枯草桿菌芽孢譜圖的變化較不明顯，從譜圖中無法分辨峰位的變化情況，必須對得到的原譜圖進行數(shù)據(jù)分析處理。二階導(dǎo)數(shù)處理是紅外譜圖處理中常見的方法[18]，它可以將原譜圖中微小的差別分辨開來，有利于譜圖的分析利用紅外且二階導(dǎo)數(shù)光譜與傳統(tǒng)光譜相比具有精度高、分辨率好、靈敏度高等特點，能有效地分辨出重疊峰和強峰的肩峰。從二階導(dǎo)數(shù)光譜看除了在大約3 000～2 800 cm-1，和1 700～500 cm-1的范圍內(nèi)的窄峰之外，在研究的光譜區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)峰位置的顯著差異。在這些區(qū)域中選取對細菌芽孢滅活影響大的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和肽聚糖進行二階導(dǎo)數(shù)分析，根據(jù)官能團的位移及峰強的形狀來具體研究對細菌芽孢滅活作用的影響。

2.5 HPTS 處理枯草桿菌芽孢的二階導(dǎo)數(shù)圖譜分析

由圖4a 看出不同處理條件下紅外光譜有一些共同的特征峰的變化。區(qū)域在3 000～2 800 cm-1主要代表膜脂質(zhì)，大約2 855 cm-1和2 925 cm-1波數(shù)表示-CH3和-CH2對稱和反對稱伸縮振動[18]。-CH2發(fā)生的規(guī)律性位移則在一定程度上反映細胞膜脂質(zhì)次甲基鏈的堆積特征和脂質(zhì)雙層的有序/無序性質(zhì)[19]。HPTS 引起細胞膜脂肪?；湹淖兓?，如果脂肪酰基鏈被“融化”而達到高度構(gòu)象紊亂，則峰移至更高的波數(shù)[20]。如圖4a 所示，HPTS處理后，2 852 cm-1波段的峰位基本沒有變化；2 929 cm-1波段的峰值位移復(fù)雜，與未處理的枯草桿菌芽孢相比，550 MPa-65 ℃/75 ℃沒有發(fā)生位移，而200 MPa 壓力處理下與550 MPa-25 ℃波段的峰值都向低波數(shù)段位移，分別移至2 927，2 925，2 925，2 927 cm-1。表明枯草桿菌芽孢的細胞膜的磷脂分子疏水尾鏈混亂度增大。與常溫結(jié)合壓力處理相比，200 MPa-65 ℃/75 ℃向低波數(shù)段位移而550 MPa-65 ℃/75 ℃向高波數(shù)段位移，說明隨著溫度的升高200 MPa 與550 MPa 結(jié)合溫度處理對枯草桿菌芽孢的作用不同而在550 MPa-65 ℃/75 ℃時，由于較高壓似乎將熱引起的內(nèi)膜相態(tài)轉(zhuǎn)變抵消了，高壓與溫度升高導(dǎo)致的磷脂膜改變，波峰沒有發(fā)生位移，這與前人結(jié)果一致[21-22]。

圖4 HPTS 處理前后枯草桿菌芽孢二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig.4 Second- derivative FT-IR spectra of Bacillus subtilis spores nucleic acid treated by HPTS

波段1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ帶，主要涉及肽鏈C＝O 伸縮振動，與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。圖4b 可以發(fā)現(xiàn)在HPTS 處理后其峰位都有所改變。與未處理的枯草桿菌芽孢相比，25 ℃結(jié)合壓力處理條件下，C=O 伸縮振動都向高波數(shù)方向移動，可能的原因是高壓導(dǎo)致蛋白變性主要是由于分子內(nèi)部的空穴體積變化，根據(jù)“水滲透模型”，由于壓力的作用，水分子進入到空穴中，導(dǎo)致蛋白分子體積的變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，其中蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵被破壞，使峰位向高波數(shù)方向移動[23]。同時550 MPa 結(jié)合溫度處理C=O 伸縮振動也向高波數(shù)方向移動，有報道[24]指出，通常蛋白質(zhì)高溫會破壞分子的內(nèi)氫鍵，使峰位向高波數(shù)方向移動。這主要是由于蛋白質(zhì)的水合作用造成偶極離子的瞬間改變從而使酰胺Ⅰ帶的峰增強，說明在溫壓結(jié)合處理過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了變性且破環(huán)了蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵。200 MPa-65/75 ℃與220 MPa常溫處理相比，C=O 伸縮振動向低波數(shù)方向移動，這是因為蛋白質(zhì)的氨基酸殘基間形成的氫鍵（C=O…H-）較強時，C=O 的電子云密度較低，較少的能量就可使其發(fā)生振動，C=O 的吸收峰向低波數(shù)方向移動。綜上所述，經(jīng)過HPTS 處理后，峰形也發(fā)生了明顯的變化，細菌芽孢蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生了變性。

圖4c 中波段1 300～900 cm-1表示細胞核酸，細胞壁成分的振動特征，1 232 cm-1和1 082 cm-1吸收峰，分別屬于核酸磷酸二酯主鏈的反對稱伸縮和對稱伸縮振動，與核酸變性相關(guān)[25]。1 232 cm-1與1 080 cm-1處的吸收峰發(fā)生了明顯的變化，表明HPTS 確實能夠?qū)е录毦挎邇?nèi)核酸物質(zhì)的變性，且1 080 cm-1和1 232 cm-1特征峰都向低波數(shù)移動，這是因為在HPTS 處理過程中，細胞內(nèi)的核酸分子中PO42-基團氫鍵化程度發(fā)生變化引起，氫鍵的減弱使得峰位向低波數(shù)移動。芽孢1 232 cm-1處的吸收峰向低波數(shù)譜帶偏移，表明其以氫鍵化形式存在的基團數(shù)增多。

此外，1 200～900 cm-1的吸收峰變化主要是由C-O-C 伸縮振動導(dǎo)致的，可以反映細胞壁肽聚糖層在處理前后的變化[26]。芽孢皮層肽聚糖支架是其耐壓特性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。圖4c 中，枯草桿菌芽孢在HPTS 處理前后肽聚糖層和細胞壁（950 cm-1）發(fā)生了明顯的變化，說明芽孢皮層肽聚糖和芽孢細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.6 枯草桿菌芽孢酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）的擬合結(jié)果分析

蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的光譜區(qū)間為1 700～1 600 cm-1，主要包含了-C=O 的伸縮振動，對于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化非常敏感，對于研究二級結(jié)構(gòu)最有價值[27]。應(yīng)用二階導(dǎo)數(shù)和曲線擬合的方法對未處理及HPTS 處理后的枯草桿菌芽孢酰胺Ⅰ帶曲線擬合。酰胺Ⅰ帶是由多個子峰重疊而成的寬峰，從圖5得出分別有12，13，18，12，14，14，13 自帶峰，對自帶峰進行指認(rèn)，計算各子峰和總峰的峰面積，得各二級結(jié)構(gòu)含量[23]。位于1 600～1 700 cm-1范圍的酰胺I 帶與蛋白質(zhì)骨架構(gòu)象類型相關(guān)，其主要涉及肽鏈C＝O 伸縮振動和N-H 平面彎曲振動等。α 螺旋集中于1 650～1 660 cm-1，β 折疊集中于1 610～1 640 cm-1，β 轉(zhuǎn)角集中于1 660～1 670 cm-1，無規(guī)卷曲集中于1 640～1 650 cm-1[28]。

圖5 蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm－1）擬合紅外譜圖Fig.5 Curve-fitting FTIR spectra of the amide Ⅰ（1 700-1 600 cm-1）

枯草桿菌芽孢蛋白二級結(jié)構(gòu)的相對含量如圖6，未處理的枯草桿菌芽孢酰胺Ⅰ帶有大量的有序二級結(jié)構(gòu)α-螺旋與β-折疊。從整體趨勢發(fā)現(xiàn)，與未處理的枯草桿菌芽孢相比，HPTS 處理主要減少蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，說明HPTS 處理后細菌芽孢蛋白質(zhì)發(fā)生變性且從有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序狀態(tài)，可能通過影響細菌芽孢的代謝過程導(dǎo)致芽孢滅活[29-31]。Hamzah 等[31]發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)從有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序狀態(tài)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降，并進一步影響細胞的代謝過程，與本試驗結(jié)果一致。同時β-轉(zhuǎn)角主要出現(xiàn)在蛋白的表面，說明HPTS 處理后蛋白的結(jié)構(gòu)較為緊密。

圖6 枯草桿菌芽孢蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量Fig.6 Protein secondary structure content of Bacillus subtilis spores

2.7 HPTS 處理前、后枯草桿菌芽孢紅外主成分分析

主成分載荷圖能夠顯示不同變量對主成分的貢獻大小，獲取更多HPTS 處理枯草桿菌芽孢前后樣品的差異信息。對PC1 和PC2 的相應(yīng)載荷圖的進一步分析（圖7b）確定了光譜波數(shù)（和相關(guān)的官能團） 及其在區(qū)分不同HPTS 處理細菌芽孢中的意義。在解釋荷載圖時，如果波數(shù)具有較大的正負荷載，則波數(shù)對于相關(guān)的主分量很重要；在PC1中具有較大載荷的波數(shù)對區(qū)分芽孢的貢獻大于PC2，PC1 是主成分分析中最重要的成分。p[1]和p[2]分別為主成分變量PC1 和PC2 的載荷值，PC1負載最大的最突出峰在1 000～1 700、2 500～3 660 cm-1，即在這些波數(shù)附近有吸收峰的物質(zhì)對第一主成分的貢獻較大，通過光譜解析結(jié)合枯草桿菌芽

圖7 HPTS 處理前后枯草桿菌芽孢紅外光譜主成分分析Fig.7 Analysis of the main components of the infrared spectroscopy of Bacillus subtilis spores before and after HPTS treatment

孢化學(xué)成分信息可知主成分載荷圖的吸收峰主要歸屬為芽孢的蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等，表明HPTS處理導(dǎo)致這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化存在差異。對PC2 貢獻較大的吸收峰為775～997、1 774～2 576、3 670～4 000 cm-1等，與PC1 形成互補，總貢獻率達到95.1%。

3 討論

本文通過HPTS 處理枯草桿菌芽孢前后存活濃度、芽孢內(nèi)膜損傷程度、內(nèi)膜通透性、芽孢成分等指標(biāo)的檢測，探討了HPTS（200 MPa 結(jié)合25，65，75 ℃；550 MPa 結(jié)合25，65，75 ℃；保壓時間：20 min）處理對枯草桿菌芽孢殺滅作用及機理。得出以下結(jié)論：

1）經(jīng)HPTS 處理后，芽孢內(nèi)膜損傷嚴(yán)重、內(nèi)膜通透性增加，芽孢存活濃度降低。HPTS 可有效破壞芽孢內(nèi)膜的水分子通透屏障，水分子更易通過芽孢內(nèi)膜而進入到芽孢核心，而隨著芽孢核心水分含量的增加，芽孢耐熱性大大降低，芽孢通透性的增加是芽孢滅活的一個重要原因。

2）傅里葉紅外光譜反映了HPTS 處理引起的膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和多糖的變化，在本研究中采用傅里葉紅外光譜結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對HPTS 處理前后的枯草桿菌芽孢進行分析，發(fā)現(xiàn)波段在3 000～2 800 cm-1、1 700～1 600 cm-1、1 300～900 cm-1區(qū)域的膜脂質(zhì)，蛋白質(zhì)、核酸和肽聚糖層發(fā)生了變性，并對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行擬合進一步發(fā)現(xiàn)從有序變?yōu)闊o序，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。這些物質(zhì)的變化可影響芽孢的生理代謝，從而使芽孢滅活。這些結(jié)果增加了有關(guān)HPTS 對枯草桿菌芽孢滅活機制的研究，促進了HPTS 在食品加工中的應(yīng)用。

3）利用SIMCA 對不同HPTS 處理的芽孢FT-IR 光譜進行主成分分析，對不同HPTS 處理的芽孢生理結(jié)構(gòu)相似性進行判別，發(fā)現(xiàn)其相似性，并得到HPTS 處理對芽孢影響密切相關(guān)的特征波長，這些特征波長反映HPTS 滅活芽孢作用過程中的關(guān)鍵成分的變化，促進了FT-IR 光譜應(yīng)用于微生物的研究。

綜上所述，芽孢內(nèi)膜受損，芽孢內(nèi)膜通透性增加、芽孢膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等結(jié)構(gòu)改變與HPTS 滅活芽孢相關(guān)。