呂 航，可 欽，檀德宏，周 倩，吳朝霞，紀(jì)淑娟，白 冰*

（1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽(yáng) 110866 2 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古赤峰 024005）

大蒜為百合科蔥屬植物。大蒜不僅是重要的調(diào)味品，還具有抗氧化[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4-5]、抗癌[6]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[7-8]，調(diào)節(jié)血糖[9]、血脂[10]、降壓[11]等功能。研究表明，大蒜的生物活性主要是源自于其含量較高的有機(jī)硫化物，目前在大蒜中檢測(cè)出30多種硫化物[12]。其中大蒜油是一種揮發(fā)油，主要由一些揮發(fā)性硫化物組成，包括二烯丙基二硫醚（Diallyl Disulfide，DADS）、二烯丙基三硫醚（Diallyl Trisulfide，DATS）[13]。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase，G6PD）是戊糖磷酸途徑的限速酶，可催化D-葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。戊糖磷酸途徑可提供增殖所需的核苷酸前體和NADPH，在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中，G6PD 的表達(dá)都是上調(diào)的，以滿足腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)需要[14-16]。G6PD 在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和活性增加，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤組織的快速擴(kuò)張[17-19]。對(duì)G6PD 活性的抑制成為控制腫瘤增殖的一種重要方式，因此對(duì)G6PD 抑制劑的研究也日漸增多。類固醇類抑制劑，如脫氫表雄甾酮（DHEA）[20]、表雄甾酮（EA）[21]等被證實(shí)可抑制G6PD 活性。來(lái)自大蒜的脂溶性硫化物DADS 和DATS 對(duì)G6PD 的抑制研究目前鮮有報(bào)道。

本研究以大蒜油的主要成分DADS/DATS 為研究對(duì)象，利用分子熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)揭示DADS/DATS 對(duì)G6PD 的活性具有部分抑制效果。以酶動(dòng)力學(xué)原理分析其抑制類型，采用分子熒光光譜揭示DADS/DATS 對(duì)G6PD 的熒光淬滅機(jī)制，并分析結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)和相互作用力。利用3D 和2D 分子對(duì)接技術(shù)印證DADS/DATS 對(duì)G6PD 的作用力種類和結(jié)合方式。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大蒜（白皮大蒜），沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大蒜油（提取自大蒜），沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚（優(yōu)級(jí)純），美國(guó)Sigma 公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（150 U/mg，微生物來(lái)源），上海源葉公司；D-葡萄糖-6-磷酸，上海麥克林公司；氧化型輔酶NAD，北京索萊寶公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥公司。

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；F-4600 分子熒光光譜儀，日本日立公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用公司；XMTD-8222 型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏公司；FA224 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海中光儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大蒜油的提取 提取方法參照文獻(xiàn)，略有改動(dòng)[22]。新鮮大蒜去皮洗凈搗碎，取適量蒜泥，40 ℃pH 6.5 條件下使大蒜內(nèi)蒜氨酸和蒜氨酸酶充分反應(yīng)1 h。按料液比1∶4（V/V）加入無(wú)水乙醇，40 ℃下超聲提取30 min，過(guò)濾并濃縮得到大蒜油。

GC-MS 方法參照文獻(xiàn)，略有改動(dòng)[23]：色譜柱：DB-17MS（30 m×0.25 μm）；載氣：He（純度99.999%）；EI 離子源溫度：230 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；監(jiān)測(cè)器溫度：250 ℃；程序升溫條件：90 ℃保持1 min，10 ℃/min 速度升溫至250 ℃；樣品濃度：1 μL/L；進(jìn)樣量：1 μL；不分流模式。

1.2.2 大蒜油、DADS、DATS 對(duì)G6PD 活性的影響 通用Tris-HCl 緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5）。大蒜油/DADS/DATS 經(jīng)乙醇溶解，分別配制成大蒜油（50～200 μL/mL）、DADS/DATS（1.25～5 mmol/L）。G6PD（0.1 mg/mL）分別與大蒜油/DADS/DATS 以1 ∶1（V/V）混勻，37 ℃水浴30 min，作為酶處理液。

G6PD 酶活測(cè)定體系，Tris-HCl 緩沖液400 μL、D-葡萄糖-6-磷酸100 μL（0.03 mg/mL）、NAD溶液20 μL（10 mg/mL），最后加入酶處理液40 μL，加蓋搖勻，迅速放入分子熒光光譜儀，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，每5 s 記錄460 nm 熒光強(qiáng)度，連續(xù)測(cè)定195 s。

1.2.3 DADS、DATS 對(duì)G6PD 抑制類型分析 反應(yīng)體系，Tris-HCl 緩沖液120 μL、D-葡萄糖-6-磷酸50 μL（0.01～0.05 mg/mL），NAD 溶液10 μL（10 mg/mL），最后加入酶處理液20 μL，加蓋搖勻，立即監(jiān)測(cè)340 nm 處吸光值。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，判定抑制類型。

1.2.4 DADS、DATS 對(duì)G6PD 蛋白的熒光淬滅 G6PD（0.5 mg/mL）與DADS/DATS（0～5 mmol/L）等體積混合，分別在298，308，318 K 水浴10 min。取此溶液100 μL，加入Tris-HCl 緩沖液400 μL，加蓋搖勻，迅速放入分子熒光光譜儀，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描290～450 nm 范圍的熒光光譜。

1.2.5 熒光淬滅機(jī)理分析 結(jié)合Stern-Volmer 方程（1），在298，308，318 K 下，以未處理的G6PD的熒光強(qiáng)度（F0）與加入DADS/DATS 后G6PD 的熒光強(qiáng)度（F）的比值對(duì)DADS/DATS 濃度（[Q]）作圖。

式中：Ksv——淬滅常數(shù)；Kq——淬滅速率常數(shù)；τ——生物分子的平均熒光壽命（10-8s）。

1.2.6 DADS、DATS 與G6PD 的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù) 以lg[（F0-F）/F]對(duì)lg[Q]作圖，根據(jù)式（2）可求結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）。

以lnKa對(duì)1/T 作圖，根據(jù)式（3）可求焓變?chǔ)、熵變?chǔ)，由式（4）可求吉布斯自由能變?chǔ)。

1.2.7 分子對(duì)接技術(shù) G6PD 晶體結(jié)構(gòu)取自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（PDBID：2BHL），DADS、DATS 的分子結(jié)構(gòu)來(lái)自ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)（1531082，1633229）。利用軟件Autodock4.2 進(jìn)行分子對(duì)接，使用拉馬克遺傳算法，選擇自由能最低的結(jié)合模式分析，利用PYMOL 和LIGPLOT 軟件導(dǎo)出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜油的GC-MS 分析

圖1為大蒜油的總離子流圖和質(zhì)譜圖，主要包含2 種硫醚：DADS（圖1c 峰1）、DATS（圖1c 峰2）。DADS、DATS 保留時(shí)間分別為4.9，6.8 min。圖1a 和圖1b 分別為保留時(shí)間4.9，6.8 min 時(shí)的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了質(zhì)量/電荷比（m/z）為41，73，113，146，178 的主要碎片，m/z 41 對(duì)應(yīng)CH2=CHCH2-，m/z 73 對(duì)應(yīng)CH2=CH-CH2-S-。146（Ma）和178（Mb） 分別為DADS（C6H10S2，146） 和DATS（C6H10S3，178）的分子離子碎片。

圖1 大蒜油總離子流圖（TIC）（c）及DADS（a）、DATS（b）的質(zhì)譜圖（MS）Fig.1 Total ion current chromatogram（TIC）（c） and mass spectrum（MS） of DADS（a），DATS（b）

2.2 大蒜油/DADS/DATS 對(duì)G6PD 活性抑制作用

如圖2a～2c 所示，利用分子熒光光譜儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了大蒜油對(duì)G6PD 活性的影響，熒光強(qiáng)度與酶活成正比，發(fā)現(xiàn)50～200 μL/mL 的大蒜油具有部分抑制G6PD 活性作用。進(jìn)一步考察大蒜油主要成分DADS/DATS 對(duì)G6PD 活性的影響，1.25～5 mmol/L 的DADS/DATS 均具有抑制G6PD 活性的作用，且呈濃度依賴關(guān)系。

圖2 不同濃度的大蒜油（a）、DADS（b）、DATS（c）對(duì)G6PD 活性影響Fig.2 Impact on G6PD activity of different concentrations of garlic oil（a），DADS（b），DATS（c）

2.3 DADS/DATS 對(duì)G6PD 的抑制類型

Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線，如圖3a 和3b，在反應(yīng)體系中加入不同濃度的DADS/DATS 后得到一簇斜率不同，交于第二象限的直線。交點(diǎn)未落在X 軸（非競(jìng)爭(zhēng)性抑制）或者Y 軸（競(jìng)爭(zhēng)性抑制），判斷DADS/DATS 對(duì)G6PD 的抑制類型為可逆抑制中的混合性抑制，即兼具競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。說(shuō)明DADS/DATS 可通過(guò)兩種方式對(duì)G6PD 產(chǎn)生抑制：一種方式是與底物競(jìng)爭(zhēng)G6PD 的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，另一種方式是和G6PD的非活性部位結(jié)合形成復(fù)合物產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖3 DADS（a）/DATS（b）對(duì)G6PD 抑制的Lineweaver-Burk 圖Fig.3 Lineweaver-Burk plots for G6PD inhibition types of DADS（a）/DATS（b）

2.4 DADS/DATS 對(duì)G6PD 的熒光淬滅

圖4a 和4b 為298 K 時(shí)不同濃度的DADS/DATS 作用下的G6PD 的熒光光譜，隨著DADS/DATS 濃度（0～5 mmol/L）的增大，333 nm 處G6PD蛋白的熒光強(qiáng)度逐步降低，說(shuō)明DADS/DATS 與G6PD 蛋白產(chǎn)生了相互作用，導(dǎo)致了熒光的淬滅。

圖4 不同濃度的DADS（a）/DATS（b）作用下的G6PD 熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of G6PD with different concentrations of DADS（a）/DATS（b）

2.5 DADS/DATS 對(duì)G6PD 的熒光淬滅機(jī)理

熒光淬滅分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，為判斷其淬滅類型，分別在298，308，318 K 3 個(gè)溫度下，以F0/F 對(duì)[Q]（方程式1）作圖，繪制Stern-Volmer曲線，如圖5a 和5b。由曲線的斜率可求Ksv和Kq，列于表1。對(duì)于DADS/DATS 而言，隨著溫度的升高，Ksv值減小，且Kq值均大于淬滅劑對(duì)大分子物質(zhì)的最大碰撞速率常數(shù)2×1010mol/L/s。因此，DADS/DATS 對(duì)G6PD 蛋白的熒光淬滅屬于靜態(tài)淬滅。

表1 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD相互作用的KSV 和Kq 值Table 1 KSV and Kq values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

圖5 不同溫度下DADS（a）/DATS（b）與G6PD 相互作用的Stern-Volmer 曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b） and G6PD at different temperatures

2.6 DADS/DATS 與G6PD 相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

分別在298，308，318 K 3 個(gè)溫度下，以lg[（F0-F）/F]對(duì)lg[Q]（方程式2）作圖，如圖6a 和6b。通過(guò)曲線截距和斜率可求DADS/DATS 與G6PD的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，如表2。所有n 值均接近于1，說(shuō)明DADS/DATS 和G6PD 之間存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在308，318 K 時(shí)，DADS 的Ka值大于DATS 的Ka值，說(shuō)明在308，318 K 時(shí)，DADS 與G6PD 之間的結(jié)合力較強(qiáng)。

圖6 不同溫度下DADS（a）/DATS（b）與G6PD 相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.6 Double logarithmic curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b）and G6PD at different temperatures

表2 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD相互作用的Ka 和n 值Table 2 Ka and n values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

2.7 DADS/DATS 與G6PD 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力

淬滅劑小分子與生物大分子之間可通過(guò)氫鍵、靜電作用力、疏水相互作用和范德華力等相互作用?？赏ㄟ^(guò)反應(yīng)的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)、吉布斯自由能變?chǔ) 來(lái)判斷作用力類型。以lnKa對(duì)1/T（方程式3）作圖，如圖7a 和7b?？赏ㄟ^(guò)曲線斜率和截距求出ΔH 和ΔS，再根據(jù)熱力學(xué)方程（方程式4）可求ΔG，熱力學(xué)參數(shù)列于表3。對(duì)于DADS，ΔH＞0，且ΔS＞0，說(shuō)明DADS 和G6PD 主要是通過(guò)疏水相互作用結(jié)合的；對(duì)于DATS，ΔH＜0，且ΔS＜0，說(shuō)明DATS 和G6PD 主要是通過(guò)氫鍵和范德華力結(jié)合的。ΔG 值均小于0，說(shuō)明DADS/DATS 與G6PD 相互作用都是自發(fā)進(jìn)行的。

表3 不同溫度下DADS/DATS 與G6PD作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interration between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

圖7 不同溫度下DADS（a）/DATS（b）與G6PD 相互作用的Van't Hoff 曲線Fig.7 Van't Hoff curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b） and G6PD at different temperatures

2.8 DADS/DATS 與G6PD 蛋白的分子對(duì)接

進(jìn)一步利用分子對(duì)接技術(shù)解釋DADS/DATS與G6PD 的相互作用機(jī)制。在對(duì)接結(jié)果中選擇結(jié)合能最低的構(gòu)象作為最優(yōu)，進(jìn)一步分析相互作用機(jī)制。結(jié)果表明DADS 和DATS 均可進(jìn)入G6PD分子內(nèi)部。其中DADS 與G6PD 結(jié)合能為-2.69 kcal/mol，結(jié)合性能較好，見(jiàn)表4。

表4 DADS/DATS 與G6PD 蛋白分子對(duì)接的結(jié)合能Table 4 The binding energies of the docking of DADS/DATS and G6PD

DADS 與G6PD 結(jié)合的3D 圖和2D 圖，如圖8a 和8b，揭示出DADS 與G6PD 蛋白結(jié)合位點(diǎn)周圍存在多個(gè)貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基。Ala-377、Val-376、Phe-216、Gly-222、Phe-221、Pro-223 等疏水性氨基酸殘基可通過(guò)疏水作用與DADS 結(jié)合，Arg-219、Asn-218、Lys-275、Arg-215、Trp-225等極性氨基酸殘基可通過(guò)靜電吸引與DADS 結(jié)合。

圖8c 和8d 分別是DATS 與G6PD 結(jié)合的3D圖和2D 圖。同樣地，Phe-253、Gly-254、Ala-335、Ile-472、Ile-255、Leu-469、Leu-305 等疏水性氨基酸殘基與Arg-175、Lys-476、Arg-257、Thr-334、Thr-333、Glu-473 等極性氨基酸殘基，分別對(duì)DATS 形成疏水作用和靜電吸引；且Phe235 還可與DATS 中心位置的S 形成氫鍵，鍵長(zhǎng)為3.2?，作用力以氫鍵為主。這些結(jié)果與熱力學(xué)分析表明的DADS/DATS 和G6PD 相互作用的結(jié)論相吻合。因此，DADS 與G6PD 通過(guò)疏水作用和靜電吸引等方式實(shí)現(xiàn)相互作用的，以疏水相互作用為主；DATS與G6PD 通過(guò)疏水作用、靜電吸引、氫鍵等方式實(shí)現(xiàn)相互作用，以氫鍵為主，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DADS/DATS對(duì)G6PD 活性的抑制。

圖8 DADS 和DATS 分別與G6PD 相互作用的分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking of G6PD interacted with DADS and DATS

3 結(jié)論

本研究從大蒜中提取了大蒜油并通過(guò)酶活實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、酶動(dòng)力學(xué)分析、熒光光譜法以及分子對(duì)接等技術(shù)研究了DADS/DATS 與G6PD 蛋白的相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，DADS/DATS 均可部分抑制G6PD 的活性，且該抑制作用屬于混合性抑制；DADS/DATS 均可使G6PD 蛋白產(chǎn)生內(nèi)源熒光淬滅，且為靜態(tài)淬滅；分子熒光光譜和3D/2D 分子對(duì)接技術(shù)共同揭示了DADS 與G6PD 以疏水作用和靜電力相互作用，且以疏水作用為主，DATS 與G6PD 蛋白以疏水作用、靜電力和氫鍵相互作用，且以氫鍵為主。