張 珂，周倩倩，畢景然，3，郝洪順，侯紅漫，3，張公亮，3*

（1 大連工業(yè)大學食品學院 遼寧大連 116034 2 大連工業(yè)大學紡織與材料工程學院 遼寧大連 116034 3 遼寧省水產品加工質量安全與控制重點實驗室 遼寧大連 116034）

近年來，由微生物引起的食物中毒越來越多，引起人們對食品安全問題的高度重視。一直以來都在使用抗生素治療食源性食物中毒，使細菌產生了耐藥性，作用效果明顯降低[1]。亟需利用天然物質來預防和控制食源性致病菌的污染和傳播。含硫香料是一種天然食品添加劑，常見于十字花科植物，具有食用安全、閾值低、特征性強等特點，并具有抗癌、抗菌等活性。硫醚類香料是含硫香料的一種，常見于蔥屬植物，化學通式為R-S-R。大蒜是一種公認的功能性食品，攝入大蒜被證實可通過降低癌癥風險等改善人類健康，且大蒜中的一些成分具有抗血栓、預防心血管疾病、抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[2-3]。大蒜不僅可作為食物，還具有多種活性成分，得到廣泛應用[4-5]。大蒜油的蒸餾產物中含有多種硫醚類化合物，如二烯丙基硫醚（DAS）、烯丙基三硫醚（DATS）、二烯丙基二硫醚（DADS）等[4，6-7]。

沙門氏菌（Salmonella）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是兩種典型的革蘭氏陰性食源性致病菌。沙門氏菌常見于肉類，也存在于新鮮的水果蔬菜中，甚至可在土壤、糞便、水等環(huán)境中存活很久，它所引起的食物中毒在微生物性食物中毒中占很大比例[8-11]。副溶血性弧菌中等嗜鹽，主要呈弧狀、短棒狀等，常見于水產品及沿海環(huán)境中，與海鮮有關的細菌性腸胃炎主要是由副溶血弧菌直接或交叉污染引起的[12-13]。tdh 基因是副溶血性弧菌重要的毒力基因之一，它編碼耐熱性溶血毒素（TDH），從而溶解紅細胞，產生神奈川現(xiàn)象，是判斷副溶血性弧菌是否具有致病性的依據(jù)，可使菌體具有耐熱性并引起腹瀉等一系列癥狀[14-15]。鑒于此，有必要采取各種措施來減少沙門氏菌和副溶血性弧菌的污染。學者們發(fā)現(xiàn)，肉桂醛、香榧殼精油以及二氫楊梅素等天然物質可以抑制沙門氏菌和副溶血性弧菌[16-17]，異硫氰酸酯類香料也對這兩種菌有一定抑制作用[18]，異硫氰酸芐酯（BITC）可以通過對毒力基因的調控來抑制這兩種菌的毒性[19-20]。目前尚無硫醚類香料對沙門氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用的研究。

本研究根據(jù)GB 2760-2014 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準，從中選取較常見的10種硫醚類香料，從抑菌活性、最小抑菌濃度、生長曲線等多個方面分別研究它們對于沙門氏菌以及副溶血性弧菌兩種食源性致病菌的抑菌作用，并通過對比它們對這兩種菌抑制作用的不同，探討硫醚類香料結構對其的抑菌效果，從而篩選抑菌效果最好的香料。通過qRT-PCR 試驗，研究硫醚類香料作用下，副溶血性弧菌tdh 毒力基因的表達量差異，為天然含硫香料應用于食源性致病菌的防治以及作為食品用抑菌劑提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 硫醚類香料

選出10 種硫醚類香料（表1），均購自美國Sigma 公司。

表1 10 種硫醚類香料的名稱及結構Table 1 Name and structure of 10 kinds of sulfide flavors

1.2 菌種及試劑

鼠傷寒沙門氏菌株（Salmonella，ATCC 14028），副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CGMCC 1.1614），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

RNA 提取試劑盒、溶菌酶、蛋白酶K、溴化乙錠（EB）等，北京天根生化有限公司；DNA Marker、6×Loading Buffer、5×M-MLV Buffer、RTase MMLV（RNase H-）、RNase Inhibitor、dNTP Mixture等，寶生物工程（大連）有限公司；DEPC Water、50×TAE、RNase-freeWater 等，生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、牛肉膏等，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3 儀器及設備

YC-L 型層析實驗冷柜，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；ZHJH-C1112C 型超凈工作臺、ZHWY-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；01J2003-04 型高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；MyiQTM2 型熒光定量PCR 儀，美國BIO-RAD 公司；UV-1750 型紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；202-OAB 型電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.4 樣品處理及菌種活化

利用硫醚類香料的原液密度和分子質量，求出稀釋所需的無水乙醇，并稀釋成濃度為5 mol/L的預混液備用。

于液體培養(yǎng)基中添加適量冷凍保存的菌種，并在37 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h。用上述菌液涂布平板，再次活化培養(yǎng)制成108CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.5 抑菌活性的測定

根據(jù)張公亮等[21]采用的濾紙片法，取100 μL菌懸液涂布平板，平板中央放置直徑10 mm 的圓形濾紙片，滴加用乙醇稀釋好的不同濃度的硫醚類香料，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。陰性對照滴加同等體積的無水乙醇，重復3 次并取平均值。

1.6 最小抑菌濃度（MIC）的測定

根據(jù)1.5 節(jié)的試驗結果，以二烯丙基二硫醚（DADS）為研究對象，利用倍比肉湯稀釋法[22]，用乙醇將該香料從5 mol/L 稀釋到0.61 mmol/L，將不同濃度的香料、菌懸液按照一定比例分別加入到試管裝液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)好的液體進行涂板培養(yǎng)并觀察，陽性（+）表示培養(yǎng)基上有菌生長，陰性（-）則無菌生長。MIC 即為無細菌生長的最小含硫香料濃度。試驗重復3 次。

1.7 生長曲線的測定

向液體培養(yǎng)基中加入1 mL 濃度為108CFU/mL 的菌液及不同濃度的DADS，于37 ℃搖床下振蕩培養(yǎng)，每2 h 測定其600 nm 下的吸光值，并以吸光值為縱坐標，以時間（h）為橫坐標繪制生長曲線。

1.8 細菌總RNA 的提取及檢測

根據(jù)天根生化有限公司細菌總RNA 提取試劑盒的方法[23]，提取經不同濃度香料處理12 h 后副溶血性弧菌的總RNA，并用分光光度計對RNA濃度及純度進行檢測。

1.9 qRT-PCR 法測定DADS 對副溶血性弧菌毒力基因表達的影響

目的基因為tdh，內參基因為16S rRNA，引物序列如表2所示，并由生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)試劑盒對RNA 進行反轉錄，并以總體系為25 μL 來進行qRT-PCR 反應，其中SYBRR Premix Ex TaqTM12.5 μL，引物對各0.5 μL，DEPC Water 9.5 μL，cDNA 模板2 μL。參數(shù)設置：95 ℃1 min；95 ℃20 s，62 ℃20 s，于80 ℃處停留15 s，收集熒光信號，循環(huán)40 次；在60～95 ℃范圍建立熔解曲線。通過2-⊿⊿CT計算tdh 基因相對表達量[24]。

表2 熒光定量PCR 基因引物序列Table 2 The primers for qPCR

1.10 統(tǒng)計學分析

利用http：//www.physics.csbsju.edu/stats/t-test.html 在線軟件進行student's t 檢驗進行顯著性分析，P＜0.05 具有顯著差異性，且P＜0.01 具有極顯著差異性。以平均值±標準偏差來呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 硫醚類香料對沙門氏菌和副溶血性弧菌的抑菌效果

10 種硫醚類香料，在結構上具備幾個特點。一部分為對稱性硫醚類香料，如二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）等，側鏈取代基及硫原子個數(shù)不同。還有一部分含有呋喃環(huán)，如2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）等。其中一些為同分異構體，如甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS），化學式均為C6H8OS2。

5 mol/L 的各硫醚類香料對兩種菌的抑制效果見表3?？梢钥闯?，甲基丙基二硫醚（MPDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、糠基異丙基硫醚（FIPS）、甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS）和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）這10 種硫醚類香料對副溶血性弧菌都有不同的抑制效果，而二甲基三硫醚（DMTS）、甲基2- 甲基-3- 呋喃基二硫醚（MMFDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）和對沙門氏菌不具備抑菌能力。副溶血性弧菌比沙門氏菌對上述硫醚類香料更加敏感。

表3 硫醚類香料對供試菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effect of sulfide flavors on the tested bacteria

2.2 硫醚類香料對沙門氏菌的抑制作用

圖1為5 種對沙門氏菌有抑菌效果的硫醚類香料的抑菌圈結果，包括MPDS、DADS、DAS、MFDS 和FIPS，它們的抑制作用大小為DADS＞MFDS＞（MPDS≈DAS≈FIPS）。其中DADS 的抑菌圈直徑最大，為（1.54±0.04）cm，即抑菌效果最好，其次是直徑為（1.36±0.08）cm 的MFDS，而剩下的3 種硫化物MPDS、DAS 和FIPS 抑菌圈直徑幾乎相同。DADS 的抑菌活性比MPDS、DAS 顯著增高（P＜0.05），DADS 與MPDS 相比，多了兩個烯丙基，DADS 與DAS 相比，多了一個硫原子，可見硫醚類香料對沙門氏菌抑菌作用受到硫原子個數(shù)和烯丙基的影響。且含有呋喃基的對稱性硫醚類香料，如BMFDS 對沙門氏菌沒有抑制效果。

圖1 硫醚類香料對沙門氏菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of thioether spices on Salmonella

2.3 硫醚類香料對副溶血性弧菌的抑制作用

圖2為10 種對副溶血性弧菌有抑菌效果的硫醚類香料的抑菌圈。與沙門氏菌相比，有抑菌效果的香料種類更多，且抑菌效果各不相同，其中，DADS、DAS、DPDS、MFDS、FIPS 和BMFDS 對副溶血性弧菌有很好的抑制作用。與沙門氏菌結果一致，DADS 抑制效果最強（P＜0.05），抑菌圈直徑達到了（4.49±0.32）cm。與2.2 節(jié)的結果相比，硫醚類香料對副溶血性弧菌比對沙門氏菌的抑制效果更顯著。DADS 與DPDS 相比，-S-S-側鏈兩邊多了雙鍵，變?yōu)橄┍?。DADS 的抑菌活性最好，這說明雙鍵的存在增強了抑制效果。當同分異構體的MMFDS 和MFDS 兩者進行分析時，MFDS 的抑菌能力顯著強于MMFDS，反映出側鏈為糠基抑菌作用強于側鏈為呋喃基。

圖2 硫醚類香料對副溶血性弧菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of thioether spices on V.parahaemolyticus

2.4 二烯丙基二硫醚對兩種菌的MIC

表4為對沙門氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用都最強的二烯丙基二硫醚（DADS）對這兩種菌的最小抑菌濃度。從表4可以看出，當DADS 濃度大于19.5 mmol/L 時，對兩種菌都有很好的抑制作用，且沙門氏菌對DADS 的敏感程度低于副溶血性弧菌。DADS 對沙門氏菌的MIC 為19.5 mmol/L，對副溶血性弧菌的MIC 為4.88 mmol/L。

表4 二烯丙基二硫醚對供試菌的MICTable 4 Minimum concentration of diallyl disulfide on tested bacteria

2.5 二烯丙基二硫醚對兩種菌生長曲線的影響

測定二烯丙基二硫醚（DADS）對沙門氏菌和副溶血性弧菌生長曲線的影響。如圖3所示，空白組的沙門氏菌生長曲線呈S 型，而在MIC 濃度的DADS 作用下OD 值沒有明顯改變，即細菌幾乎不生長。當添加的DADS 濃度為1/2 MIC 時，很大一部分細菌無法生長，且延滯期較長。1/4 MIC 濃度下細菌與空白組差距很小，但仍有一部分細菌的生長受到抑制。綜上，沙門氏菌的生長受DADS 的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖3 DADS 對沙門氏菌生長曲線影響Fig.3 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of Salmonella

如圖4所示，與沙門氏菌生長曲線圖結果一致，與空白組相比，MIC 濃度的DADS 作用下，副溶血性弧菌的生長完全被抑制，當DADS 濃度為1/2 MIC 時，大部分菌的生長被抑制，當濃度逐漸

圖4 DADS 對副溶血性弧菌生長曲線影響Fig.4 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of V.parahaemolyticus

2.6 二烯丙基二硫醚對副溶血性弧菌tdh 毒力基因表達的影響

選取對副溶血性弧菌有明顯抑菌效果的DADS，分析經不同濃度DADS 作用后tdh 毒力基減小為1/4 MIC 時，菌的生長與空白組差異較小，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。因的表達量差異。結果如圖5所示，不同濃度DADS 處理過的副溶血性弧菌中tdh 的表達量不同，隨著DADS 濃度的增加，tdh 毒力基因的相對表達量逐漸降低，與DADS 濃度呈負相關。與空白組相比，1/64 MIC 濃度的DADS 作用后tdh 基因表達量有所降低，但無顯著性差異。而DADS 濃度以二倍遞增，當副溶血性弧菌被這些亞抑制濃度的DADS 作用后，毒力基因tdh 的表達量變化差異都極顯著，且當DADS 濃度為1/4MIC 時，tdh 毒力基因下調了4.4 倍。由此可知，二烯丙基二硫醚對副溶血性弧菌tdh 毒力基因的作用效果呈劑量依賴性。

圖5 二烯丙基二硫醚對副溶血性弧菌tdh 基因表達的影響Fig.5 Effect of DADS on expression of tdh gene in V.parahaemolyticus

3 結論

1）在10 種硫醚類香料中，5 種對沙門氏菌有很強的作用效果，全部10 種對副溶血性弧菌有很強的作用效果，證明沙門氏菌對硫醚類香料的敏感程度低于副溶血性弧菌。其中二烯丙基二硫醚（DADS）對兩種菌的抑菌作用都最強，表明硫原子個數(shù)、烯丙基等可以增強硫醚類香料的抑菌作用。

2）DADS 對沙門氏菌的MIC 為19.5 mmol/L，對副溶血性弧菌的MIC 為4.88 mmol/L，與上述結論一致，副溶血性弧菌對硫醚類香料更加敏感。且這兩種致病菌的生長受DADS 的影響呈現(xiàn)濃度依賴性。

3）在不同濃度DADS 的作用下，副溶血性弧菌的tdh 基因的表達量隨DADS 濃度增加而下調。其中DADS 濃度為1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC 時，tdh 毒力基因相對表達量變化均極顯著，通過抑制毒力基因的表達，從而抑制副溶血性弧菌的毒性。