楊琪琳，劉雙平，趙禹宗，孫海龍，毛 健*

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心 江蘇無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)（紹興）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 浙江紹興 312000 3 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司 浙江紹興 312000 4 江南大學(xué)江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心 江蘇無(wú)錫 214122 5 江南大學(xué)江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇無(wú)錫 214122）

黃酒，作為中華民族特有的酒種，是經(jīng)加曲和部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制成的發(fā)酵酒[1]。醇、醛、酯、酸等物質(zhì)豐富了黃酒酒體的醇厚性和典型性。β-苯乙醇，作為芳香醇的一種，是黃酒釀造過(guò)程中釀酒酵母代謝產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，在黃酒中含量為40～180 mg/L[2-3]，可賦予黃酒特有的醇香風(fēng)味，其含量較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生致醉性[4]。在以黃酒為主要原料的料酒等調(diào)味品中，β-苯乙醇具有提升食物香味的作用[5]，說(shuō)明β-苯乙醇在食品工業(yè)中具有十分重要的作用。

釀酒酵母合成β-苯乙醇是通過(guò)莽草酸途徑和艾利希途徑的一系列酶催化[6]。艾利希途徑中，釀酒酵母可將底物L(fēng)-苯丙氨酸，通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的作用將其氨基轉(zhuǎn)移形成苯丙酮酸，然后通過(guò)脫羧酶的脫羧作用形成苯乙醛，最后再由脫氫酶催化還原成β-苯乙醇[7]，而另一條莽草酸代謝途徑中，由于反應(yīng)途徑復(fù)雜，存在多種抑制作用，導(dǎo)致β-苯乙醇產(chǎn)量很低[8]。近幾年來(lái)關(guān)于β-苯乙醇合成途徑中關(guān)鍵基因的作用研究較多[9-11]。福田等[12-14]比較了清酒酵母突變菌株和親本在β-苯乙醇合成途徑中的一系列酶的酶活變化，確定了突變菌種中引起β-苯乙醇產(chǎn)量提高的關(guān)鍵酶，進(jìn)一步研究了關(guān)鍵酶的相關(guān)基因，其中包括能夠引起β-苯乙醇高產(chǎn)的突變基因。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)黃酒酵母HJ01 預(yù)苯酸脫水酶PDT 的3 個(gè)堿基突變使其表現(xiàn)出較高的底物親和力、催化效率等。醇脫氫酶作為兩條途徑中關(guān)鍵酶，在同型酒精發(fā)酵過(guò)程中催化產(chǎn)乙醇[16]，在艾利希途徑中的最后催化雜醇醛（苯乙醛）脫羧形成β-苯乙醇[17-18]，在β-苯乙醇合成調(diào)控過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[19]。目前對(duì)于黃酒中β-苯乙醇的合成調(diào)控機(jī)理以及合成途徑中關(guān)鍵基因的研究較少[20]。

醇脫氫酶是黃酒酵母的β-苯乙醇合成調(diào)控的關(guān)鍵酶，探究黃酒酵母與釀酒酵母模式菌產(chǎn)的醇脫氫酶的差異性是必要的。本研究以工業(yè)生產(chǎn)菌株黃酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）HJ 和模式菌株釀酒酵母（S.cerevisiae）S288C 的醇脫氫酶I（Alcohol dehydrogenase I，Adh1p）為研究對(duì)象，基于同源建模分析其三維結(jié)構(gòu)的差異，通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)比研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期為黃酒酵母關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)以及酶學(xué)性質(zhì)分析提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C、黃酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） HJ、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、質(zhì)粒pESI-T 和pET-28a（+），均為本實(shí)驗(yàn)室保存。已獲得不含外源抗性基因且不能發(fā)生接合型轉(zhuǎn)變的黃酒酵母HJ 單倍體菌株[21]。

1.1.2 試劑 T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、Nde I 內(nèi)切酶、BamH I 內(nèi)切酶，美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司；DNA 凝膠電泳回收試劑盒（純化回收DNA 片段）、質(zhì)粒小量提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；酵母膏、蛋白胨、酸洗玻璃珠，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯乙醛、焦磷酸硫胺素、β-NADH、乙醇脫氫酶、咪唑、IPTG，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其它試劑均為分析純生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA pure 蛋白純化系統(tǒng)、His TrapTMHP（1 mL）色譜柱，美國(guó)GE 公司；三頭梯度PCR 儀，江蘇舜天國(guó)際集團(tuán)機(jī)械進(jìn)口股份有限公司；Amicon-Ultra-15 超濾管（15 mL，30 ku），美國(guó)Milipore 公司；超聲波破碎儀，美國(guó)SONICS&MATERIALS 公司；凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母基因組提取 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C 和黃酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） HJ 菌株在活化后，接種至酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD） 培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)過(guò)夜。在OD600nm達(dá)到2.0～3.0 時(shí)，離心收集菌體，參照趙宏宇等[22]用珠磨法提取酵母基因組。

1.3.2 醇脫氫酶Adh1p 氨基酸序列與三維結(jié)構(gòu)分析 使用蛋白質(zhì)同源建模在線服務(wù)器SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建醇脫氫酶Adh1p 的三維結(jié)構(gòu)模型，獲取同源建模數(shù)據(jù)。使用DNAMAN 工具進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析和引物設(shè)計(jì)。使用PyMOL 軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析，使用SnapGene 工具進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析。

1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)釀酒酵母 S288C 基因序列（NCBI Gene ID：854068）和黃酒酵母HJ的相應(yīng)醇脫氫酶基因ADH1 編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，該序列全長(zhǎng)為1 047 bp。上游引物序列：5’-GGGAATTCCATATGATGTCTATCCCAGAAACTCA-3’；下游引物序列：5’-GGATCCTTATTTAGAAGTGTCAACAA -3’。下劃線序列分別為NdeI和BamHI 的酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

利用NdeI 和BamHI 限制性內(nèi)切酶對(duì)pESIT-S288C-ADH1 和pESI-T-HJ-ADH1 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并回收目的基因產(chǎn)物。T4 連接酶將目的基因產(chǎn)物與pET-28a（+）空質(zhì)粒連接構(gòu)建pET-28a（+）-S288C-ADH1 和pET-28a（+）-HJ-ADH1 重組質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后做雙酶切驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞[23]。選取陽(yáng)性單克隆菌，在含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，將菌液送去蘇州金唯智生物科技公司測(cè)序鑒定，擴(kuò)培，于-80 ℃甘油管冷藏。

1.3.4 重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和粗酶液的獲取將保藏的陽(yáng)性克隆菌，分別接種到含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中（接種量1%），37 ℃170 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。將活化好的種子液取出，轉(zhuǎn)接于50 mL 含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL 卡那霉素的TB 液體培養(yǎng)基中（接種量5%），37 ℃170 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h，加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，降溫至25 ℃誘導(dǎo)12 h。

取菌液至無(wú)菌離心管中，4 ℃12 000 r/min 離心10 min 去上清，收集沉淀菌體，用0.2 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.5）洗滌2 次，吹打重懸菌體，冰浴條件下超聲波破碎（超聲條件：400 W，工作1 s，間隔2 s，總破碎時(shí)間30 min），破碎至菌液澄清透光。4 ℃12 000 r/min 離心20 min 收集上清，即粗酶液，留樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[24]。

1.3.5 蛋白親和層析純化 采用AKTA pure 儀器分離純化目的蛋白，流速為1 mL/min。結(jié)合緩沖液對(duì)鎳柱進(jìn)行平衡，上樣5 mL 的過(guò)膜粗酶液，10倍柱體積的洗脫緩沖液進(jìn)行線性洗脫，最后用結(jié)合緩沖液對(duì)鎳柱再次平衡。分別收集出峰處的蛋白，用SDS-PAGE 檢測(cè)洗脫蛋白的分子質(zhì)量大小和純度。將收集的洗脫液置于超濾管中4 ℃，4 000 r/min 離心30 min 脫鹽濃縮。蛋白含量檢測(cè)采用Bradford 法[25]。

1.4 醇脫氫酶Adh1p 的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.4.1 醇脫氫酶Adh1p 酶活測(cè)定與計(jì)算 用分光光度計(jì)測(cè)定輔酶NADH 在340 nm 處的吸光值變化值OD340nm[26]。反應(yīng)體系包括終濃度為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 7.5），0.35 mmol/L NADH，2 mmol/L 的底物和純酶。將無(wú)酶反應(yīng)體系在37 ℃孵育5 min，然后置于分光光度計(jì)中，讀數(shù)穩(wěn)定后立即加入純酶，開(kāi)始計(jì)數(shù)，反應(yīng)15 min，得到OD340nm，計(jì)算公式如下：

式中：V——反應(yīng)體系體積（mL）；OD340nm——吸光度差值；t——反應(yīng)時(shí)間（min）；ε——NADH的摩爾消光系數(shù)【6.22×103L/（mol·min）】；b——光程（cm）。

1 個(gè)酶活力單位（U） 定義為1 min 減少1 μmol 的輔酶NADH 所需的酶量。比酶活（U/g）定義為每克酶所具有的酶活力單位。

1.4.2 pH 值對(duì)醇脫氫酶Adh1p 酶活的影響及其穩(wěn)定性 配制不同pH 值的緩沖液：20 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.0～10.0）、20 mmol/L Tris-HC1 緩沖液（pH 8.0～9.0）、20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 3.0～8.0）。為研究pH值對(duì)醇脫氫酶Adh1p 酶活的影響，將底物苯乙醛置于不同pH 值的緩沖液反應(yīng)體系中，孵育5 min后立即加入40 μL（蛋白濃度調(diào)整至50 μg/mL）的純酶。Adh1pS288C最高的酶活力定義為100%，其對(duì)應(yīng)的pH 值為最適反應(yīng)pH 值。為研究醇脫氫酶Adh1p 的pH 值穩(wěn)定性，將純酶液孵育在不同pH值的緩沖液中1 h，測(cè)定相對(duì)酶活。Adh1pS288C最高的酶活力定義為100%，其對(duì)應(yīng)的pH 值為最穩(wěn)定pH 值。繪制重組醇脫氫酶Adh1p 的pH-相對(duì)酶活圖。

1.4.3 溫度對(duì)醇脫氫酶Adh1p 酶活的影響及其穩(wěn)定性 將含有底物苯乙醛的反應(yīng)體系在最適pH值下孵育5 min 后，在不同溫度（15，20，25，30，35，40，50，60，70 ℃） 條件下測(cè)定醇脫氫酶Adh1p的酶活。Adh1pS288C最高的酶活定義為100%，其對(duì)應(yīng)的溫度為最適反應(yīng)溫度。將重組醇脫氫酶Adh1p 酶液分別在不同的溫度（20，30，35，40，50，60，70 ℃）中孵育1 h，在最適反應(yīng)pH 值和溫度條件下測(cè)定殘余的相對(duì)酶活。Adh1pS288C最高的酶活定義為100%，其對(duì)應(yīng)的溫度為最穩(wěn)定溫度。繪制重組醇脫氫酶Adh1p 的溫度-相對(duì)酶活圖[27]。

1.4.4 醇脫氫酶Adh1p 的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 以0～5 mmol 的苯乙醛和乙醛為底物進(jìn)行酶學(xué)動(dòng)力學(xué)研究。使用Origin 軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合回歸[28]，利用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk）計(jì)算得Km，Vmax和kcat/Km。

1.4.5 外源添加末端產(chǎn)物對(duì)酶活的影響 以苯乙醛和乙醛為底物，分別在酶測(cè)體系中加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（0～20%）和苯乙醇（0～300 mg/L），測(cè)定酶活。未添加末端產(chǎn)物乙醇和苯乙醇的Adh1pS288C的酶活分別定義為100%。繪制重組醇脫氫酶Adh1p 的外源物質(zhì)-相對(duì)酶活圖。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

采用凝膠成像儀對(duì)電泳圖進(jìn)行分析。使用Origin 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇脫氫酶Adh1p 的氨基酸序列與同源建模結(jié)構(gòu)分析

將ADH1HJ的氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL 在線服務(wù)器，同源建模結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADH1HJ與釀酒酵母醇脫氫酶I（PDB：4W6Z） 的相似度達(dá)98.85%，與巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii）GS115 的線粒體醇脫氫酶同工酶III（PDB：5YAT）的相似度達(dá)72.91%。Raj 等[29]研究顯示酵母醇脫氫酶I（PDB：4W6Z）是由347 個(gè)氨基酸殘基組成的具有4 個(gè)背靠背亞基的同源四聚體。不對(duì)稱單位包含4 個(gè)不同的亞基，排列成相似的二聚體。如圖2a 所示，晶胞中含有兩種由"背靠背"二聚體組成的四聚體，四聚體二聚體亞基的不對(duì)稱性提供2 個(gè)似乎與催化機(jī)制相關(guān)的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中包括8個(gè)鋅離子，如圖1所示，即催化鋅結(jié)合殘基結(jié)合的活性位點(diǎn)殘基（Cys-43、Cys-153、His-66 和Glu-67），結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合殘基（Cys-97、Cys-100、Cys-103和Cys-111）。2，2，2-三氟乙醇的氧以經(jīng)典的四面體與Cys-43，Cys-153 和His-66 配位連接到催化鋅上。相反，具有開(kāi)放的構(gòu)象的亞基，沒(méi)有結(jié)合輔酶，催化鋅與Cys-43、Cys-153、His-66 和Glu-67的羧酸鹽具有交替的反向配位。通過(guò)調(diào)節(jié) Glu-67 與鋅的相互作用將會(huì)促進(jìn)水、醇和醛的配體交換。如圖2b 所示，棍狀結(jié)構(gòu)表示的Gly-177～Gly-183 和Val-268～Gly-Met-270 為輔酶NAD，Asn-31～Ala-136 為酵母醇脫氫酶I 結(jié)構(gòu)N 端，Gly-181～Ala-309 為酵母醇脫氫酶I 結(jié)構(gòu)C 端。底物結(jié)合位點(diǎn)如圖2c 所示。幾個(gè)大的疏水殘基Trp-55、Trp-93、Met-271 和Tyr-295 產(chǎn)生1 個(gè)空腔可容納底物，預(yù)測(cè)可能為黃酒酵母醇脫氫酶Adh1pHJ的底物的結(jié)合區(qū)域。將氨基酸序列輸入DNAMAN中進(jìn)行同源序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ADH1HJ和4W6Z（ADH1S288C）氨基酸序列在位點(diǎn)58（V-T），127（QE），147（Q-E），151（I-V）處共有4 個(gè)氨基酸有差異。醇脫氫酶的每個(gè)亞基都由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（又稱生物有機(jī)催化結(jié)構(gòu)域）和催化活性結(jié)構(gòu)域（又稱生物無(wú)機(jī)催化結(jié)構(gòu)域），輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有Rossnman 折疊，能通過(guò)氨基酸殘基上的官能團(tuán)與輔酶相互作用而使輔酶（NAD+/NADH）結(jié)合在醇脫氫酶上。催化活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的催化活性Zn2+能與許多底物相結(jié)合，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域大小不等，催化活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)占整個(gè)肽鏈的60%，輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域占40%[30]。Mlejnek等[31]發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基序列的143～283 為輔酶結(jié)合區(qū)域，氨基酸殘基序列的1～142 和284～336 為催化活性區(qū)域。結(jié)合Zhang 等[32]對(duì)巴斯德畢赤酵母GS115 的線粒體醇脫氫酶同工酶III KpADH3（PDB：5YAT）研究，預(yù)測(cè)差異氨基酸可能位于催化活性區(qū)域，這可能會(huì)導(dǎo)致醇脫氫酶Adh1p 的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。

圖1 氨基酸序列對(duì)比圖Fig.1 Comparison of amino acid sequences

圖2 三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.2 3D structure simulation

2.2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

以黃酒酵母HJ 和釀酒酵母S288C 的cDNA為模板，設(shè)置引物后擴(kuò)增目的基因片段，并在該基因的5’端和3’端分別引入酶切位點(diǎn)BamH I 和Nde I。經(jīng)TA 克隆后，命名為pESI-ADH1HJ和pESI-ADH1S288C。經(jīng)菌落PCR 篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3a。通過(guò)對(duì)pESI-ADH1HJ和pESIADH1S288C與pET28a 空載質(zhì)粒酶切和膠回收，連接和轉(zhuǎn)化等步驟獲得重組質(zhì)粒，將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）后，此基因工程菌命名為pET-28a（+）-ADH1HJ和pET-28a（+）-ADH1S288C。構(gòu)建過(guò)程中酶切驗(yàn)證的電泳鑒定結(jié)果如圖3b 所示，重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切后在5 000 bp 和1 000 bp 附近均出現(xiàn)單一條帶，其中5 000 bp 附近為載體pET-28a 條帶，1 000 bp 附近為目的基因條帶，經(jīng)蘇州金唯智生物科技公司測(cè)序鑒定為目的基因，表明該重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，符合預(yù)期。pET-28a（+）-ADH1HJ質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖4，目的基因ADH1 兩段為酶切位點(diǎn)BamH I 和Nde I，pET-28a（+）-ADH1HJ全長(zhǎng)為6 383 bp。

圖3 重組質(zhì)粒電泳驗(yàn)證圖Fig.3 Electrophoretic verification map of recombinant plasmid

圖4 pET-28a（+）-ADH1HJ 質(zhì)粒圖譜Fig.4 Plasmid map of pET-28a（+）-ADH1HJ

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

重組菌株的ADH1 基因編碼341 個(gè)氨基酸，醇脫氫酶Adh1p 的分子質(zhì)量約36.8 ku，重組表達(dá)載體實(shí)際表達(dá)為42.6 ku。粗酶液SDS-PAGE 結(jié)果如圖5所示，在43 ku 處有特征條帶出現(xiàn)，與預(yù)期設(shè)計(jì)蛋白分子質(zhì)量一致，而對(duì)照無(wú)此條帶，說(shuō)明重組工程菌表達(dá)醇脫氫酶Adh1p 成功。

圖5 粗酶液蛋白電泳圖Fig.5 Protein electrophoresis of crude enzyme solution

預(yù)處理后通過(guò)親和層析鎳柱分離純化目的蛋白，得到純化色譜峰圖6a，記錄AKTA Pure 儀器上出峰位置所在的收集管，結(jié)果顯示線性洗脫在約20%處，即100 mmol/L 咪唑的磷酸鹽緩沖液開(kāi)始出現(xiàn)單一色譜峰，進(jìn)一步對(duì)純化后的酶液進(jìn)行超濾，離心濃縮溶于水中，調(diào)整蛋白濃度后SDSPAGE 結(jié)果顯示Adh1pS288C和Adh1pHJ純酶液在42.6 ku 處有單一條帶，確認(rèn)為目的條帶。

圖6 酶液純化過(guò)程圖Fig.6 Purification process of enzyme solution

2.4 醇脫氫酶Adh1p 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 醇脫氫酶Adh1p 的最適反應(yīng)pH 值和穩(wěn)定性 試驗(yàn)結(jié)果表明，Adh1p 的最適反應(yīng)pH 值為7.5，結(jié)果如圖7a 所示，在pH 3.0～7.5 范圍，酶活隨著pH 值的升高而提高，當(dāng)pH 值大于7.5，酶活逐漸減弱。Adh1p 的最穩(wěn)定pH 值為7.5。圖7b 表明醇脫氫酶Adh1p 在pH 7.5～8.0 范圍孵育1 h后，仍剩余80%以上的酶活，且Adh1pHJ酶活相對(duì)略高于Adh1pS288C；在pH 3.0～5.0 的緩沖液中孵育2 h 后，剩余酶活不足40%，說(shuō)明醇脫氫酶Adh1p在中性pH 值的條件下比較穩(wěn)定。

圖7 醇脫氫酶的最適pH 值和pH 值穩(wěn)定性Fig.7 Optimum pH and pH stability of alcohol dehydrogenase

2.4.2 醇脫氫酶Adh1p 的最適反應(yīng)溫度和穩(wěn)定性 試驗(yàn)結(jié)果表明，Adh1p 的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，Adh1pHJ的酶活（231.51 U/g）比Adh1pS288C（203.48 U/g）高13.79%。結(jié)果如圖8a 所示，15～40 ℃范圍，酶活隨溫度的升高而提高，當(dāng)溫度高于40 ℃，酶活下降較快。Adh1p 的最穩(wěn)定溫度為30 ℃。圖8b表明醇脫氫酶Adh1p 在20～35 ℃條件下孵育1 h后，仍剩余80%以上的酶活，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，酶活下降迅速；當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，剩余酶活不足30%。

圖8 不同溫度下Adh1p 酶活以及穩(wěn)定性分析圖Fig.8 Activity and stability of Adh1p at different temperatures

2.5 醇脫氫酶Adh1p 的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析

分別以0～5 mmol/L 的苯乙醛和乙醛為底物，測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，以底物濃度[S]為X 軸，速度v 為Y 軸進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果如圖9所示。隨著底物濃度的增加，醇脫氫酶Adh1p 被飽和。進(jìn)而對(duì)Adh1pHJ和Adh1pS288C的酶促動(dòng)力學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖10所示。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得米氏方程，最終獲得Km、Vmax和kcat/Km值。如表1所示：以苯乙醛為底物時(shí)，Adh1pS288C的特征性常數(shù)Km值（0.759 μmol/L）比Adh1pHJ的Km值（0.524 μmol/L）大，說(shuō)明Adh1pHJ與底物苯乙醛的親和力相對(duì)于Adh1pS288C較大。Adh1pHJ的Vmax值【299.40 μmol/（min·g）】 比Adh1pS288C的Vmax值 【289.86 μmol/（min·g）】略高，且Adh1pHJ的kcat/Km值【0.406 L/（μmol·min）】表現(xiàn)為較大，說(shuō)明在同一底物苯乙醛的條件下，Adh1pHJ的催化效率比Adh1pS288C高。而以乙醛為底物時(shí)，Adh1pS288C的Km值（0.741 μmol/L），比Adh1pHJ的Km值（0.895 μmol/L）小，說(shuō)明Adh1pS288C與底物乙醛的親和力比Adh1pHJ大。Adh1pHJ的Vmax值 【363.64 μmol/（min·g）】和kcat/Km值【0.289 L/（μmol·min）】略比Adh1pS288C的Vmax值低，說(shuō)明在同一底物乙醛的條件下，Adh1pHJ的催化效率低于Adh1pS288C。

圖9 底物與醇脫氫酶Adh1p 反應(yīng)速度的非線性擬合回歸圖Fig.9 Non-linear regression of substrate and reaction rate of Adh1p

圖10 酵母模式菌株和黃酒酵母菌株中Adh1p 1/[S]-1/v 關(guān)系圖Fig.10 Relationship between Adh1p 1/[S]-1/v

表1 Adh1p 酶學(xué)參數(shù)分析Table 1 Analysis of Adh1p enzymatic parameters

2.6 外源添加末端產(chǎn)物乙醇和β-苯乙醇對(duì)醇脫氫酶Adh1p 的酶活的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖11a 所示，通過(guò)外源添加0～300 mg/L β-苯乙醇，醇脫氫酶Adh1p 對(duì)底物乙醛的脫羧反應(yīng)仍保持高催化活性，且其在0～200 mg/L 質(zhì)量濃度范圍隨β-苯乙醇的添加量而增加，Adh1pHJ的相對(duì)酶活比Adh1pS288C的相對(duì)酶活顯著高，相比之下，黃酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受β-苯乙醇的能力相對(duì)來(lái)說(shuō)高于酵母模式Adh1pS288C。而外源添加體積分?jǐn)?shù)0～20%的乙醇，隨體積分?jǐn)?shù)的上升，醇脫氫酶對(duì)底物苯乙醛的脫羧反應(yīng)的催化活性下降，在添加20%乙醇條件下，Adh1pS288C的相對(duì)酶活剩余57.99%，Adh1pHJ的相對(duì)酶活雖有所下降，但仍剩余82.21%。相比之下，黃酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受乙醇的能力相對(duì)高于釀酒酵母Adh1pS288C。

圖11 外源添加末端產(chǎn)物對(duì)醇脫氫酶Adh1p 酶活的影響Fig.11 Effect of exogenous end products on enzyme activity of Adh1p

3 結(jié)論

醇脫氫酶Adh1p 作為酵母合成β-苯乙醇的艾利希途徑的最后一步的酶，催化雜醇醛還原成雜醇，是生物體內(nèi)不可缺少的關(guān)鍵酶[33]。本研究發(fā)現(xiàn)工業(yè)菌株黃酒酵母HJ 和釀酒酵母S288C 的醇脫氫酶Adh1p 在催化活性區(qū)域具有4 位氨基酸差異，因此研究其酶學(xué)性質(zhì)是必要的。通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體，利用IPTG 誘導(dǎo)，大量表達(dá)目的蛋白[34-35]。通過(guò)親和柱層析手段對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，得到高純度的Adh1p。對(duì)純化后的釀酒酵母模式菌株S288C 的Adh1pS288C和黃酒酵母菌株HJ 的Adh1pHJ的穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及末端代謝產(chǎn)物對(duì)酶活的影響進(jìn)行分析，結(jié)果表明：醇脫氫酶Adh1p 的最適反應(yīng)pH 7.5，最適反應(yīng)溫度40 ℃。在最適條件下，Adh1pHJ的酶活（231.51 U/g）比Adh1pS288C（203.48 U/g）高約13.79%。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，以苯乙醛為底物時(shí)，Adh1pHJ與底物苯乙醛的親和力大于Adh1pS288C，且Adh1pHJ的催化效率也較大。而以乙醛為底物時(shí)，Adh1pS288C與底物乙醛的親和力和催化效率較小。外源添加0～300 mg/L β-苯乙醇的情況下，醇脫氫酶對(duì)底物乙醛的脫羧反應(yīng)仍保持高催化活性，且黃酒酵母菌株的Adh1pHJ耐受β-苯乙醇的能力相對(duì)來(lái)說(shuō)高于酵母模式Adh1pS288C，而對(duì)底物苯乙醛的脫羧反應(yīng)，乙醇抑制一定的酶活，其中黃酒酵母菌株Adh1pHJ耐受乙醇的能力相對(duì)高于酵母模式Adh1pS288C。這些差異很可能是黃酒酵母醇脫氫酶Adh1pHJ的氨基酸差異導(dǎo)致酶催化能力的改變，進(jìn)而影響黃酒酵母中β-苯乙醇的合成。酵母細(xì)胞內(nèi)的Ehrlich 途徑的前兩步L-苯丙氨酸通過(guò)脫氨基作用形成苯丙酮酸，進(jìn)而脫羧生成相應(yīng)苯乙醛，然后經(jīng)還原反應(yīng)形成β-苯乙醇。該途徑的前兩步反應(yīng)的機(jī)制已基本清楚[8，36]。本文研究醇脫氫酶Adh1p 相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，為探究黃酒酵母的β-苯乙醇的合成途徑關(guān)鍵酶和編碼基因以及合成調(diào)控機(jī)制提供靶點(diǎn)。