王 葳,牟嘉斌,王環(huán)茹,房方皓,朱奕奕,滕 崢

登革熱是由登革病毒(dengue virus,DENV)經(jīng)伊蚊叮咬傳播引起的急性傳染病。典型的臨床表現(xiàn)包括高熱、頭痛、皮疹、全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)疼痛等,少數(shù)患者可發(fā)展為重癥登革熱,造成嚴(yán)重出血、休克、嚴(yán)重臟器損傷等后果[1]。過去50年,隨著人口迅速增長、氣候環(huán)境急劇變化、城市化進(jìn)程的推進(jìn)、全球貿(mào)易與流通加速發(fā)展等因素影響,登革熱在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率激增了近30倍,已在全球129個國家和地區(qū)呈地方性流行[2]。據(jù)世衛(wèi)組織估計,全球每年約有3.9億例登革熱病例發(fā)生[3],將近39億人面臨著登革病毒感染風(fēng)險。登革熱已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題,并造成了重大的疾病負(fù)擔(dān),2019年,登革熱在全球廣泛暴發(fā),世衛(wèi)組織將登革熱列為全球十大健康威脅之一。

登革病毒屬黃病毒科黃病毒屬,基因組為單股正鏈RNA,全長約11 kb,兩端為非編碼區(qū),內(nèi)部的編碼區(qū)(Coding sequence,CDS)依次編碼3 種結(jié)構(gòu)蛋白(C、pr M/M 和E)和7 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5)[4]。根據(jù)包膜蛋白E可把DENV 分為4種血清型,分別為登革1 型 至4 型(DENV-1,DENV-2,DENV-3,DENV-4)[5],各血清型內(nèi)又根據(jù)核苷酸序列差異進(jìn)一步細(xì)分為多種基因型。

上海市的登革熱疫情主要傳染源為來自境外疫區(qū)的輸入性病例,近年來受境外疫情暴發(fā)趨勢影響,我市報告的輸入性登革熱病例數(shù)逐年增多,2017年經(jīng)本中心實(shí)驗(yàn)室確認(rèn),報告了上海市首例本地感染病例,2018年又報告3例本地感染病例,血清型均為DENV-1型,登革熱疫情防控形勢正日趨嚴(yán)峻。本研究通過收集2018－2020年上海市哨點(diǎn)醫(yī)院登革熱疑似病例血清樣本,篩選出DENV-1核酸陽性樣本,進(jìn)行病毒分離、全基因組擴(kuò)增與測序,通過構(gòu)建進(jìn)化樹對分離株全基因組序列進(jìn)行同源性分析、核苷酸序列與氨基酸序列相似性分析、編碼蛋白氨基酸位點(diǎn)差異分析,掌握我市輸入性與本地來源病例DENV-1全基因組序列特征,為我市登革熱疫情防控及相關(guān)策略制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及相關(guān)定義 樣本來源為,2018－2020年上海市哨點(diǎn)醫(yī)院采集的符合?登革熱診斷?(WS216-2018)標(biāo)準(zhǔn)的登革熱疑似病例血清樣本。本地感染病例:發(fā)病前14 日內(nèi)未離開過所在縣(區(qū)),或未到過有登革熱疫情報告的地區(qū),其感染地點(diǎn)位于報告地區(qū)。境內(nèi)輸入病例:發(fā)病前14日內(nèi)離開本縣(區(qū)),到過本縣(區(qū))外的境內(nèi)登革熱流行地區(qū)的病例。境外輸入病例:發(fā)病前14日內(nèi)到過登革熱流行的國家或地區(qū)的病例。

1.2 樣本初篩與病毒分離 使用全自動核酸抽提儀及配套試劑盒(江蘇碩世生物科技股份有限公司)對登革熱疑似病例血清樣本進(jìn)行核酸抽提,采用熒光定量PCR 試劑盒(江蘇碩世生物科技股份有限公司)對抽提的核酸進(jìn)行登革病毒檢測與分型,篩選出DENV-1核酸陽性樣本。取陽性樣本100μL,用細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)按1∶10 比例稀釋,接種于單層Vero-SLAM 細(xì)胞,置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng),每日在鏡下觀察細(xì)胞病變情況,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行核酸抽提與DENV-1鑒定,連續(xù)傳代3次。

1.3 全基因組擴(kuò)增與測序 針對DENV-1全基因組保守序列設(shè)計引物(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,使用一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(invitrogen)對分離株核酸進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系按說明書,反應(yīng)條件為:55 ℃30 min,94 ℃2 min;94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1.5 min,40個循環(huán);72 ℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。全基因組核苷酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得序列號。

表1 DENV-1全基因組擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for whole genome amplification of DENV-1

表1 (續(xù))

1.4 進(jìn)化樹構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取32條覆蓋DENV-1 5種基因型(I-V)及代表株的全基因組序列作為參考序列(表2)。使用MEGA 7軟件,選擇Kimura 2-parameter模型計算核苷酸序列之間的遺傳距離并進(jìn)行相似性分析,進(jìn)一步選擇Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹,Bootstrap重復(fù)設(shè)定為1 000。

表2 DENV-1全基因組參考序列Tab.2 Reference strains of DENV-1

2 結(jié)果

2.1 病毒分離及全基因組擴(kuò)增與測序 通過對2018－2020年上海市收集的登革熱疑似病例樣本進(jìn)行初篩,共篩選出DENV-1陽性樣本88份,接種Vero-SLAM 細(xì)胞后,成功獲得37株分離株。對分離株核酸進(jìn)行抽提,并針對DENV-1全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序,成功得到其中31株分離株的全基因組核苷酸序列(表3)。這31株分離株的年度分布為:6株來自2018年收集的樣本,24株來自2019年,1株來自2020年。病例來源為:3株本地感染病例來源,1株境內(nèi)輸入病例來源,輸入地為廣東省,27株境外輸入病例來源。全長為10 734～10 736 nt,長度差異分布在3′UTR 或5′UTR,編碼區(qū)長度均一致,為10 179 nt。

表3 2018—2020年上海市DENV-1分離株信息Tab.3 Information on stains isolated from dengue fever cases in Shanghai during 2018－2020

2.2 核苷酸序列進(jìn)化樹構(gòu)建 將31株分離株全基因組核苷酸序列與32條DENV-1全基因組核苷酸參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹,3株分離株的基因型為G-IV型,28株分離株的基因型為G-I型(圖1),3株本地感染病例來源分離株均為G-I型。

圖1 2018－2020年上海市DENV-1全基因組核苷酸序列進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on whole genomes of DENV-1 isolates

通過親緣關(guān)系對分離株所在分支歸類,3株GIV 型分離株集中在同一分支中,與2016年菲律賓參考序列(LC128301/Philippines/2016)及2001 年夏威夷參考序列(DQ672564/USA:Hawaii/2001)親緣關(guān)系最近;28株G-I型分離株按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近又可進(jìn)一步細(xì)分為4簇分支:包含本地感染病例來源的OM281570/038/SH/2018(以下用分離株名稱038/SH/2018表示,下同)在內(nèi),共有18 株分離株集中在2015年柬埔寨參考序列(MW265679/Cambodia/2015)所在分支,占總數(shù)31 條分離株的58.06%;另外2 株本地感染病例來源的分離株042/SH/2018 與045/SH/2018,集中在2013 年 新加坡參考序列(MF033208/Singapore/2013)、2014年馬來西亞參考序列(KX452058/Malaysia/2014)所在分支;2 株分離株與2014 年新加坡參考序列(KX224261/Singapore/2014)、2012年印度尼西亞參考序列(KY057370/Indonesia/2012)親緣關(guān)系最近;6株分離株集中在2017年中國云南省參考序列(MF681692/China:YN/2017)、2016年新加坡參考序列(MF033260/Singapore/2016)所在分支。

選取編碼區(qū)(CDS)、3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、pr M/M、E)與7 個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)對應(yīng)的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示CDS、E、NS1、NS4B 基因構(gòu)建的進(jìn)化樹中,31株分離株的基因分型及所在親緣關(guān)系最近的分支與全基因組核苷酸序列進(jìn)化樹相同(圖2)。

圖2 DENV-1編碼區(qū)、E基因、NS1基因、NS4B基因序列進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on genes of CDS,E,NS1 and NS4B

2.3 核苷酸及氨基酸相似性分析 分析31株分離株全基因組序列與參考序列的核苷酸相似性以及編碼區(qū)編碼的氨基酸相似性(表4)。3株G-IV 型分離株與株G-IV 型參考序列的核苷酸(氨基酸)相似性均值為96.66%～96.86%(99.01%～99.26%),與其他基因型DENV-1參考序列的核苷酸(氨基酸)相似性均值在91.17%～91.64% (97.46%～97.61%)。

表4 核苷酸及氨基酸相似性分析Tab.4 Nucleotide and amino acid sequence identities

28株G-I型分離株與G-I型參考序列的核苷酸(氨基酸)相似性均值為96.47%～97.37%(98.78%～99.16%);與其他基因型DENV-1參考序列的核苷酸(氨基酸)相似性均值在92.67%～92.85%(97.10%～97.44%)。本地感染病例來源的038/SH/2018與MW265679/Cambodia/2015親緣關(guān)系最近,核苷酸(氨基酸)相似性為99.44%(99.67%);另兩株本地感染病例來源的分離株042/SH/2018與045/SH/2018 相互之間的核苷酸相似性為100%,與MF033208/Singapore/2013 親緣關(guān)系最近,核苷酸(氨基酸)相似性均為99.53%(99.82%)。

2.4 氨基酸位點(diǎn)差異分析 以DENV-1 原型株(EU848545/USA:Hawaii/1944)作為對照株分析31株分離株各蛋白氨基酸序列差異。3個結(jié)構(gòu)蛋白與7個非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列均存在差異,其中NS2A 蛋白差異率最大,13.76%的氨基酸序列存在差異,其他蛋白的差異率在2.81%～10.00%。

重點(diǎn)分析E 蛋白氨基酸位點(diǎn)差異,與原型株對比,495個氨基酸殘基中,31個存在差異,差異率為6.26%。我們按照全基因組核苷酸序列進(jìn)化分析,結(jié)果將31株分離株分為A-E 組(表5),分別存在16、21、17、16、17個差異位點(diǎn):7個變異位點(diǎn)(I161T、P227S、E234Q、K277T、N290D、L402F、A473T)在31株分離株均存在;此外,A 組(即G-IV株)存在的K52N、A88T、F96L、V139I、M297V、S338T、T339S、I378L、V436I 變異;N8S、T155S、S171T、V324I、V380I、I461V、M484L 在除A 組外的B-E組(即G-I株)中均存在;在此基礎(chǔ)上,B組還存 在 K52D、T81A、H149Y、H158Y、V300M、V312L、A386T 變異;C組存在K52N、S338L、V436I變異;D 組存在K52N、A88T 變異;E 組存在K52D、T346S、E362G 變異。

表5 E蛋白氨基酸位點(diǎn)差異分析Tab.5 Differences in sites of amino acid residues of the E protein between reference strain and isolates

3 討論

DENV-1是我國目前的優(yōu)勢血清型,2014年廣東省暴發(fā)的登革熱大流行,發(fā)病人數(shù)超過4.5萬人,流行株即為DENV-1[6]。上海作為全球最大的口岸城市之一,來自境外疫區(qū)的輸入性病例是我市登革熱疫情的主要傳染源,其中DENV-1占比超過其他血清型總和。2017年與2018年經(jīng)本中心實(shí)驗(yàn)室確認(rèn),分別報告了1例與3例上海市首例本地感染病例,血清型均為DENV-1 型。根據(jù)核苷酸序列差異,DENV-1 分為5 種基因型。G-I型主要在中國和東南亞國家流行,2014年廣州與佛山地區(qū)暴發(fā)疫情中即分離到G-I型流行株[7];G-II型、G-III型分別在泰國和馬來西亞等國家流行;G-IV 型主要在印度尼西亞、菲律賓等國家流行;G-V 型則主要于美洲國家[8]流行。隨著近年全球登革熱疫情的暴發(fā),登革病毒基因型的地區(qū)流行特點(diǎn)已更顯多元性與復(fù)雜性。

用于登革病毒基因分型的片段尚無標(biāo)準(zhǔn),既往研究中,登革病毒E基因被廣泛用于登革病毒的血清型與基因型分型,然而本研究中發(fā)現(xiàn),E 基因進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與全基因組序列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不完全一致,E基因進(jìn)化樹中的DENV-1參考序列未集中在相鄰分支中(圖2)。同時,依次構(gòu)建其他單基因進(jìn)化樹,均與全基因組進(jìn)化樹存在差異。因此,在病毒分子分型、進(jìn)化分析及選擇壓力等研究中,全基因組序列分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本研究分離得到的31株分離株中,3株為本地感染病例來源,于2018年8月由我市同一行政區(qū)報告。值得一提的是,2017年報告的首例本地感染病例由于樣本病毒載量過低,在本次實(shí)驗(yàn)中未能獲得有效序列信息,但流行病學(xué)資料顯示,該病例也來自同一行政區(qū)。全基因組進(jìn)化分析結(jié)果顯示,2018年的3株本地感染病例來源分離株均為G-I型:分離株038/SH/2018 在進(jìn)化樹中位于與MW265679/Cambodia/2015親緣關(guān)系最近的分支中,與鄰近時間報告的境外輸入病例分離株037/SH/2018高度同源,并與14株2018－2019年柬埔寨輸入病例來源的分離株集中在同一分支,提示該本地感染病例與柬埔寨輸入病例關(guān)聯(lián)性較大;另2株本地感染病例來源的分離株042/SH/2018與045/SH/2018報告時間鄰近,空間范圍接近,相互之間的核苷酸相似性為100%,提示這2例本地感染病例關(guān)聯(lián)性較大;同時,這2 株分離株在進(jìn)化樹中單獨(dú)集中于MF033208/Singapore/2013所在分支,與其他輸入性來源分離株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對,與數(shù)據(jù)庫中多株新加坡株高度同源,推測可能與新加坡輸入性病例有關(guān)。綜上,我們推測2018年我市報告的3例本地感染病例存在輸入性病例引起本地感染可能,且存在2個不同來源。在流行病學(xué)方面,對2018－2020年人群登革病毒IgG 水平進(jìn)行抽樣監(jiān)測,陽性率分別為2.50%、0.56%、2.54%,由于登革熱感染存在自限性,推測實(shí)際感染的人數(shù)可能超過報告人數(shù)。在傳播媒介方面,上海地處的氣候和生態(tài)條件適宜白紋伊蚊孳生[9],2018年本地感染病例所在疫點(diǎn)白紋伊蚊成蚊指數(shù)在處置前為3.50～4.67只/h,布雷圖指數(shù)BI為10～20[10],也為登革熱本地傳播提供了條件。截至目前,雖然上海市報告的本地病例較少,但病原學(xué)及流行病學(xué)研究均提示登革熱存在本地傳播的風(fēng)險。因此,在登革熱疫情防控工作中,應(yīng)推進(jìn)多部門聯(lián)動,及時發(fā)現(xiàn)與處置疫情,降低輸入性病例引起本地傳播的風(fēng)險。目前尚未在本地媒介生物樣本中檢測到登革病毒,一方面可能與采用的熒光定量PCR 檢測方法靈敏度較低有關(guān),另一方面,蚊蟲捕獲后,對分揀、保存、運(yùn)輸?shù)臈l件要求較高,不滿足相關(guān)條件,如未及時保存至液氮中,對病毒檢出率有較大影響。在進(jìn)一步工作中,將優(yōu)化蚊蟲的保存與運(yùn)輸流程,并探索宏基因組深度測序方法提升媒介生物樣本中的病毒檢出率。

28株為輸入性病例來源分離株,來源呈多樣性。3 株G-IV 型均為菲律賓輸入,集中在與LC128301/Philippines/2016親緣關(guān)系最近的分支中,與流行病學(xué)資料一致;其余25 株G-I型中,17株與MW265679/Cambodia/2015 親緣關(guān)系最近,其中14 株為柬埔寨輸入,1 株輸入地不詳,2 株(123/SH/2019、128/SH/2019)為其他地區(qū)輸入,但與3株柬埔寨輸入分離株(66/SH/2018、53/SH/2019、95/SH/2019)同源性為100%,分析應(yīng)為同一來源;6 株與MF033260/Singapore/2016 親緣關(guān)系最近,其中4 株為泰國輸入,推測當(dāng)?shù)亓餍兄昱cMF033260/Singapore/2016高度同源;2 株分別為馬爾代夫與柬埔寨輸入,與KX224261/Singapore/2014、KY057370/Indonesia/2012親緣關(guān)系最近?？梢?全基因組序列同源性分析結(jié)果將提供更多疫源地與流行株的信息,對病例提供的流行病學(xué)資料進(jìn)行補(bǔ)充,以對輸入性病例精準(zhǔn)溯源,對登革熱流行地提高預(yù)警等級,對途經(jīng)疫區(qū)的入境人員加強(qiáng)健康管理,將登革熱疫情防控做到關(guān)口前移。

包膜蛋白E 是登革病毒編碼的重要結(jié)構(gòu)蛋白,能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體,行使病毒與宿主細(xì)胞融合功能。E蛋白包含3個結(jié)構(gòu)域(Domain):Domain I(殘基1～52、133～193和281～296)組織E 蛋白結(jié)構(gòu),Domain II(殘基53～132和194～280)為與細(xì)胞膜融合結(jié)構(gòu)域,Domain III(殘基297～394)與受體識別有關(guān),在病毒侵入細(xì)胞和細(xì)胞嗜性中起重要作用[11]。其中,Domain I的殘基132～193、280～296區(qū)域、Domain III區(qū)域?qū)Φ歉锊《径玖τ绊戄^大。此外,E蛋白中第67位與153位為糖基化位點(diǎn),在維持病毒毒力中也起了重要作用[12]。31株分離株E蛋白氨基酸序列與DENV-1原型株(EU848545/USA:Hawaii/1944)對比,495個氨基酸殘基中,31個存在差異,Domain I-III及C 端分別有9、6、11、5個差異位點(diǎn),其中7個變異位點(diǎn)在31株分離株中均一致,推測為現(xiàn)流行的登革病毒在原型株基礎(chǔ)上在進(jìn)化選擇壓力下形成的穩(wěn)定變異位點(diǎn)。按照全基因組核苷酸序列進(jìn)化分析結(jié)果將31 株分離株分組,G-IV 株與G-I株的變異位點(diǎn)有較大不同,G-IV 包括16個變異位點(diǎn),其中7個位點(diǎn)在關(guān)鍵毒力區(qū)域;G-I株包括26個變異位點(diǎn),其中14個位點(diǎn)在關(guān)鍵毒力區(qū)域,其中T155S、S171T、V324I、V380I等4個關(guān)鍵毒力位點(diǎn)變異為G-I株特有,推測G-I株通過進(jìn)化選擇,尤其是關(guān)鍵毒力位點(diǎn)的變異,使得G-I株在DENV-1 中成為優(yōu)勢株。我們將G-I株進(jìn)一步分為4組,其中占比最多的B組差異位點(diǎn)數(shù)也最多,包括21 個變異位點(diǎn),其中H149Y、H158Y、V300M、V312L、A386T 等5個關(guān)鍵毒力位點(diǎn)變異為B組特有;S338L 為C 組特有,T346S、E362G 為E組特有。3 株本地來源感染分離株038/SH/2018、042/SH/2018 與045/SH/2018在關(guān)鍵毒力區(qū)域均存在7個變異位點(diǎn)。上述變異位點(diǎn)對病毒結(jié)構(gòu)、毒株毒力、與宿主相互關(guān)系、致病機(jī)制等方面的影響有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)登革病毒各結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸位點(diǎn)均廣泛存在變異,與參考序列對比,各蛋白氨基酸序列差異率在2.81%～13.76%。既往報道中,除E蛋白外,登革病毒編碼的其他蛋白同樣在致病過程中起重要作用。Naik等[13]發(fā)現(xiàn)NS4B 蛋白糖基化位點(diǎn)N58QN62Q 突變將顯著降低病毒復(fù)制效率;Tan等[14]發(fā)現(xiàn)NS4A 蛋白Y41F 突變將影響病毒的適應(yīng)性,減少感染性的病毒產(chǎn)生;Choy等[15]發(fā)現(xiàn)NS1蛋白G53D 突變能降低病毒的感染與傳播能力。后續(xù)研究中,將對各蛋白氨基酸變異位點(diǎn)及相互之間的關(guān)聯(lián)性做更全面的分析。

綜上,本研究通過病毒分離與測序,獲得31株2018－2020年上海市DENV-1全基因組序列,并對全基因組序列特征進(jìn)行深入研究,為登革病毒本地傳播風(fēng)險評估提供病原學(xué)證據(jù),對輸入性病例精準(zhǔn)溯源,為我市登革熱疫情防控及相關(guān)策略制定提供科學(xué)依據(jù),并為進(jìn)一步的致病機(jī)制研究與疫苗研發(fā)等工作打下基礎(chǔ)。本研究存在的不足之處為,缺乏相關(guān)病例的臨床資料,不能將分離株序列特征與臨床表現(xiàn)、疾病程度、治療與轉(zhuǎn)歸等關(guān)聯(lián),希望在今后的研究中,能收集到完整的臨床資料,使研究成果更具應(yīng)用價值。

利益沖突:無

引用本文格式:王葳,牟嘉斌,王環(huán)茹,等.2018－2020年上海市登革1型病毒全基因組序列特征研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(6):507-514.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.069