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        SARS-CoV-2病毒樣品感染性評估方法概述

        2022-12-28 11:26:54陳愛平張擁軍
        中國人獸共患病學(xué)報 2022年6期
        關(guān)鍵詞:疫情檢測方法

        陳愛平 ,張擁軍

        自2019 年冠狀病毒病(COVID-19)大流行疫情暴發(fā)以來,國內(nèi)外研究團隊、體外診斷試劑企業(yè)陸續(xù)推出了大量與SARS-Co V-2 相關(guān)的實驗室檢測方法,并在實踐中隨著疫情的發(fā)展不斷得到完善、更新[1-4]。近兩年的疫情防控經(jīng)驗證明,大規(guī)模檢測的策略應(yīng)用于疑似感染者診斷、臨床患者管理、傳染源調(diào)查、隔離檢疫措施、感染預(yù)防控制、密切接觸者管理和重點人群篩查等方面,可以有效阻斷病毒的傳播和疫情的蔓延[1-3]。

        實驗室檢測SARS-Co V-2 的直接證據(jù)是在待檢樣品中檢出SARS-Co V-2各種病毒相關(guān)成分,包括病毒顆粒、病毒特異抗原、病毒RNA 片段或序列,間接證據(jù)則是在患者血液中檢出不同的SARSCo V-2病毒特異性抗體。這些檢測涉及多種檢材,包括來自疑似感染者的各種樣品(呼吸道拭子、唾液、痰、支氣管灌洗液、血液、尿、糞便等)和死亡病例的尸檢組織,各類動物樣品以及來自外環(huán)境的污水、氣溶膠、物品表面拭子等[3-6]。盡管不同檢測方法依據(jù)的實驗原理和操作平臺迥異,迄今為止已經(jīng)在多種樣品中確認檢測到上述SARS-Co V-2 病毒相關(guān)成分,包括來自感染者的生物樣品(拭子、體液、組織)、感染者接觸或污染過的物品及外環(huán)境表面、陪伴動物(貓、狗)、飼養(yǎng)動物(虎、獅、水貂)、生活污水等[3-7]。這些病毒相關(guān)成分的有無并不足以確定樣品中是否存在能夠復(fù)制、有感染性的病毒。準確區(qū)分哪些樣品中存在無復(fù)制能力、無感染風(fēng)險的病毒成分,哪些樣品中存在能夠復(fù)制、有感染性的病毒,不僅有助于充分認識可能存在的傳染來源和傳播途徑,而且能夠促進修訂和落實疫情防控措施,更加有效保護易感人群。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)是測定樣品感染性的金標準,但對于高致病性的SARS-Co V-2病毒而言,病毒分離不適合在生物安全等級較低的基層實驗室廣泛推廣,需要簡便易行的替代實驗方案。本文擬對目前文獻中報道的各種評估SARSCo V-2病毒樣品感染性的方法進行概述,探索可以規(guī)避生物安全等級限制的替代方法,促進基層實驗室因地制宜地開展樣品感染性風(fēng)險評估,合理配置公共衛(wèi)生資源,優(yōu)化疫情防控措施,促進COVID-19的精準防控。

        1 病毒分離培養(yǎng)

        病毒分離培養(yǎng)是公認的評判樣品是否具有感染性的經(jīng)典方法。按照生物學(xué)分類,SARS-Co V-2病毒屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)β 冠狀病毒屬(Betacoronavirus)。病毒感染細胞的過程需要2種受體參與:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和跨膜絲氨酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2,TMPRSS2)[8]。已經(jīng)證明非洲綠猴腎上皮細胞(Vero-CCL81細胞、Vero E6細胞)、人類肺細胞系(Calu3細胞)、人類腸道細胞系(Caco2細胞)以及一些改造過的表達上述受體的細胞系均能夠支持SARS-Co V-2 病毒的生長,并被成功應(yīng)用于評估不同種類樣品的感染性[8-9]。樣品接種敏感細胞系之后,3~5 d觀察到明顯細胞病變效應(yīng)的樣品視為培養(yǎng)陽性,隨后進一步通過實時熒光RT-PCR、透射電鏡、免疫染色等證明培養(yǎng)物中存在的SARS-Co V-2 病毒成分。所有分離培養(yǎng)陽性的樣品無疑都具有感染性,具備傳播感染其它人或動物的能力。

        在疫情暴發(fā)初期,由于缺乏SARS-Co V-2病毒感染性持續(xù)時間的數(shù)據(jù),Bullard等[10]通過病毒分離方法回顧性地評價了RT-PCR 陽性樣品的循環(huán)閾值(Ct)、病程與感染性的關(guān)系。他們將90 份陽性樣品接種細胞,26份(28.9%)分離陽性。進一步分析發(fā)現(xiàn)僅Ct<24,發(fā)病時間<8 d的患者樣品才能夠感染細胞;而來自Ct>24,發(fā)病癥狀>8 d患者樣品的感染性較低。相關(guān)信息對于早期規(guī)劃公共衛(wèi)生政策和指導(dǎo)臨床、感染控制及職業(yè)衛(wèi)生決策具有較大參考價值。Gniazdowski等[11]對131名分子診斷陽性患者樣品的研究,得到類似結(jié)論。他們將樣品接種細胞,總體可回收病毒樣品Ct值均數(shù)為18.8。Ct值在10~20的樣品病毒生長效率高,其培養(yǎng)陽性率達76.7%,Ct值在20~30分離率下降至24.1%,Ct值在30~40時僅2.9%。除了呼吸道樣品,偶爾有其它團隊報道在糞便、尿液分離到病毒[12-13]。隨著疫情持續(xù)蔓延,檢測范圍逐漸擴大,一些來自外環(huán)境的樣品如污水、患者接觸過的物品等,雖然檢測到SARS-Co V-2病毒遺傳物質(zhì),但很少能夠分離到有復(fù)制能力和感染性的病毒,顯示這類樣品的潛在感染性有限[5,9]。

        病毒分離培養(yǎng)技術(shù)難度不高,但存在以下明顯的缺陷,如敏感性較低、實驗周期較長(數(shù)日到數(shù)周)、必須在高等級生物安全實驗室(BSL-3 級)開展,因此不適合作為常規(guī)方法在基層臨床實驗室普遍推廣,目前主要用于SARS-Co V-2病毒的基礎(chǔ)研究和疫苗開發(fā)[8-9]。

        2 病毒抗原檢測

        COVID-19疫情暴發(fā)之后,最初研發(fā)進入市場的是常見的SARS-Co V-2病毒核酸試劑盒,能夠確認樣品是否含有病毒RNA,但不能評估陽性樣品中病毒RNA 是否處于活躍復(fù)制狀態(tài),即是否具有感染性。隨后也有大量檢測病毒抗原的試劑盒被開發(fā)并投入市場,檢測靶標主要是病毒內(nèi)部的核衣殼蛋白N、病毒外部表面刺突蛋白S 的亞基S1 和S2。通過能夠結(jié)合病毒N 或S蛋白的特異抗體,捕獲并檢測完整病毒顆粒、裂解毒?;蚋腥炯毎槠械牟《究乖???乖瓩z測通常采用側(cè)流免疫層析的方法,在15~30 min內(nèi)完成,因此屬于快速檢測方法,適合用于即時檢測(point-of-care tests,POCT),樣品類型以呼吸道標本為主[1,4,9]。被感染者在體內(nèi)病毒排放高峰時期將病毒傳播給他人的風(fēng)險最高,此時快速抗原檢測結(jié)果應(yīng)該為陽性,因此檢測病毒抗原也是能夠作為評價樣品感染性的指標[14]。

        SARS-Co V-2病毒抗原檢測對于病毒載量高的樣品比較敏感,對病毒載量低的樣品敏感性不如常見的SARS-Co V-2 病毒核酸檢測方法[4,14]。Nordgren等[15]對一批瑞典患者樣品進行抗原檢測,對Ct值<25樣品的敏感性超過88%;與細胞培養(yǎng)相比,Panbio公司和Orient Gene公司的抗原檢測結(jié)果敏感性分別為94.1%和97.1%。2種抗原檢測試劑對N 蛋白的敏感性均<50 pg,所有Ct值>27的樣品均無感染性病毒。類似地,Korenkov 等[16]對2 028份樣品檢測,發(fā)現(xiàn)快速抗原檢測試劑對Ct<20、Ct<25、Ct<30 3 組樣品的敏感性分別為100%、98.25%和88.64%,所有29份培養(yǎng)陽性的樣品均能夠檢測到病毒抗原,顯示快速抗原檢測適合檢出可能傳播SARS-Co V-2病毒的高RNA 載量樣品。總的說來,病毒抗原快速檢測具有成本低、操作簡單、快速的優(yōu)點,適合大規(guī)模篩查的需要。其缺點在于抗原檢測過程中沒有擴增步驟,敏感性明顯低于病毒RNA 檢測,同時其它冠狀病毒的感染可能引起假陽性[4,9,14]。

        3 病毒亞基因組RNA(subgenomic RNA,sgRNA)檢測

        SARS-Co V-2病毒復(fù)制過程中,存在大量負鏈RNA 中間產(chǎn)物,能夠在感染細胞中轉(zhuǎn)錄,卻不能包裝到成熟病毒顆粒中,稱為病毒亞基因組,其主要特征是存在共同的5′端非編碼區(qū)約70 nt的先導(dǎo)序列[9,17]。有研究顯示,檢測到sgRNA 與發(fā)病后5~7 d的高病毒載量相關(guān),大多數(shù)病毒傳播也發(fā)生在這個時間段,因此sgRNA 陽性就表明病毒處于活動復(fù)制狀態(tài),也可以作為評估樣品感染性的替代指標。在SARS-Co V-2病毒感染細胞中,不同基因的sg RNA 表達存在差異,其中N 基因sgRNA 表達豐度最高,其余依次為S基因、ORF7a、ORF3a、ORF8、M、E、ORF6、ORF7b基因[17-18]。

        根據(jù)sgRNA 的結(jié)構(gòu)特點,有多種途徑能夠證實樣品中sg RNA 的存在,包括Northern 雜交、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時熒光RT-PCR(RTqPCR)、數(shù)字PCR(dPCR)、高通量測序等[17]。這幾種方法各有優(yōu)缺點,其中,Northern雜交的方法能夠顯示sgRNA 的大小及樣品完整性,但操作繁瑣、敏感性不夠;RT-PCR、RT-qPCR、dPCR 操作簡便,相對敏感快速,可同時檢測大量樣品,但只能檢測已知的sgRNA 類型;高通量測序檢測sg RNA,能夠發(fā)現(xiàn)新的sgRNA 種類和稀有突變,但實驗流程復(fù)雜、周期長,數(shù)據(jù)分析難度大,檢測成本較高。相比之下,利用RT-qPCR 和d PCR 開展SARS-Co V-2病毒sg RNA 檢測,也是一種合適的檢測樣品感染性的替代方法。

        來自韓國和西班牙的團隊分別證明了sg RNA檢測評估樣品感染性的可行性。Kim 等[19]采集了20名COVID-19患者189份樣品,通過比較細胞分離培養(yǎng)、PCR 檢測基因組RNA 和亞基因組RNA,并將樣品接種細胞。結(jié)果顯示sg RNA 檢測能夠準確預(yù)測感染性病毒的排放時間,與細胞培養(yǎng)結(jié)果相似,在患者發(fā)病早期陽性率最高。同樣,Bravo等[20]評估了105 份RT-PCR 陽性呼吸道樣品的sg RNA 檢測與細胞培養(yǎng)結(jié)果,2種方法取得94%的一致性。

        4 活力PCR(viability PCR)或核衣殼完整性定量PCR(Capsid integrity quantitative PCR)

        COVID-19 大流行疫情出現(xiàn)以后,各種檢測SARS-Co V-2病毒RNA 的商品化體外診斷試劑盒得到廣泛應(yīng)用,在全球范圍內(nèi)大規(guī)模開展對臨床和外環(huán)境樣品的篩查。RT-qPCR 以其敏感、特異、低成本、半定量等優(yōu)勢成為最常見的SARS-Co V-2病毒RNA 檢測方法,但RT-qPCR 不能區(qū)分檢測到的病毒RNA 是來自有復(fù)制能力的病毒,還是殘余的無復(fù)制能力的RNA 片段,無法確定陽性樣品是否具有感染性[1,9]。據(jù)文獻報道,利用光激活疊氮染料如疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)、疊氮溴化乙錠(Ethidium Monoazide,EMA),以及金屬化合物如氯化鉑(PtCl4)、順鉑(cis-diamineplatinum(II)dichloride,CDDP)等,建立活力PCR或核衣殼完整性定量PCR 的方法,能夠區(qū)分有復(fù)制能力的細菌、病毒與滅活的細菌、病毒[21]。其原理是基于這些化合物能夠在核酸提取之前結(jié)合樣品中滅活細菌、病毒DNA/RNA,使這部分被結(jié)合的DNA/RNA 不能在后續(xù)反應(yīng)中被擴增,保證了檢測的是來自有復(fù)制能力和感染性的細菌、病毒DNA/RNA。這樣的預(yù)處理選擇性地消除了游離核酸和核衣殼缺損的病毒顆粒帶來的假陽性信號,因此能夠估計樣品中病毒的感染性。

        由于氯化鉑價格低、對可見光不敏感,而光激活疊氮染料不容易滲透到復(fù)雜基質(zhì)中,Cuevas-Ferrando等[22]選擇氯化鉑,嘗試建立檢測SARS-Co V-2病毒RNA 的活力RT-qPCR(viability RT-qPCR)體系。經(jīng)過分析比較,他們認為這種活力RTqPCR足以區(qū)分污物表面的無感染性SARS-Co V-2顆粒,有助于更好地評估接觸SARS-Co V-2 污染物的感染風(fēng)險,還能夠檢測復(fù)雜基質(zhì)(糞便懸液、尿、鼻咽拭子、污水)中潛在的感染性SARS-Co V-2顆粒,因此是一種準確分析感染性病毒材料的備選方案[23]。Hong等[24]則嘗試不同去污劑(Triton X100、Triton X-114、Tween 20、Tween 80、SDS)和不同濃度PMA 預(yù)處理樣品,發(fā)現(xiàn)0.005%SDS能夠使游離病毒RNA、滅活病毒RNA 與PMA 形成PMA-RNA結(jié)合物,不能參與后續(xù)PCR 擴增,而復(fù)制活躍的病毒顆粒中RNA 不受影響。由此建立的SDS-PMA輔助RT-qPCR 方法能夠成功監(jiān)測SARS-Co V-2在塑料表面上的自然滅活過程,取得與標準噬斑試驗相似的結(jié)果,表明也能夠作為快速、方便評估PCR陽性樣品感染性的方法。

        5 氧化石墨烯(graphene oxide,GO)預(yù)處理

        氧化石墨烯具有多個功能基團,包括氧、環(huán)氧化物、羰基、羥基,能夠吸附核酸、蛋白質(zhì)、細菌、病毒等多種生物材料。利用這一特性,Yoo等[25]設(shè)計了一種包被GO 材料的微型珠子填充的過濾柱對傳統(tǒng)核酸提取步驟進行改進。在低pH 值環(huán)境中,納米結(jié)構(gòu)的GO 表面能夠吸附樣品中有復(fù)制能力和感染性的病原體以及無感染性的游離RNA;經(jīng)過物理、化學(xué)方法處理,在高pH 值條件下,吸附的病原體釋放出核酸。這部分核酸不能被GO 表面吸附而被洗脫出來,而先前低pH 值環(huán)境中吸附的游離核酸仍然停留在GO 表面。因此,只有在裂解步驟從被吸附的活躍復(fù)制的病原體中釋放出的核酸才能最終進入洗脫液,并有機會參與后續(xù)的核酸擴增反應(yīng)[25]。這個核酸提取方案的有效性首先經(jīng)過了人工污染的低致病性冠狀病毒HCo V229E 病毒樣品的測試。隨后在現(xiàn)場實驗中,從12間COVID-19患者負壓病房采樣,以濕紙巾采集被污染表面(病床、馬桶、病房墻壁、手機)的病原(細菌、SARS-Co V-2)和游離RNA片段)。樣品通過上述GO 柱子提取核酸后進行常規(guī)擴增,患者病房所有樣品均檢出細菌(基于16S r DNA),雙人病房大多數(shù)樣品(病床、馬桶、手機)都檢出SARS-Co V-2,而單人病房僅在手機表面檢測到SARS-Co V-2病毒,顯示病毒能夠通過這些物品表面?zhèn)鞑?也證明了納米結(jié)構(gòu)GO 能夠應(yīng)用于區(qū)分、分離物品表面無感染性的游離RNA 片段和有傳播風(fēng)險的活病毒。

        6 小結(jié)及展望

        過去2年全球大流行COVID-19疫情防控的經(jīng)驗表明,大規(guī)模開展SARS-Co V-2相關(guān)篩查的策略能夠有效確定潛在的傳染源、減輕持續(xù)傳播風(fēng)險。雖然已經(jīng)在全球范圍推廣COVID-19 疫苗應(yīng)急接種,但患者痊愈后再次感染、完成全程疫苗接種后突破感染的案例屢有報告,新的傳播能力更強的SARS-Co V-2病毒變異株陸續(xù)被檢出,不斷為COVID-19防控帶來新的挑戰(zhàn)。按照目前全球監(jiān)測數(shù)據(jù)及趨勢,COVID-19疫情難以在短時間內(nèi)完全銷聲匿跡。為了促進精準防控,合理配置公共衛(wèi)生資源,減輕疫情相關(guān)的社會、經(jīng)濟負擔(dān),在大規(guī)模開展SARS-Co V-2相關(guān)篩查的基礎(chǔ)上,有必要進一步分析陽性樣品的感染性。

        上述幾種針對病毒感染性檢測方法中,除了病毒分離培養(yǎng),病毒抗原檢測屬于即時檢測,雖然具有大規(guī)模篩查的優(yōu)勢,但敏感性較低,僅適用于發(fā)病早期高病毒載量的樣品,不適合病程超過10 d、低病毒載量的樣品。另外3種方法,亞基因組RNA 檢測、活力PCR 和石墨烯預(yù)處理,本質(zhì)都是基于病毒核酸擴增,其敏感性更高,能夠適用于觀察更長病程的樣品,也便于在基層實驗室開展。相對來說,sgRNA檢測在理論和實踐方面都比較成熟,只需要在目前開展的RT-qPCR 和d PCR 基礎(chǔ)上進行細微調(diào)整,就足以深入分析大規(guī)模篩查出來的陽性樣品,是最有可能商品化并廣泛推廣的方法。而活力PCR 和石墨烯預(yù)處理的方法,雖然目前相關(guān)文獻報道較少,但可以按照這樣的樣品預(yù)處理理念,探索更加方便、易行、低成本、高效的預(yù)處理材料和方式。

        總之,目前細胞培養(yǎng)之外的評估樣品感染性的檢測方法還處于研發(fā)階段,沒有達成廣泛的共識,缺乏統(tǒng)一的標準操作方案和結(jié)果判定標準。因此,需要通過更多樣品的測試,對這類方法評估SARSCo V-2樣品感染能力的可靠性進行總結(jié),制定出統(tǒng)一的實驗操作方案和判定標準,逐漸在基層實驗室推廣,科學(xué)區(qū)分有復(fù)制能力和感染性樣品和無復(fù)制能力無感染性樣品,指導(dǎo)當(dāng)前COVID-19疫情的精準防控。

        利益沖突:無

        引用本文格式:陳愛平,張擁軍.SARS-Co V-2病毒樣品感染性評估方法概述[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(6):523-527.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.080

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