何 敏,董曉慶,石利民,王雅倩,張守剛

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一種以發(fā)熱伴血小板、白細胞減少,嚴重者可出現出血和多器官功能障礙,甚至死亡的疾病。其致病原為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),簡稱新型布尼亞病毒[1-2]。自2010年在我國河南、湖北等地出現后,各地報告的SFTS發(fā)病數逐年增加,并且多個省份發(fā)生SFTS 聚集疫情[3-5]。近年來,南京市報告的SFTS病例數明顯高于以往[6],但聚集性案例鮮有發(fā)生。2020年4月南京鼓樓醫(yī)院收診了6例疑似一起聚集性SFTS疫情病人,對所有疑似病例進行SFTSV 核酸檢測,陽性者擴增S基因片段、測序并開展序列比對、溯源分析,為進一步加強對SFTSV 感染監(jiān)測和防控提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2020年4月15日南京市疾病預防控制中心收到南京鼓樓醫(yī)院送檢的6份急性期全血標本,根據臨床特征和流行病學資料,疑似為一起聚集性SFTS事件。6例病人先后出現發(fā)熱、血小板減少等癥狀,且有聚集史。南京市疾病預防控制中心收檢樣本后,立即開展檢測。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀器(ABI Q5)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR 法)(達安基因)、SP96全自動核酸提取儀(達安基 因)、One step RT-PCR kit(日 本TAKARA 公司)、Qiacel毛細管電泳儀(德國QIAGEN 公司),PCR 擴增儀(美國ABI公司)。

1.3 方 法

1.3.1 核酸檢測 全血標本,3 000×g離心5 min,分離血清。吸取200μL血清,按試劑盒說明書提取病毒RNA,采用熒光定量PCR 法對所提核酸進行新型布尼亞病毒的檢測,陽性標本核酸留存,實驗設立陰性對照和陽性對照。

1.3.2 S基因的擴增和序列測定

1.3.2.1 引物設計與合成 根據SFTSV 的S基因特點自行設計片段引物。引物序列見表1。引物由上海英駿公司合成。

表1 S基因片段擴增引物Tab.1 Primers for amplification of the S gene fragment

1.3.2.2 病毒RNA 擴增和測序 以 提取的病毒RNA 為模板,進行一步法RT-PCR 擴增。RT-PCR反應條件為50 ℃,30 min,94℃2 min;94℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35個循環(huán);72 ℃10 min。使用Qiacel對擴增產物進行電泳,檢測有無目的條帶,隨后送至上海生工生物有限公司進行純化和測序。

1.3.2.3 基因測序及序列分析 用Dnastar中Seq-Man軟件對測序結果進行拼接,獲得S目的基因片段序列;應用美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數據庫對各樣本S基因序列進行在線BLAST 比對,分析最大相似性株。文中涉及的其他地區(qū)SFTSV 相關參考株S基因序列從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的GenBank 中下載。采用Meg Aline法進行核苷酸序列同源性比較,MEGA5.2軟件對S 基因核苷酸序列進行進化分析,用最大似然法構建系統(tǒng)進化樹,可靠性分析采用Bootstrap法,循環(huán)次數設為1000。

2 結果

2.1 疑似聚集疫情病例關系特征 根據發(fā)病時間順序對病例進行編號,1號病例,實驗室標號Nanjing200415-3許某,男,35歲,農民,2020 年4 月1日發(fā)病,4月11日前往南京鼓樓醫(yī)院就診。后續(xù)2～6號病例2020年4月8日至4月11日期間相繼發(fā)病并就診。流行病學資料顯示,1號病例發(fā)病前自述有蜱蟲叮咬史,后續(xù)病例5例均無蜱蟲叮咬史。2號、4號與1號病例存在親屬關系,3號、5號、6號自訴與1 號病例發(fā)生直接接觸(血液),無其他SFTS確診病例接觸史。2例為當地農民,余3例為工人,工作地點不同,工作環(huán)境中不存在疾病傳播媒介。2～6號病例發(fā)病時間集中,且有共同聚集、暴露史。初步考慮,該起疫情可能為一起直接接觸1號病例導致的聚集性疫情。見表1。

2.2 SFTSV 核酸檢測 采用實時熒光定量PCR法對送檢的7例全血標本進行SFTSV 核酸檢測。其中5例(樣本號 Nanjing200415-1、Nanjing 200415-2、Nanjing200415-4、Nanjing200415-6、Nanjing200415-7)SFTSV 核酸檢測陽性,CT 值分別為35.1、34.3、36.0、35.2、33.4,Nanjing200415-3 為 陰性。見表2。

表2 一起疑似聚集性SFTSV病例基本信息及核酸檢測結果Tab.2 Basic information and nucleic acid test results of a suspected cluster of SFTV cases

2.3 SFTSV S基因片段同源性比較 5例核酸陽性(Nanjing200415-1、200415-2、200415-4、200415-6、200415-7)經RT-PCR 擴增,雙向測序后,對所得目的片段S基因進行拼接。經分析比對,5例核苷酸高度同源,4例核苷酸同源性為100%,200415-2與其他4例核苷酸同源性為99.7%;與南京同期另一病例Nanjing200609-1 核苷酸同源性為95.2%;與GenBank下載的其他地區(qū)SFTSV 參考株的核苷酸同源性為93.8%～100%。經NCBI網站在線BLAST 比對,與此次疫情分離株S 基因片段核苷酸同源性最高的毒株為2014 年江蘇地區(qū)分離株JS2014-06和2015年江蘇地區(qū)分離株JS2015-26,核苷酸同源性為100%,見圖1。

圖1 Nanjing200415-1-5與其他SFTSV核苷酸同源性比較Fig.1 Homology comparison of nucleotides between Nanjing200415-1-5 and other SFTSV

2.4 SFTSV S片段進化分析 將5例SFTSV 南京株S 片段基因序列與從GenBank 獲取的其他地區(qū)參考株進行遺傳進化和種系分析。通過進化樹可以看到,自2010年以來,江蘇地區(qū)歷年SFTS均有發(fā)生,基因型以C 型為主,C1、C2、C3、C4亞型均有發(fā)布。C分支內的中國各地區(qū)流行株間高度同源,未發(fā)現地區(qū)差異。此次聚集性疫情的5例SFTSV分離株在同一進化樹C2 亞型分支上聚集成一簇,親緣關系近;與2014年、2015年江蘇及安徽的流行株、2010年江蘇株、河南及安徽參比株形成遺傳距離相近的一個C2 亞型小分支;一株近期(2020年6月份)南京株分布在C4 亞型分支上,在C1、C3 亞型分支沒有分布。余日本和韓國毒株處于J基因型分支。見圖2。

圖2 2020年南京市一起聚集性SFTSV陽性株S基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Sgene of an outbreak of SFTSV positive strains in Nanjing in 2020

3 討論

以往監(jiān)測數據顯示,近年來南京及周邊地區(qū)發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)本地病例數出現了大幅增長,發(fā)病呈逐年上升態(tài)勢。但是一直以來江蘇及周邊地區(qū)SFTSV 聚集性疫情較少發(fā)生[6-7]。本次在較短時間、小范圍內共計6人先后出現發(fā)熱、血小板減少等SFTS典型臨床癥狀[8]。根據?江蘇省發(fā)熱伴血小板減少綜合征專項監(jiān)測方案?規(guī)定,2周內,在同一村莊或在同一山坡等地勞動或旅游人員中,出現2 例及以上發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例,或在病例密切接觸者中出現類似病例,為聚集性病例。本次聚集性疫情的發(fā)生,進一步說明了我市及周邊地區(qū)SFTSV 疫情形勢日益嚴峻。

有研究表明蜱可能在該病的傳播過程中發(fā)揮著重要作用[9],而聚集性疫情病例血液、體液、分泌物等可能是重要的傳播因子[10-11]。此次事件中,1號病例自述蜱蟲叮咬史,經帶毒蜱類叮咬感染SFTSV,但其血液中SFTSV 核酸檢測為陰性,推測可能原因為發(fā)病時間久,且經當地醫(yī)療機構抗病毒治療。對此病例血清開展抗體補充實驗,結果為Ig M 陰性,IgG 陽性,證實1號病例確為SFTSV 感染者,且已處于恢復期。2～6號病例SFTSV 核酸檢測陽性,均有與1號病例有共同聚集、接觸史,推測感染方式為在1號病例SFTSV 病毒載量較高的急性傳染期內,接觸其血液、分泌物或排泄物。

SFTS作為一種新發(fā)傳染病,隨著各地報告病例增加,國內外對SFTSV 分子流行病學及基因測序逐漸增多和深入[12-14]。SFTSV 根據S片段基因序列分子特征可分為C 和J兩種基因型,其中C 基因型分為C1～C4 4種亞型[14-15]。李志鋒等研究表明,我國東部地區(qū)目前主要為C 基因型,江蘇和安徽優(yōu)勢流行株為C2 和C4 亞型,同時存在少量的C1和C3亞型流行[16]。系統(tǒng)進化樹分析顯示,本次疫情病例均屬于C2 基因亞型,與江蘇北部及安徽地區(qū)屬同一分支,遺傳進化距離較近;與國內其他分離株及日本、韓國分離株不在同一分支,差異較大。從進化樹中還可以看出,從2010年以來,江蘇分離株廣泛分布于C2 亞型分支,不同年份毒株間親緣關系近,遺傳進化速度較為緩慢。另有一部分江蘇流行株分布于C4亞型分支,本次事件同時期Nanjing200609病例屬于C4亞型分支,說明南京地區(qū)同一時期SFTSV 流行株分子亞型并不單一,為C2亞型和C4亞型共流行狀態(tài)。有研究發(fā)現,SFTSV 基因型可能與病例嚴重程度相關,SFTSV 感染死亡病例多為C2基因亞型[17]。本次聚集性疫情病原傳染性強,病例癥狀較嚴重,進一步佐證了這一研究。

目前尚無針對SFTSV 的特效藥物,也無有效疫苗可以接種[18]。因此,需積極開展廣泛宣傳,針對南京市SFTS流行區(qū)重點人群,普及防治知識,提高民眾防病意識。同時,加強對SFTS監(jiān)測,通過對SFTSV 分子水平研究,掌握我市SFTSV 基因型流行特征以及遺傳進化特點,為南京地區(qū)SFTS防控提供科學數據支撐。

利益沖突:無

引用本文格式:何敏,董曉慶,石利民,等.一起聚集性發(fā)熱伴血小板減少綜合征病原S基因分子進化分析[J].中國人獸共患病學報,2022,38(6):502-506.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.068