楊利超 ,郭鑾英 ,王妮娜 ,馬 駿 ,李國(guó)慧 ,陳守義 ,劉 全

鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是一種由螺旋體目(Spirochaetales)螺旋體科(Leptospiraceae)鉤端螺旋體屬(Leptospira)的致病性鉤端螺旋體引起的人獸共患疾病。鉤端螺旋體種類較多,目前已發(fā)現(xiàn)有23種,共有10種對(duì)人和動(dòng)物致病[1]。我國(guó)發(fā)現(xiàn)有問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、博氏鉤端螺旋體(L.borgpetersenii)、圣地羅西鉤端螺旋體(L.santarosai)和韋氏鉤端螺旋體(L.weilii)4種[11],其中廣東主要流行問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(L.interrogans)。鉤端螺旋體可感染多種宿主,主要有鼠類動(dòng)物(黑線姬鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠等)和家畜(豬、犬和牛等)[2],其中鼠類與人生存環(huán)境接近,人接觸被鼠類污染的水和土壤后通過(guò)受損皮膚或者粘膜而感染鉤端螺旋體,臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、發(fā)冷等癥狀,更嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)肝損傷和黃疸、腎功能衰竭和內(nèi)出血等嚴(yán)重后果,進(jìn)而導(dǎo)致死亡[3]。

鉤端螺旋體病主要在熱帶和亞熱帶國(guó)家流行[4],屬于全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的重要人獸共患傳染病[5]。根據(jù)我國(guó)傳染病防治法,鉤端螺旋體病屬于乙類傳染病。早在1934年,中國(guó)廣東省就報(bào)告了首例人鉤端螺旋體病[6],到目前我國(guó)有29個(gè)省份曾報(bào)道該病流行,在1955年至2016年間我國(guó)共出現(xiàn)了10次鉤端螺旋體病發(fā)病率超過(guò)10/10萬(wàn)的特大流行[7],共造成超過(guò)254萬(wàn)人感染該病,其中有2萬(wàn)多人死亡[8]。

廣州市地處亞熱帶沿海地區(qū),溫?zé)岫嘤?鼠類動(dòng)物種類繁多,與人類接觸密切,這增加了鉤端螺旋體病等鼠類動(dòng)物疾病在該地區(qū)傳播的風(fēng)險(xiǎn)[9],因此,有必要了解宿主動(dòng)物的流行情況。近年來(lái),尚無(wú)文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道使用PCR 技術(shù)對(duì)廣州市鼠類動(dòng)物感染鉤端螺旋體流行情況的監(jiān)測(cè)。因此,本研究調(diào)查了廣州市鼠類動(dòng)物中致病性鉤端螺旋體病的流行情況和遺傳特征,為廣州市鉤端螺旋體病的預(yù)防與控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 本實(shí)驗(yàn)室2018－2019年在廣州市花都區(qū)、海珠區(qū)和從化區(qū)采用籠捕法捕捉鼠類動(dòng)物共200只。所有動(dòng)物均在24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室并在生物安全柜內(nèi)解剖,采集脾臟,置入無(wú)菌無(wú)酶EP管中,置于－80 ℃冰箱保存待用。

1.2 總DNA 的提取 無(wú)菌無(wú)酶EP管中取樣本約5 g,加入400μL 4 ℃預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)液,使用組織研磨儀(Qiagen),72 Hz研磨3 min后,12 000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清液250μL,使用DNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司),提取組織中的DNA。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的流程進(jìn)行,最終獲得DNA 共50μL 置于－80 ℃待用。

1.3 巢式PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 參考文獻(xiàn)報(bào)道的鉤端螺旋體16SrRNA和LipL32基因引物[10],對(duì)提取的總DNA 用巢式PCR 進(jìn)行細(xì)菌序列擴(kuò)增。反應(yīng)第1輪擴(kuò)增體系10μL:Ex Taq 0.15μL(TaKaRa公司),10×Ex Taq Buffer 1μL,d NTP Mixture 0.8 μL,上下游引物各0.4μL(10μmol/L),模板1μL,補(bǔ)充雙蒸餾水至10μL。第2 輪擴(kuò)增體系50μL:Ex Taq 0.25μL(Ta KaRa公司),10×Ex Taq Buffer 5μL,d NTP Mixture 4μL,上下游引物各2μL(10μmol/L),模板1μL,補(bǔ)充雙蒸餾水至50μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,退火(溫度見(jiàn)表1)30 s,72℃延伸(時(shí)間見(jiàn)表1),35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DUT-48藍(lán)光切膠儀檢測(cè),陰性對(duì)照模板使用無(wú)核苷酸酶雙蒸水代替,選擇條帶大約在1 230 bp和730 bp的特異性條帶,送到廣州天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序。具體引物信息和擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物和擴(kuò)增條件Tab.1 PCR primers and amplification conditions

1.4 序列分析與比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將獲得的測(cè)序結(jié)果,在NCBI-BLAST 上進(jìn)行序列比對(duì)鑒定,確定獲得核酸序列屬于目的序列。使用軟件Mega7.0對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)和處理,采用鄰接法(Neighbor joining method,NJ)基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型,Bootstrap test 1 000 次,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集情況 在廣州市3個(gè)區(qū)采集到5種鼠類動(dòng)物共200只。其中花都區(qū)褐家鼠100只;從化區(qū)褐家鼠20只、臭鼩鼱22只、板齒鼠4只、黃胸鼠3只、黃毛鼠1只;海珠區(qū)褐家鼠50只(圖1)。

圖1 廣州市樣品采集地點(diǎn)Fig.1 Map of Guangzhou showing locations of sample collection

2.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果 在200份樣品中共檢出3份鉤端螺旋體陽(yáng)性樣本,編號(hào)分別為HDSP52、64、72,16SrRNA基因和LipL32 基因檢測(cè)率一致,總陽(yáng)性率為1.5%?；ǘ紖^(qū)褐家鼠中檢出陽(yáng)性3 份(3.0%),從化區(qū)和海珠區(qū)均為陰性(表2)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖電泳見(jiàn)明顯1 230 bp和730 bp的目標(biāo)條帶,與預(yù)期大小一致(圖2)。

圖2 褐家鼠中鉤端螺旋體巢式PCR 結(jié)果Fig.2 Nested PCR results for Leptospira in Rattus norvegicus

表2 樣品采集與檢測(cè)情況Tab.2 Sample collection and testing

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 經(jīng)Meg Align軟件同源性分析,本研究擴(kuò)增獲得3 條16SrRNA和LipL32基因陽(yáng)性樣本序列之間的同源性分別為99.3%～99.6%和97.7%～99.2%。將測(cè)序獲得符合質(zhì)量的序列,在NCBI-BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì),與Gen-Bank中獲得的10 種致病性鉤端螺旋體的16S rRNA基因和9種致病性鉤端螺旋體的LipL32基因序列進(jìn)行比對(duì),比對(duì)結(jié)果截齊后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。圖3所示,陽(yáng)性樣本HDSP52、64、72與致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(L.interrogans)菌株在同一個(gè)分支內(nèi),與L.interrogans(MT645311.1、LC459958.1)親 緣關(guān)系最近,序列同源性大于99%。圖4所示,陽(yáng)性樣本HDSP52、64、72 與致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋(L.interrogans)菌株在同一個(gè)分支內(nèi),與L.interrogans(EU871718.1、AY461906.1)親緣關(guān)系最近,序列同源性為99%。

圖3 基于10種致病性鉤端螺旋體16S rRNA 部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA partial sequences of ten pathogenic Leptospira

圖4 基于9種致病性鉤端螺旋體Lip L 32部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on Lip L 32 partial sequences of ten pathogenic Leptospira

3 討論

近年來(lái)我國(guó)在鉤端螺旋體病的預(yù)防、控制方面取得了較大的進(jìn)步,鉤端螺旋體病在人群中發(fā)病率和死亡率逐年下降。然而,由于致病性鉤端螺旋體可感染多種動(dòng)物宿主[11],其流行后會(huì)在疫區(qū)野生動(dòng)物中長(zhǎng)期存在,我國(guó)每年都有人因鉤端螺旋體病而死亡,因此鉤端螺旋體病仍是我國(guó)重要的人獸共患傳染病。

鼠類動(dòng)物是多種病原體的宿主,同時(shí)也是與人類接觸最多的動(dòng)物之一[12]。隨著經(jīng)濟(jì)、旅游和商業(yè)開(kāi)發(fā)等的發(fā)展,使鼠類動(dòng)物原有的生態(tài)環(huán)境遭到改變,造成鼠類動(dòng)物遷徙、流竄[13]。當(dāng)宿主動(dòng)物感染鉤端螺旋體后,受感染的動(dòng)物可通過(guò)尿液排菌,從而污染土壤,而頻繁的降雨會(huì)將鉤端螺旋體污染的土壤沖入水體,增加人通過(guò)接觸被鉤端螺旋體污染的水或土壤而感染鉤端螺旋體的概率[14]。廣州市是一個(gè)人口密集,降雨頻繁且水網(wǎng)密布的地區(qū),也是鉤端螺旋體病多發(fā)的地區(qū)。對(duì)廣州地區(qū)鼠類動(dòng)物中鉤端螺旋體病的情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),對(duì)了解當(dāng)?shù)劂^端螺旋體在宿主中的流行情況,并有針對(duì)性地做好預(yù)防與控制,防止鉤端螺旋體病在廣州傳播有重要作用。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,特別是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法,具有高敏感性、檢測(cè)準(zhǔn)確性、成本低和效果好等特點(diǎn),因此廣泛用于鉤端螺旋體的監(jiān)測(cè)。2015年胡群等[15]通過(guò)PCR 技術(shù)對(duì)寧波梅山口岸72只鼠類腎組織進(jìn)行鉤端螺旋體檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在黑線姬鼠中陽(yáng)性率為6.9%;張翠彩等[16]通過(guò)暗視野顯微凝集試驗(yàn)(檢測(cè)抗體)和MLST 技術(shù)對(duì)2016－2018年捕捉的江西省1 404只鼠類動(dòng)物進(jìn)行鉤端螺旋體檢測(cè),在黑線姬鼠和黃毛鼠中檢測(cè)到,陽(yáng)性率為4.6%。而在本研究中,褐家鼠中鉤端螺旋體陽(yáng)性率是1.5%,這由于鉤端螺旋體的宿主特異性和地域的不同,在Dhewantara等[17]的研究調(diào)查中顯示,寧波、江西省屬于高發(fā)地區(qū),廣東屬于發(fā)病中等地區(qū),這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致;2005年許曉茵等[18]對(duì)廣州市番禺區(qū)鼠類動(dòng)物進(jìn)行鉤端螺旋體血清凝集溶解試驗(yàn)(檢測(cè)抗體),鼠類陽(yáng)性率為32.5%;2011年孫小康等[19]在廣東省清遠(yuǎn)市對(duì)鼠類動(dòng)物進(jìn)行鉤端螺旋體暗視野顯微凝集試驗(yàn)(檢測(cè)抗體),在板齒鼠、黃毛鼠、臭鼩鼱、褐家鼠和黃胸鼠檢測(cè)到,陽(yáng)性率為22.3%。本研究結(jié)果比廣州市番禺區(qū)、清遠(yuǎn)市報(bào)道的感染率低,這可能與本研究的檢測(cè)方法、檢測(cè)組織有關(guān),且與黑線姬鼠是鉤端螺旋體的優(yōu)勢(shì)鼠種有關(guān),而本研究中的鼠類主要是褐家鼠。與之前的研究相比,本研究使用PCR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),可較為直接的反映廣州市鼠類動(dòng)物中鉤端螺旋體的流行情況。

脾臟作為機(jī)體重要的淋巴器官,在機(jī)體免疫鉤端螺旋體的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。鉤端螺旋體感染宿主動(dòng)物,經(jīng)過(guò)潛伏期后,在血液中大量繁殖,進(jìn)而迅速擴(kuò)散到機(jī)體的組織器官[20],但在不同組織器官的選擇適應(yīng)性有很大差異。在腎臟中鉤端螺旋體受機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響較小,故尿中可長(zhǎng)時(shí)間排菌[21]。遺憾的是,本次研究的樣本只獲得了脾臟,不能分析在同一只鼠類動(dòng)物不同器官鉤端螺旋體分布的差異。

本研究是首次在廣州地區(qū)使用PCR 技術(shù)對(duì)鼠類動(dòng)物進(jìn)行鉤端螺旋體流行情況檢測(cè),在花都區(qū)褐家鼠中鑒定出3株致病性問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(L.interrogans)。在鼠類動(dòng)物中進(jìn)行鉤端螺旋體病流行情況的監(jiān)測(cè)有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義,本研究為廣州市鉤端螺旋體病的預(yù)防與控制提供參考依據(jù)。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:楊利超,郭鑾英,王妮娜,等.廣州市鼠類動(dòng)物鉤端螺旋體的感染調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):473-477.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.055