馬 正,施 越,章金垚,俞曉平

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 31008)

鏈霉菌(Streptromyces)是在土壤中發(fā)現(xiàn)的絲狀革蘭氏陽性細菌[1],是放線菌中最大的一個種屬,可產(chǎn)生多種抗病毒、抗真菌[2-4]等具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物。自20世紀40年代首次報道鏈霉菌能產(chǎn)生抗生素以來,已從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了大量的新型抗生素[5]。然而,經(jīng)過幾十年傳統(tǒng)生化篩選分離,化合物發(fā)現(xiàn)的重復(fù)率不斷提高。同時,眾多廣譜抗生素耐藥性病原微生物不斷涌現(xiàn),因此,新型天然化合物的挖掘和創(chuàng)制顯得尤為重要。

隨著基因組測序方法、生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展[6-8],目前包括antiSMASH[9]和PRISM[10]等在內(nèi)的諸多分析工具已用于預(yù)測天然產(chǎn)物生物合成基因簇及其編碼產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)[11]。大量鏈霉菌基因組測序分析表明:多數(shù)鏈霉菌基因組中8%～10%基因序列與次級代謝相關(guān),一般都蘊含著幾十個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇,其數(shù)目遠遠超過目前從鏈霉菌中分離得到的化合物種類[12-13]。由此表明,鏈霉菌具有合成新天然化合物的巨大潛力[14]。然而,在常規(guī)實驗室條件下,大多數(shù)天然產(chǎn)物(natural products,NP)的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)不表達或低表達,這些處于“沉默”狀態(tài)的生物合成基因簇,被稱為沉默基因簇(silent biosynthetic gene cluster)或隱性基因簇(cryptic biosynthetic gene clusters,CBGCs)。目前,如何激活鏈霉菌中“沉默”基因簇的表達,已成為開發(fā)新天然化合物方面的研究熱點。

本文將從調(diào)控基因的過表達/敲除、基因簇重構(gòu)/異源表達、共培養(yǎng)、核糖體工程技術(shù)、基于報告基因的定向激活、clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9(CRISPR/Cas9)編輯技術(shù)等方面綜述一些激活鏈霉菌沉默生物合成基因簇的研究進展。

1 利用調(diào)控基因激活沉默基因簇

鏈霉菌細胞內(nèi)存在復(fù)雜且龐大的調(diào)控系統(tǒng),鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的生物合成受到包括途徑特異性、多效性以及全局性調(diào)控基因在內(nèi)的多層級嚴格調(diào)控[15]。因此,無論是通過正向調(diào)控基因的過表達還是負向調(diào)控基因的敲除,都是激活沉默基因簇表達最直觀的方法之一。

1.1 過表達正調(diào)控基因

SARP(Streptomycesantibiotic regulatory proteins)普遍存在于鏈霉菌中并參與調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇,該類調(diào)控基因的表達可激活沉默生物合成基因簇。Wu等人利用組成型啟動子ermE*將12個SARP類調(diào)控基因在Streptomycestsukubaensis L20中過表達,發(fā)現(xiàn)tsuR1基因的過表達會產(chǎn)生新型蒽環(huán)類藥物tsukubarubicin[16],它對枯草芽孢桿菌具有拮抗活性。

Krause等在變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)中過表達始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)的SARP類調(diào)控基因papR2,導(dǎo)致S.lividans十一烷基靈菌紅素(undecylprodigiosin,Red)的基因簇被激活。主要機理是由于過表達的papR2彌補了S.lividansRed的生物合成基因簇中SARP調(diào)節(jié)因子(RedD)的調(diào)節(jié)功能[17],從而實現(xiàn)Red的生成。除了SARP類調(diào)控基因外,LuxR家族調(diào)控基因也是常見的調(diào)控因子[18]。例如在鏈霉菌SN-593中過表達LuxR家族調(diào)控基因RevQ和RevU可成功激活苯甲醌類抗生素reveromycin A的合成[19]。

1.2 敲除負調(diào)控基因

有些調(diào)控因子發(fā)揮正向調(diào)控作用,但有些調(diào)控因子的表達反而導(dǎo)致基因簇的沉默,不利于次級代謝產(chǎn)物的生物合成。Li等人在S.coelicolorA3(2)發(fā)現(xiàn)一個I型PKS的基因簇(cpk),通過敲除途徑特異性負調(diào)控基因scbR2(γ-丁內(nèi)酯蛋白),使菌株喪失放線紫紅素(Act)、Red、鈣依賴性抗生素(CDA)生產(chǎn)的同時,成功激活出一種黃色色素coelimycin P1[20]。

AdpA(A因子依賴蛋白A)是一種多效性調(diào)節(jié)因子,通常能參與調(diào)節(jié)細胞周期分化和抗生素的合成[21]。Becerril等構(gòu)建粘土鏈霉菌Streptomycesargillaceus的AdpA缺失突變株(Streptomycesargillaceu-ΔadpAa),分析發(fā)現(xiàn)該突變株發(fā)酵主產(chǎn)物米曲霉素(mithramycin)的產(chǎn)量明顯下降的同時有兩個新物質(zhì)germicidin B/C被激活產(chǎn)生[22],這兩個化合物已證實對孢子萌發(fā)具有協(xié)調(diào)作用[23]。同樣,Xu等人報道圈卷產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesansochromogenes中oviedomycin的生物合成基因簇由于adpA基因的缺失而被激活[24]。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子誘餌

轉(zhuǎn)錄因子誘餌(transcription factor decoy,TFD)是模擬阻遏蛋白可能與目標(biāo)基因簇特異性結(jié)合一段DNA片段,通過構(gòu)建質(zhì)粒導(dǎo)入宿主增加TFD的拷貝數(shù),“吸引”阻遏蛋白與之結(jié)合,從而“解鎖”阻遏蛋白對基因簇的負向調(diào)控,實現(xiàn)目標(biāo)基因簇的激活[25](圖1)。TFD策略已廣泛應(yīng)用于哺乳動物細胞和臨床研究[26-27],Wang等人首次嘗試在鏈霉菌中采用TFD策略激活沉默基因簇[28],在S.lividans66中激活了放線菌素和十一烷基靈芝菌紅素生物合成基因簇的表達。該策略也成功激活了Streptomycessp. F-5635中8個沉默基因簇中的3個沉默基因簇(編碼butyrolactol A、oxazolepoxidomycin A)的表達(成功率為37.5%)[28]。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)示意圖[28]

2 基因簇重構(gòu)與異源表達

基因簇處于“沉默”狀態(tài)的原因是復(fù)雜和多方面的,往往是由于受到直接或間接性阻遏造成的,因此,去除或“繞過”阻遏因素是激活沉默基因簇的關(guān)鍵。異源表達作為一種將天然產(chǎn)物化學(xué)類型與其基因型聯(lián)系起來的遺傳操作工具,即將沉默基因簇在遺傳代謝背景清楚的模式菌株中表達,可有效解除天然菌株中復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響,從而激活沉默基因簇的表達[29]。選擇合適的宿主是沉默基因簇異源表達成敗的關(guān)鍵。選取宿主一般有一下三點原則:①宿主遺傳背景清楚,易培養(yǎng),生長周期短;②易于轉(zhuǎn)化和遺傳改造,有利于異源沉默基因簇的高效表達;③宿主能供給異源沉默基因簇編碼次級代謝物合成所需的前體物質(zhì),盡可能少有競爭途徑。

2.1 沉默基因簇異源表達及其宿主選擇

目前,多個鏈霉菌已被開發(fā)成為異源基因簇表達的良好宿主,如S.coelicolor、S.lividans、S.albus等。比如,S.lividans的Act、Red和CDA基因簇在轉(zhuǎn)錄水平上基本處于“沉默”狀態(tài),且菌株遺傳背景清楚,合成副產(chǎn)物少,因此,S.lividans可作為沉默基因簇異源表達的理想宿主[30]。例如,工程菌株S.lividansΔDYA11是通過刪除其11個內(nèi)源性生物合成基因簇(大小為228.5 kb)并插入另外兩個噬菌體ΦC31attB整合位點構(gòu)建而成[31]。將核苷類抗生素tunicamycin、蘭硫肽deoxycinnamycin的生物合成基因簇在該菌株中進行了表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.lividansΔDYA11合成deoxycinnamycin和tunicamycin的產(chǎn)量是在未改造菌株S.lividnasTK24中表達后產(chǎn)量的4倍。

StreptomyccesalbusJ1074是SalI限制修飾系統(tǒng)存在缺陷的S.albusG衍生株,其存在7個rRNA操縱子且具有較小的基因組(6.8 Mbp),因此,S.albusJ1074在大多數(shù)沉默基因簇異源表達方面具有代謝背景相對“簡潔”、生長速率快等優(yōu)勢[32],已被廣泛用作已知基因簇或沉默基因簇異源表達的理想宿主[33-34]。最近Myronovskyi等人報道了對底盤菌株S.albusJ1074的改造,通過對15個內(nèi)源基因簇(大小500 kb)的缺失和ΦC31attB整合位點的增加,獲得衍生株S.albusDel14[35],并成功實現(xiàn)了來源Frankiaspp.沉默基因簇的異源表達,產(chǎn)生了新型化合物fralnimycin[36]。

2.2 基因簇重構(gòu)和修飾

異源表達能“繞過”原宿主的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來激活沉默基因簇,但通常表達產(chǎn)物的產(chǎn)量較低,分離提取困難。因此,需要提高異源沉默基因簇的轉(zhuǎn)錄強度而提升次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。目前,通過生物合成基因簇的重構(gòu)和修飾(包括DNA組裝和啟動子工程[37]),即利用組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子替換原啟動子(native promoter),增強基因轉(zhuǎn)錄水平,從而更有效的激活沉默基因簇在宿主中的異源表達[38-40](圖2)。

圖2 利用啟動子替換激活沉默基因簇示意圖[40]

在宿主S.coelicolorM145中,Du等以neo(卡那霉素抗性基因)為報告基因,比較了3個組成型啟動子ermEp*、SF14p、hrdBp和一個誘導(dǎo)型啟動子tcp830p的轉(zhuǎn)錄活性,表明hrdBp表達活性最好。谷氏菌素(gougerotin)生物合成基因簇中GouA、GouM-B(一種多順反子轉(zhuǎn)錄單位)和GouN的自身啟動子被hrdBp取代,將重構(gòu)的基因簇在S.coelicolorM146中進行異源表達后,谷氏菌素的產(chǎn)量較未修飾表達的產(chǎn)量增加了10倍以上[41]。

為實現(xiàn)Streptomycesorinoci壯觀霉素生物合成基因簇在S.lividans中的表達,Shao等人對其基因簇進行重構(gòu)[42],利用7種不同的強啟動子和1種誘導(dǎo)型鏈霉菌啟動子分別啟動基因簇中8個基因的表達,借助TAR克隆技術(shù)(transformation-associated recombination,TAR)將重構(gòu)的基因簇整合到S.lividans基因組上進行異源表達,最終壯觀霉素的產(chǎn)量達100 g/L。

3 共培養(yǎng)

自然環(huán)境下,鏈霉菌與許多細菌長期共存且彼此相互作用[43]。因此,在這些細菌和鏈霉菌共培養(yǎng)(模擬鏈霉菌與其他菌株持續(xù)相互作用的環(huán)境)的過程中,會產(chǎn)生多種“誘導(dǎo)子”,從而極大地影響鏈霉菌的次級代謝,刺激產(chǎn)生新的次級代謝物。目前共培養(yǎng)激活沉默基因簇的機制主要可以分為四種情況:①空間和營養(yǎng)的競爭從而產(chǎn)生“抵制”;②菌株之間的物理接觸;③菌株之間化學(xué)信號傳遞(如信號分子);④菌株間遺傳信息的“水平轉(zhuǎn)移”。

3.1 鏈霉菌和非鏈霉菌細菌共培養(yǎng)

鏈霉菌和非鏈霉菌的細菌共培養(yǎng)時,鏈霉菌會識別細菌表面包括受體蛋白在內(nèi)的一些蛋白,并產(chǎn)生應(yīng)答,從而激活新的代謝物來防御“入侵”。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等模式菌株均可被用作鏈霉菌的共培養(yǎng)菌株。例如當(dāng)StreptomycesMg1與B.subtilis3610共培養(yǎng)時,StreptomycesMg1會產(chǎn)生抑制甚至裂解B.subtilis3610的查爾霉素A(Chalcomycin A)[44]?；罹w或熱滅活的枯草芽孢桿菌均能激活S.coelicolor和S.lividans中Red的產(chǎn)生[45-46]。細菌代謝產(chǎn)生的小分子物質(zhì)也可作為信號分子激活鏈霉菌產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物。例如,Perez等發(fā)現(xiàn)黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)與S.coelicolor共培養(yǎng)時,黃色粘球菌會分泌裂解酶,從而激發(fā)S.coelicolor形成異常菌絲和產(chǎn)生Act以阻止黃色粘球菌的“破壞”[47]。

除上述提及的枯草芽孢桿菌,黃色粘球菌之外,另外一些病原菌、致病菌(例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa)和鏈霉菌共培養(yǎng)時,也能激活鏈霉菌合成granatomycin D、dihydrogranaticin B等物質(zhì)[48]。

3.2 不同鏈霉菌共培養(yǎng)

在鏈霉菌-鏈霉菌共培養(yǎng)過程中,由可擴散底物如γ-丁內(nèi)酯(γ-butyrolactone)和次級代謝物本身介導(dǎo)的種間相互作用被認為是激發(fā)次生代謝的主要因素[48]。特別是,GBL(如A因子、virginiae butanolides和IM-2)是廣泛分布的信號分子,參與鏈霉菌間的信號傳遞[50]。由Streptomyces153產(chǎn)生的聚醚抗生素普羅莫霉素(promomycin),可作為離子載體,通過形成孔道增加K+離子通過細胞膜的外流,抑制細菌生長,而外流的K+離子同時也作為鏈霉菌種間通訊的信號分子,誘導(dǎo)共培養(yǎng)的Streptomyces574產(chǎn)生抗生素。此外包括鹽霉素、莫能菌素和黑霉素在內(nèi)的其它聚醚抗生素也可激活Streptomyces574抗生素的產(chǎn)生[51]。

除信號分子外,一種鏈霉菌的次級代謝物本身也可刺激另一種與之共培養(yǎng)的鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的合成[52]。Streptomycessp. SPB74、S.albusJ1074、S.viridochromogenesDSM40736和Streptomycessp.E14在內(nèi)的4種鏈霉菌均可產(chǎn)生鐵載體siderophores,在與S.coelicolorM145共培養(yǎng)時,可作為“誘導(dǎo)子”激活S.coelicolorM145產(chǎn)生出γ-actinorhodin、pridiginine(可作為免疫抑制劑抗癌藥物)、celichelin、desferrioxamine B(可用于治療鐵中毒)等[53]。

4 核糖體工程

核糖體工程是一種旨在通過調(diào)節(jié)核糖體相關(guān)元件(核糖體蛋白/rRNA)來激活沉默基因并增加抗生素產(chǎn)量的方法,這種方法主要基于引入對攻擊核糖體藥物的抗性突變,如rpoB(編碼ribonucleic acid polymerase,RNAP的β亞基)和rpsL(編碼核糖體蛋白S12)基因的突變分別對利福平和鏈霉素產(chǎn)生抗性,影響菌株的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,從而改變其代謝產(chǎn)物的合成能力(圖3)。目前此方法已在菌株改良和新型抗生素發(fā)現(xiàn)等方面得到了較好的應(yīng)用[54-56]。Shentu等分別利用利福平(Rifampicin,Rif)、鏈霉素(Streptomycin,Str)、慶大霉素(Gentamicin,Gen)、巴龍霉素(Paromomycin,Par)和紅霉素(Erythromycin,Ery)等篩選獲得淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628的自發(fā)單一抗性突變株[57],其中的Str低耐受突變株SD143發(fā)生缺失突變,激活S.diastatochromogenes1628產(chǎn)生了多種次級代謝產(chǎn)物。

圖3 核糖體工程原理示意圖[59]

目前關(guān)于核糖體工程技術(shù)的機制研究較為深入,對于Rif抗性突變株,rpoB基因發(fā)生H437D或H437L有益突變有助于次級代謝產(chǎn)物的大幅提升甚至激活沉默基因簇;對于Str抗性突變株產(chǎn)生了正向效果,往往是rpsL基因發(fā)生K88E的有益突變,影響核糖體循環(huán)因子frr的表達水平從而提高翻譯效率[58-59]。Zhang等人[60]利用一種即插即用(plug-and-play)質(zhì)粒系統(tǒng)直接過表達含上述有益突變的外源rpsL和rpoB基因,并分別在鏈霉菌S.lividans、S.coelicolorA3(2)、Streptomycessp. FXJ6.204和Streptomycessp. FXJ8.102中進行表達,成功激活了多個沉默基因簇,其中Streptomycessp. FXJ8.102產(chǎn)生了兩種新型芳香族聚酮類抗生素piloquinone和homopiloquinone。

5 依賴報告基因的沉默基因簇定向激活

上述利用共培養(yǎng)、核糖體工程技術(shù)等策略雖已成功應(yīng)用于沉默基因簇的激活,但結(jié)果具有較高的隨機性,通過不可預(yù)知的阻遏因素的解除,實現(xiàn)沉默基因簇的激活,但事先無法預(yù)判,無法精準實現(xiàn)目標(biāo)沉默基因簇的激活。目前已有不少報道,以報告基因為指示(reporter gene-guided),結(jié)合隨機突變篩選等手段,可實現(xiàn)目標(biāo)沉默基因簇的定向激活[61-62]。

Guo等建立了一種高效的基于報告基因(neo)的核糖體工程突變株篩選策略(reporter-guided mutant selection,RGMS),成功激活了StreptomycesvenezuelaeISP5230中杰多霉素(jadomycin)基因簇的表達和Streptomycessp. PGA64中沉默基因簇pga的表達,分離得到了2個新的蒽醌類化合物gaudimycins D/E[63]。

Li等人在RGMS基礎(chǔ)上,用鄰苯二酚雙加氧酶-卡那霉素抗性基因(XylE-neo)雙報告基因體系取代了單報告基因neo[64]。通過表型(菌落顏色變黃)和卡那霉素抗性進行兩輪篩選鑒定,成功實現(xiàn)Streptomyceslavendulae中鏈霉素F(streptothricin F)合成基因簇的激活。

6 激活策略的新工具:CRISPR/Cas9系統(tǒng)

鏈霉菌遺傳操作涉及的基因/基因簇敲除,基因簇重構(gòu),啟動子替換等在鏈霉菌遺傳改造等方面已有許多成功的案例,但傳統(tǒng)的遺傳操作周期長,且較為繁瑣[65]。近期,隨著CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技術(shù)的應(yīng)運而生,為鏈霉菌遺傳操作的簡潔化和高效化提供了契機[66-69]。CRISPR/Cas9生物學(xué)的基本信息及其作用機制方面已有較為詳細的研究,其作用原理是利用Cas9內(nèi)切酶與引導(dǎo)RNA(gRNA)形成復(fù)合物,并被引導(dǎo)到與gRNA間隔區(qū)序列互補的Protspacer序列,特異性剪切雙鏈斷裂,然后再通過天然的非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)機制修復(fù)雙鏈,從而完成基因敲除等操作[70-71]。Pristinamycin I(PI)和Pristinamycin II是由Streptomycespristinaespiralis產(chǎn)生的兩種組分,Meng等人[72]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Pristinamycin II生物合成基因簇和缺失阻遏調(diào)控基因papR3,構(gòu)建了一株P(guān)I單組分產(chǎn)生菌,大幅增加PI生物效價。

與此同時,CRISPR/Cas9技術(shù)在激活鏈霉菌沉默基因簇方面也得到了較好地應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在S.albusJ1074的NRPS基因簇和PKS-NRPS基因簇的核心基因上游區(qū)域插入組成型啟動子permE*,從而激活6-epi-alteramides A/B的產(chǎn)生[73]。同樣,基于CRISPR/Cas9技術(shù)用kasOp*啟動子代替沉默基因簇核心基因的天然啟動子,成功激活了S.albus、S.lividans、玫瑰孢鏈霉菌StreptomycesroseosporusNRRL15998等5株鏈霉菌中10個沉默基因簇的表達[74-75]。這些沉默基因簇涉及I、II和III型PKS、非核糖體多肽合成酶(NRPS)、PKS-NRPS雜合基因簇等。同時,CRISPR/Cas9技術(shù)在編輯基因組、優(yōu)化底盤細胞性能、基因定點突變等方面也得到了廣泛應(yīng)用,顯示出作為分子生物學(xué)工具的巨大潛力[76-79]。

7 結(jié)論與展望未來

從微生物次級代謝產(chǎn)物中分離天然活性化合物是開發(fā)新型藥物的主要途徑之一,但傳統(tǒng)的篩選方法面臨較大的瓶頸,如:分離純化前無法預(yù)知活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)是否具有新穎性,利用活性追蹤分離得到的往往是已報道的物質(zhì)[80],且耗時長。近年來,隨著基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展,激活沉默基因簇已成為新型藥物創(chuàng)制的重要研究策略之一[81]。

在這篇綜述中,我們總結(jié)了目前激活沉默基因簇的一些常用的方法。如過表達正調(diào)控基因、敲除負調(diào)控基因?qū)φ{(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行修飾,或繞過原宿主的調(diào)控進行異源表達,以激活沉默基因簇的表達。隨機誘變和核糖體工程技術(shù)等雖展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢,但篩選過程工作量大、周期長,同時對沉默基因簇的激活具有一定的盲目性。為克服隨機篩選的盲目性和繁瑣性,以報告基因為導(dǎo)向,結(jié)合高通量篩選定向激活沉默基因簇也在逐漸被越來越多的學(xué)者采用。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,在遺傳改造鏈霉菌以及激活沉默基因簇研究方面逐漸體現(xiàn)出了優(yōu)越性。相信隨著生物信息學(xué)的發(fā)展、組學(xué)的深入研究,以及鏈霉菌遺傳改造技術(shù)的進步,將會有更多的鏈霉菌沉默基因簇被挖掘和激活,創(chuàng)制更多的新天然化合物。