蔡文斌，劉秀麗，黃 娟，趙文娟

（隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽(yáng) 745000）

雞頭黃精（Polygonatum sibiricum）是百合科黃精屬（PolygonatumMill.）多年生草本植物。黃精主要藥物化學(xué)成分是黃精多糖、甾體皂苷、黃酮等［1］，藥理作用主要為保護(hù)心臟、降血糖血脂、提高免疫力、保護(hù)心血管、延緩衰老、消炎抗病毒、抗腫瘤等［2］。黃精作為一種重要的藥食同源植物，因其市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，價(jià)格不斷上漲，山區(qū)人民加大對(duì)野生黃精的采挖，致使其產(chǎn)量降低，處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。盡管在政府的支持下，中藥材種植業(yè)逐漸發(fā)展壯大，但黃精種植困難重重［3］，產(chǎn)量依然低下。因此若能找到一種與黃精同效且易獲得的替代物，將具有重大意義，為黃精內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)提供了新思路。

內(nèi)生菌普遍存在于健康植物組織中，與植物共生，能產(chǎn)生與植物相同或相似的代謝產(chǎn)物。藥用植物內(nèi)生菌種類豐富，代謝產(chǎn)物多樣，主要有生物堿、皂苷類、萜類、芳香類、多肽類等化合物。孫紅敏等［4］從蛇足石杉分離到可抗菌、抗病毒的內(nèi)生菌；趙明等［5］從華重樓中分離到能產(chǎn)生重樓甾體皂苷成分的內(nèi)生細(xì)菌，而重樓甾體皂苷在抗腫瘤方面有重要的作用；曲紅光等［6］從人參內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到了具有抗腫瘤活性的物質(zhì)。郭曉平等［7］從泰山黃精塊莖組織分離到一株具有廣譜抗菌活性的內(nèi)生細(xì)菌；柏曉輝等［8］從黃山野生黃精的根莖組織中篩選到一株具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌；遲惠榮等［9］從多花黃精的根、莖、葉內(nèi)分離到對(duì)尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的菌株。因此，藥用植物產(chǎn)活性成分內(nèi)生菌的分離鑒定及有藥用價(jià)值代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)，用來(lái)彌補(bǔ)天然中藥材短缺問(wèn)題不失為一種有效的途徑。

本研究以隴東子午嶺自然保護(hù)區(qū)多年生野生雞頭黃精為材料，從中分離出具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，并篩選遺傳穩(wěn)定、多糖含量高的優(yōu)質(zhì)菌株，通過(guò)分子生物學(xué)手段進(jìn)行種屬鑒定分析，力求為隴東地區(qū)黃精內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為野生中藥材的保護(hù)及替代資源的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用雞頭黃精采自隴東地區(qū)子午嶺自然保護(hù)區(qū)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由慶陽(yáng)市疾控中心實(shí)驗(yàn)室提供并于隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 System 9700型PCR（美國(guó)ABI公司），SIGMA3K30型冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司），SW-CJ-ID型超凈工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱、BPG-9140A型精密鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），LDZX-30KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），BSD-100型振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），MDF-U3386S型三洋超低溫保存箱（日本三洋有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 蛋白胨、酵母提取物、無(wú)水乙醇、無(wú)水葡萄糖、牛肉膏、十二烷基磺酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、小量DNA純化回收試劑盒（離心柱型）、限制核酸內(nèi)切酶、pUCm-T載體、離心型質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 內(nèi)生菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉15 g/L，調(diào)節(jié)pH到7.2～7.4，高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，20 min）進(jìn)行滅菌；金黃葡萄球菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉17 g/L，后續(xù)按照“內(nèi)生菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基”方法處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃精內(nèi)生菌的分離及純化 采用組織塊培養(yǎng)法［8，10］分離黃精內(nèi)生菌，簡(jiǎn)述如下。將剛采挖回來(lái)優(yōu)質(zhì)的黃精塊莖表面泥土用洗衣粉洗凈，并用流水沖洗黃精塊莖表面1 h，將沖洗后的黃精塊狀莖放入已滅菌的100 mL的三角瓶中，在超凈工作臺(tái)里用75%乙醇浸泡2 min，瀝去75%乙醇溶液后用無(wú)菌水沖洗5次，再用0.1%HgCl2溶液處理8 min，瀝去HgCl2溶液后用無(wú)菌水沖洗6次并吸去殘留的無(wú)菌水，用無(wú)菌刀片將黃精塊莖切成1 cm3左右的塊狀，放入LB固體培養(yǎng)基分離內(nèi)生菌，同時(shí)將最后一次沖洗的無(wú)菌水作為對(duì)照。將培養(yǎng)皿于30℃恒溫下培養(yǎng)2～3 d，觀察到試驗(yàn)組黃精塊莖切口處長(zhǎng)出菌落后，用接種環(huán)挑取菌體在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化3次后的菌落認(rèn)定為純種，將純種黃精內(nèi)生菌保存在LB斜面培養(yǎng)基上，置于4℃下冷藏備用。

1.2.2 內(nèi)生菌發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物抑菌分析

1）內(nèi)生菌發(fā)酵液的制備。取保存的純種內(nèi)生菌，挑取少量菌種使用平板劃線法接種至新鮮LB培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)12～16 h，挑取活化的單菌落轉(zhuǎn)接至新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床30℃230 r/min培養(yǎng)12～16 h得到種子液。移取2 mL種子液至100 mL新配制LB液體培養(yǎng)基，于恒溫?fù)u床中30℃180 r/min培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min，取離心后的上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并用無(wú)菌水定容至10 mL，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，將過(guò)濾所得的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2）瓊脂打孔法對(duì)內(nèi)生菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌分析。參考張昊等［11］關(guān)于金黃色葡萄球菌的研究，本試驗(yàn)采用瓊脂打孔法［12］進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.2.3 黃精內(nèi)生菌分子生物學(xué)鑒定

1）黃精內(nèi)生菌基因組的提取?；蚪M的提取，采用熊明華等［13］的SDS基因組DNA提取方法，并稍作改良。

2）16SrDNA的克隆。使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)所提取的黃精內(nèi)生菌基因組DNA進(jìn)行16SrDNA PCR克隆。PCR體系如表1所示，PCR循環(huán)體系如表2所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用柱式DNA膠回收試劑盒回收。

表1 黃精內(nèi)生菌16Sr DNA PCR反應(yīng)體系

表2 黃精內(nèi)生菌16Sr DNA PCR循環(huán)體系

3）16SrDNA重組克隆載體的構(gòu)建及酶切鑒定。回收的PCR產(chǎn)物連接pUCm-T載體，高效大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆及提取重組質(zhì)粒，采用酶切體系20μL（重組質(zhì)粒：5μL，EcoRⅠ0.9μL，PstⅠ0.9μL，ddH2O 13.2μL）鑒定陽(yáng)性克隆。

4）陽(yáng)性克隆測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析。將酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的菌株送生工生物工程公司測(cè)序，將測(cè)得的16SrDNA序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，檢索其同源序列。選擇與目標(biāo)菌株同源性較高的菌株序列，用軟件DNAMAN 9.0進(jìn)行序列分析，軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹［14］。

5）內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量測(cè)定。采用苯酚-濃硫酸法測(cè)胞外多糖的含量［15］，并與其寄主黃精多糖含量進(jìn)行比較。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取于105℃下干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品100.0 mg，溶于100.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。再吸取5.0 mL溶于25.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于帶試管塞的試管中，各加入去離子水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，置于85℃中加熱20 min，取出，在常溫水中冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度A，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，建立回歸方程。

黃精多糖提?。簠⒖嘉墨I(xiàn)［16］，把采集的多年生新鮮黃精塊莖清洗干凈，切片，于干燥箱中60℃恒溫干燥至恒重，研磨成粉，過(guò)60目篩。稱取10 g溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，加入4%纖維素酶，于60 Hz頻率、60℃條件下超聲提取55 min，過(guò)濾，取上清液，真空濃縮至20 mL以下，以4倍無(wú)水乙醇沉淀，干燥得固體樣品。

內(nèi)生菌多糖提?。簝?nèi)生菌發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min取上清液，以4倍體積無(wú)水乙醇于4℃條件下沉淀上清液24 h，8 000 r/min離心5 min取沉淀，并將沉淀于65℃恒溫箱中烘干，研磨成粉狀備用。

多糖含量測(cè)定：把黃精多糖粗提物和內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖粗提物稀釋一定倍數(shù)于490 nm處測(cè)定吸光度A，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精內(nèi)生菌的分離及抑菌分析

從黃精塊莖中共分離到4株內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)分別為H-1、H-2、H-3、H-4。按照“1.2.2”方法制備發(fā)酵濃縮液并對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，H-3抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌圈大小約為16.60 mm，抑菌時(shí)間長(zhǎng)達(dá)72 h以上。H-3菌落形態(tài)特征為：菌落小、不規(guī)則、干燥、白色、透明，經(jīng)革蘭氏染色法鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。

圖1 4株內(nèi)生菌的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 內(nèi)生菌H-3的16S rDNA克隆及酶切鑒定

采用改良的SDS法提取黃精內(nèi)生菌H-3基因組，克隆16SrDNA PCR，用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR克隆產(chǎn)物檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示克隆到1 500 bp左右的條帶。把此條帶經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收，連接pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，提取重組質(zhì)粒，用限制內(nèi)切酶酶切體系鑒定，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，酶切產(chǎn)物與克隆產(chǎn)物基本一致。

圖2 H-3菌株16Sr DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 H-3菌株16Sr DNA重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 黃精內(nèi)生菌H-3的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序后的序列用DNAMAN 9.0進(jìn)行拼接，將拼接結(jié)果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)上做BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株H-3與菌株Bacillus circulansstrain S1（GenBank號(hào)：MK100762.1）和菌株Bacillus circulansstrain 194Fe（GenBank號(hào)：KM349200.1）序列的相似度達(dá)到98.28%，基本鑒定為芽孢桿菌。利用軟件MEGA7.0中的p-distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，用鄰接法Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，隨機(jī)抽樣1 000次，自展法計(jì)算進(jìn)化樹的置信度，進(jìn)化發(fā)育樹如圖4所示。從進(jìn)化樹分析結(jié)果可以看出，H-3與菌株Bacilluscirculansstrain S1和菌株Bacilluscirculansstrain 194Fe在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，結(jié)合菌落形態(tài)和革蘭氏染色等結(jié)果，可將該菌鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）。

圖4 內(nèi)生菌H-3及其同源菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 黃精內(nèi)生菌H-3發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量測(cè)定

通過(guò)對(duì)菌株H-3發(fā)酵培養(yǎng)，獲取發(fā)酵產(chǎn)物多糖粗提物，利用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.004X-0.007（R2=0.998 6），表明在0～200μg/mL，吸光度A與葡萄糖濃度有著良好的線性關(guān)系。雞頭黃精的多糖含量達(dá)31.40%，內(nèi)生菌H-3發(fā)酵液醇提物多糖含量為24.00%。

3 小結(jié)與討論

從隴東地區(qū)的野生雞頭黃精中分離到4株內(nèi)生菌，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性，篩選出菌株H-3，結(jié)合菌落形態(tài)、革蘭氏染色、系統(tǒng)進(jìn)化分析，可初步鑒定H-3為環(huán)狀芽孢桿菌。本研究是首次關(guān)于隴東地區(qū)黃精內(nèi)生菌的研究報(bào)道，其他地區(qū)關(guān)于黃精內(nèi)生菌有相關(guān)的研究［7-9］。從黃精內(nèi)生菌現(xiàn)階段研究情況看，黃精中普遍存在芽孢桿菌屬內(nèi)生菌，可以篩選到代謝產(chǎn)物具有抑菌活性的菌株。

金黃色葡萄球菌無(wú)芽孢、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種重要的致病病原體。胡嵐等［17］對(duì)2015—2019年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院感染革蘭陽(yáng)性菌菌株分布及耐藥性分析中發(fā)現(xiàn)，5年臨床檢測(cè)分析了8 406株革蘭陽(yáng)性菌，其中有1 785株是金黃色葡萄球菌。在中國(guó)CHINET數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)網(wǎng)中，統(tǒng)計(jì)2019年中國(guó)醫(yī)院內(nèi)住院的感染患者數(shù)據(jù)［18］，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌主要以金黃色葡萄球菌、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）為主。而在CHINET的數(shù)據(jù)中顯示金黃色葡萄球菌占總分離細(xì)菌中的9.34%，進(jìn)而表明金黃色葡萄球菌是主要的致病菌，因此本研究采用金黃色葡萄球菌作為致病菌進(jìn)行抑菌分析。在接下來(lái)的工作中，隴東地區(qū)藥用植物研究團(tuán)隊(duì)將在抑菌成分結(jié)構(gòu)的解析、內(nèi)生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化、抑菌產(chǎn)物的分離純化等方面繼續(xù)研究，期望能促進(jìn)黃精內(nèi)生菌有價(jià)值產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與利用。