洪偉勇 周旭暉 金陳浩 王金明 郭鈁元 楊根生

關(guān)鍵詞紅細(xì)胞膜;納米粒;葉酸受體;靶向給藥系統(tǒng);抗腫瘤

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，化學(xué)藥物治療仍是目前主要的治療手段之一。阿霉素（doxorubicin，DOX）是最常用的化學(xué)治療藥物，對(duì)乳腺癌、肺癌、膀胱癌等具有較明顯的抗腫瘤作用，是多種腫瘤的一線化療藥物;但其具有骨髓抑制、心臟毒性、耐藥性等缺點(diǎn)，從而限制了其臨床應(yīng)用[1]。紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多、壽命最長的細(xì)胞，也是運(yùn)送氧氣的主要媒介[2];其作為內(nèi)源性物質(zhì)，具有極強(qiáng)的流動(dòng)可塑性、高生物相容性、可生物降解性、超長的半衰期和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[3 - 6];通過修飾還可以將其構(gòu)建成靶向腫瘤的藥物遞送系統(tǒng)[7-9]，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)新熱點(diǎn)。葉酸（folic acid，F(xiàn)A）受體是公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞生物標(biāo)志物，在大量腫瘤（特別是乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種實(shí)體瘤）中過表達(dá)[7，10]，而在正常細(xì)胞中很少表達(dá)，是理想的靶向藥物遞送受體[11-12]。

基于此，本研究以DOX為模型藥物，殼聚糖為載體材料，采用離子交換法制備載阿霉素殼聚糖納米粒（DOX-CS-NPs），將FA 和氨基聚乙二醇磷脂（NH2-PEG2000-DSPE）通過共價(jià)連接后修飾紅細(xì)胞膜（RBC），并構(gòu)建靶向腫瘤細(xì)胞FA受體的載阿霉素紅細(xì)胞膜殼聚糖靶向納米粒（FA-RBC-DOX-CS-NPs），考察該納米粒的理化性質(zhì)和體外釋藥特性，并評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，以期為DOX的新制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有IL-161CT型CO2培養(yǎng)箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]，Malvern ZS90 型激光納米粒徑儀（英國馬爾文儀器有限公司），Nicolet 6700 型傅里葉變換紅外光譜儀、Fresco 21 型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ELx800 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司），UV-2102 型紫外可見分光光度計(jì)（美國Unocal 公司），LSM 900 型共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司），X’pert PRO 型X 射線衍射儀（荷蘭PNAlytical 公司），AVANCE-Ⅲ型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）。

1.2 主要藥品與試劑

FA、殼聚糖和三聚磷酸鈉（批號(hào)分別為20180607、20181009、201812110）購于上海阿拉丁生化科技有限公司;NH2-PEG2000-DSPE（批號(hào)20181022）購于上海凡碩生物科技有限公司;DOX（批號(hào)20180809）購于武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)19126245）購于美國Sigma 公司;MTT 試劑（批號(hào)2002316）購于北京索萊寶科技有限公司;DAPI 染色液（批號(hào)20191116）購于上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，批號(hào)20180928）購于浙江普康化工有限公司;N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號(hào)20180821）購于上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞購于上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源庫。

1.4 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康雄性SD大鼠，共9 只，體質(zhì)量為180～200 g，鼠齡為8 周，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002。實(shí)驗(yàn)期間正常光照，動(dòng)物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度為55%～60%，大鼠自由飲水采食。

2 方法

2.1 葉酸氨基聚乙二醇磷脂的合成

取7.94 mg FA溶于10 mL無水二甲基亞砜（DMSO）中，加入6.9 mg EDC和4.14 mg NHS，室溫避光活化4 h，加入30 mg NH2-PEG2000-DSPE，避光，室溫反應(yīng)24 h（具體合成路線見圖1），然后置于去離子水中透析（透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 000 Da）36 h，收集產(chǎn)物并凍干，即得葉酸氨基聚乙二醇磷脂（FA-PEG2000-DSPE）。采用核磁共振氫譜（1H-NMR）表征FA、NH2-PEG2000-DSPE和FA-PEG2000-DSPE的結(jié)構(gòu)。

2.2 RBC的制備

取SD雄性大鼠血液，加入10 倍體積的1×磷酸鹽緩沖液（PBS），于4 ℃下以4 500 r/min 離心10 min，取沉淀，以1×PBS洗滌3 次，即得紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞置于4 倍體積的0.25×PBS 中，于4 ℃下低滲處理40 min，以釋放紅細(xì)胞內(nèi)容物;再以8 000 r/min 離心15 min，取沉淀，以0.25×PBS洗滌2 次，即得粉色的RBC，備用。

2.3 FA修飾RBC的表征

取“2.1”項(xiàng)下FA-PEG2000-DSPE 適量，以1×PBS 配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的溶液（2 mL），加至等體積RBC溶液中，置于37 ℃、100 r/min 搖床上避光孵育1 h;再于4 ℃條件下用1×PBS洗滌離心（8 000 r/min）2 次，即得FA修飾的RBC（FA-RBC）。采用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定RBC和FA-RBC的結(jié)構(gòu)。

2.4 DOX-CS-NPs的制備與表征

采用離子交聯(lián)法制備DOX-CS-NPs[13]。在25 ℃、400 r/min 的磁力攪拌下，于殼聚糖醋酸溶液（pH6.0）中加入DOX溶液，緩慢滴加三聚磷酸鈉溶液至產(chǎn)生乳光，繼續(xù)磁力攪拌10 min 得納米?；鞈乙?將納米粒混懸液置于超濾管（100 kDa）中離心（4 000 r/min），即得DOX-CS-NPs。其中，DOX溶液、殼聚糖醋酸溶液、三聚磷酸鈉溶液的質(zhì)量濃度分別0.5、1.5、0.4 mg/mL，體積比為5 ∶5 ∶4。采用激光納米粒徑儀測(cè)定該納米粒的粒徑、多分散性指數(shù)（polydisepersity index，PDI）和Zeta電位。

2.5 DOX-CS-NPs包封率和載藥量的測(cè)定

取適量DOX（質(zhì)量記為M）按“2.4”項(xiàng)下方法制備納米?；鞈乙翰⒊瑸V，取下清液，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其中DOX 含量（記為M1）[14]。取超濾膜上納米粒，凍干，稱質(zhì)量（記為M2）。計(jì)算包封率和載藥量，具體公式如下：包封率（%）=（M-M1）/M×100%，載藥量（%）=（M-M1）/M2×100%。

2.6 FA-RBC-DOX-CS-NPs的制備及表征

采用細(xì)胞破碎儀處理FA-RBC（功率100 W，先破碎4 s，間隔5 s 后，再破碎5 s），將破碎后的FA-RBC 和DOX-CS-NPs 經(jīng)400 nm 聚碳酸酯膜擠壓3 次后，再經(jīng)200 nm 聚碳酸酯膜擠壓5 次，即得FA-RBC-DOXCS-NPs。采用激光納米粒徑儀測(cè)定其粒徑、PDI 和Zeta電位。

2.7 體外釋放特性考察

分別取適量DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOXCS-NPs 置于不同透析袋中，再將各透析袋分別置于pH7.4（模擬體循環(huán)環(huán)境）和pH6.5（模擬腫瘤微環(huán)境）的PBS溶液（釋放介質(zhì)）中，于37 ℃、100 r/min 搖床上進(jìn)行透析。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（1、2、4、8、12、24、48、72 h），取出10 mL釋放介質(zhì)并補(bǔ)充等量新鮮介質(zhì)，按“2.5”項(xiàng)下紫外分光光度法測(cè)定取出的釋放介質(zhì)中DOX的含量，并計(jì)算累積釋放率。

2.8 體外抗腫瘤活性考察

取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBCDOX-CS-NPs 的培養(yǎng)基（以DOX計(jì)，質(zhì)量濃度均分別為0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、5.000 μ g/mL），每孔100 μL，各濃度平行5 份;另設(shè)對(duì)照組（只加細(xì)胞不加藥物）。培養(yǎng)48 h 后，加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸出培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測(cè)定各孔光密度（optical density，OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

2.9 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含DOX、FA-RBC-DOX-CS-NPs 和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs（游離FA用于封閉受體以驗(yàn)證納米粒的入胞作用是否由FA受體介導(dǎo)）的新鮮培養(yǎng)基（以DOX計(jì)，質(zhì)量濃度均為5 μg/mL）;另設(shè)不加藥物的空白組。于培養(yǎng)1、4 h 時(shí)移除培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛固定30 min;以PBS 洗滌后，用10 μg/mL 的DAPI 染色1 h，采用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的攝取情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 FA-PEG2000-DSPE的合成結(jié)果

FA、NH2-PEG2000-DSPE 和FA-PEG2000-DSPE 的1H-NMR 如圖2～ 圖4 所示。對(duì)比圖譜可知，圖4 中7.73～7.55 ppm（e）和6.75～6.49 ppm（f）位置的2 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)FA苯環(huán)上的H原子;8.11 ppm（d）和6.94 ppm（g）位置的2 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)FA 上—NH—基團(tuán)的H 原子;4.33 ppm（b）、4.49 ppm（h）、8.65 ppm（i）位置的峰也與FA的1H-NMR相符;3.51 ppm和1.24 ppm位置的峰分別屬于NH2-PEG2000-DSPE 中—C17H35、—OCH2CH2— 基團(tuán)上的H原子。由此表明，載體材料FA-PEG2000-DSPE合成成功。

3.2 FA修飾RBC的表征結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，1 601.1 、1 451.4 cm-1為FA-RBC 中FA上苯環(huán)νC=C的骨架振動(dòng)峰;3 294.8 cm-1歸屬于FA上的羥基;864.5 cm-1為FA苯環(huán)對(duì)位二取代的振動(dòng)峰;1 156.1 cm-1為N—H振動(dòng)峰。由此可知，F(xiàn)A已被成功修飾至RBC上。

3.3 DOX-CS-NPs的表征結(jié)果

DOX-CS-NPs 的載藥量為（15.09±1.36）%，包封率為（60.99±0.92）%，平均粒徑為（152.500±2.554）nm，PDI 為0.124±0.042，Zeta 電位為（10.100±0.216）mV，其中粒徑分布和Zeta 電位見圖6。由此可知，DOX-CSNPs的粒徑較小、分布均勻。

3.4 FA-RBC-DOX-CS-NPs的表征結(jié)果

FA-RBC-DOX-CS-NPs 的平均粒徑為（254.200 ±2.651）nm，PDI為0.199±0.031，Zeta 電位為（-10.100±0.213）mV，具體見圖7。由于RBC 本身帶負(fù)電，DOX-CS-NPs經(jīng)FA-RBC包被后由帶正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж?fù)電荷，由此可知，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NPs 已被成功構(gòu)建。

3.5 體外釋放特性考察結(jié)果

由體外釋放曲線（圖8）可知，在2 種釋放條件下，DOX 原藥均釋放最快，DOX-CS-NPs 次之，F(xiàn)A-RBCDOX-CS-NPs最慢。在pH7.4 的釋放介質(zhì)中，DOX在8 h左右釋放完全，DOX-CS-NPs 在72 h 左右釋放完全，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NPs 在72 h 的累積釋放率約為90%。在pH6.5 的釋放介質(zhì)中，這3 種藥物（制劑）的釋放速率均比在pH7.4 的釋放介質(zhì)中快，DOX在2 h 左右釋放完全，DOX-CS-NPs 在12 h 內(nèi)釋放完全，F(xiàn)A-RBCDOX-CS-NPs 在36 h 內(nèi)釋放完全。由此可知，DOX-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 在模擬腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中的釋藥速率均快于生理?xiàng)l件（pH7.4），這一特性可以減少藥物在體循環(huán)中的釋放，增加藥物在腫瘤組織中的釋放，從而減少副作用，增強(qiáng)藥物抗腫瘤療效。Evans 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在生理?xiàng)l件（pH7.4）下，紅細(xì)胞發(fā)生溶血的概率不大，而腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中，紅細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈溶血。筆者推測(cè)這可能是FA-RBC-DOX-CSNPs在腫瘤微環(huán)境（pH6.5）中釋放速率顯著增加的原因之一。

3.6 體外抗腫瘤活性考察結(jié)果

DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOX-CS-NPs 對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的影響見圖9。由圖9 可知，當(dāng)DOX質(zhì)量濃度在0.500～5.000 μg/mL 范圍內(nèi)，3 種藥物（制劑）對(duì)MCF-7 細(xì)胞的抑制作用均呈濃度依賴趨勢(shì)，MCF-7 細(xì)胞的增殖能力隨著DOX質(zhì)量濃度的升高而減弱。當(dāng)DOX質(zhì)量濃度在0.010～5.000 μg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，DOX-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的抑制效果不如DOX明顯，這可能是由于上述2 種納米制劑將藥物包裹在納米粒內(nèi)，使其釋放速率減慢，短時(shí)間內(nèi)無法直接作用于腫瘤細(xì)胞。

3.7 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在體外抗腫瘤活性結(jié)果的基礎(chǔ)上，為研究FA-RBCDOX-CS-NPs 對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和侵襲能力，考察了DOX 質(zhì)量濃度為5 μg/mL 時(shí)，經(jīng)DOX、FA-RBC-DOXCS-NPs和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理1、4 h 后DOX的入胞行為，結(jié)果見圖10。由圖10 可知，處理1 h 后，3種藥物（制劑）均被細(xì)胞攝取，但在細(xì)胞內(nèi)的濃度均較低，且差別不大。處理4 h 后，細(xì)胞內(nèi)3 種藥物（制劑）的熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，表明細(xì)胞對(duì)DOX的攝取隨作用時(shí)間的增加而增加;其中FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理后的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，DOX次之，F(xiàn)A+FA-RBC-DOX-CS-NPs 最弱。由此可知，F(xiàn)A-RBC-DOX-CS-NPs 能主動(dòng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的FA 受體并特異性結(jié)合，從而提高DOX的入胞效率。FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理細(xì)胞后，細(xì)胞表面受體被游離FA 封閉，無法靶向識(shí)別納米粒，從而降低了DOX的入胞效率。

4 結(jié)語

本研究以DOX為模型藥物，用殼聚糖和三聚磷酸鈉采用離子交聯(lián)法制備了DOX-CS-NPs，再用經(jīng)FAPEG2000-DSPE 修飾后的RBC，構(gòu)建得到FA-RBCDOX-CS-NPs。該納米粒的平均粒徑為（254.200 ±2.651）nm，PDI為0.199±0.031，Zeta 電位為（-10.100±0.213）mV。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，該納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的FA受體有明確的靶向性，能有效提高藥物的入胞效率，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物富集。