伊帕爾古麗·阿皮孜 賀宏吉 王昭志 李喆喆 卡迪熱婭·艾克拉木 白靜雅 王梅

關鍵詞去氫駱駝蓬堿;線粒體;Legumain酶;脂質體

肝癌嚴重影響著人類的生活，其中，我國肝癌的發(fā)病例數占全球的55%[1-3]。在肝癌的藥物治療方面，由于化療藥物的全身毒性或嚴重不良反應，導致患者生存質量下降[4]。研究與開發(fā)安全高效的藥物遞送系統(tǒng)，有望降低化療藥物毒性反應的嚴重程度，同時維持或提高治療效果。

去氫駱駝蓬堿（harmine，HM）是從駱駝蓬種子中分離出來的生物堿。研究顯示，HM通過抑制蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化誘導膠質母細胞瘤細胞凋亡，并通過G2 細胞周期阻滯和線粒體途徑誘導肝母細胞瘤HepG2 細胞凋亡[5-6]。然而，由于HM溶解度低且在大劑量下易引起神經毒性，導致其臨床應用受限。線粒體是一種高度活躍的細胞器，通過不斷分裂和融合來維持細胞的正常生理功能[7]。線粒體動力學失調通常會影響腫瘤細胞的能量供應、氧化還原信號和代謝功能。由于線粒體的功能障礙在腫瘤發(fā)展中起著至關重要的作用，已被確定為治療腫瘤的關鍵靶點[8]。Legumain酶，又稱天冬酰胺內肽酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，最初發(fā)現于豆類植物[9]。研究表明，Legumain 酶在不同類型的實體腫瘤中表達上調，其水平與腫瘤的惡性潛能呈正相關[10]。KA肽由Legumain 酶響應氨基酸序列和線粒體靶向肽KLA 序列組成，其雙級靶向特點有待進一步考察[11-12]。

為提高HM進入腫瘤細胞及其線粒體的效率，降低HM的毒副作用，本研究以大豆磷脂（soybean phospholipid，SPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、膽固醇（cholesterol，Chol），以及KA肽偶聯的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-KA）為材料負載HM，得到Legumain 酶和線粒體雙級靶向HM脂質體（KA@HM-LPS），并對其制劑學特性、體外抗腫瘤作用及生物相容性進行初步評價，以期為后續(xù)研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究的主要儀器有UV-2700 型紫外可見分光光度計[島津（上海）實驗器材有限公司]，R-2003 型旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），HWS-24 型電子恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），KQ5200DE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BSA124S型電子分析天平（德國Sartorius 公司），3-18KS 型臺式高速冷凍離心機（美國Sigma 化學公司），VCX500 型超聲波破碎儀（美國Sonics公司），610000 型微型脂質體擠出器（美國Avanti 公司，孔徑為100 nm 的聚碳酸酯膜），PHSJ-3F 型pH 計（上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司），Nano ZS 型納米粒徑儀（英國Malvern 公司），Modulyo 型真空冷凍干燥機、371型CO2培養(yǎng)箱、HerasafeTM KS 型Ⅱ級生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific 公司），85-2 型恒溫磁力攪拌器（常州金壇精達儀器制造有限公司），ZWYR-D2402 型恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），Victor Nivo型多功能酶標儀（美國PerkinElmer 公司），JEM-1230 型透射電鏡[JEOL 捷歐路（北京）科貿有限公司]，ECLIPSE Ti 型激光共聚焦顯微鏡[Nikon 儀器（上海）有限公司]，SX-500型全自動高壓滅菌鍋（日本Tomy DigitalBiology公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究的主要藥品與試劑有HM標準品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號Q041-180308，高效液相色譜法測得含量>98%），SPC[艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，批號SY-SO-200401]，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000）、DPPC、Chol（西安瑞禧生物科技有限公司，批號分別為LP-R4-039、CC0657、RA0200624），胎牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、胰酶MEM培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號分別為2173969RP、2129299、2186962、8121247），磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone 公司，批號AG29574691），Dil 細胞膜紅色熒光探針（ 上海碧云天生物技術有限公司，批號010421210629），MitoLite Blue FX490 線粒體藍色熒光染料（美國AAT Bioquest 公司，批號1771462），CCK-8 試劑盒（ 北京博奧森生物技術有限公司，批號BA03175388），基質膠[ 康寧（上海）有限公司，批號1060001]，甲醇（天津市化學試劑有限公司，批號20211101410），DSPE-PEG2000-KA（本實驗室自制，批號20210828），其余試劑均為分析純。

1.3 細胞與動物

人正常肝癌細胞SK-Hep-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司;Legumain 酶過表達的人肝癌細胞SK-Hep-1（LGMN+-SK-Hep-1）在本實驗室通過慢病毒介導轉染的方法獲得[13];人正常肝細胞LO2 由新疆醫(yī)科大學藥學院艾尼娃爾·艾克木教授課題組贈送;雄性BALB/c裸鼠（8周齡，22～24 g，生產許可證SCXK-2016-0006）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 HM含量測定方法的建立

2.1.1 HM標準曲線的建立精密稱取HM標準品10mg，用甲醇溶解，并定容至10 mL，制成質量濃度為1mg/mL的HM標準品貯備液。將其用甲醇稀釋，制得質量濃度為10 μg/mL的HM標準品溶液，置于紫外可見分光光度計上進行全波長掃描。結果顯示，HM在240、300 nm 波長處均有較高的吸收，但是240 nm 波長接近于紫外末端，因此，選擇300 nm作為檢測HM含量的最佳吸收波長。將HM標準品溶液用甲醇稀釋得到質量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的系列溶液，分別于300 nm波長處測定吸光度（A）值，以A值對質量濃度（C）進行線性回歸，得HM的回歸方程為A=0.082 8C+0.005 2（R2=0.999 5），表明HM檢測質量濃度的線性范圍為1～10 μg/mL。

2.1.2 方法學考察（1）精密度試驗：將“2.1.1”項下制備的HM標準品溶液用甲醇稀釋到質量濃度分別為4、6、8 μg/mL（低、中、高濃度），在300 nm波長處分別于0、12、24 h 檢測以考察日內精密度，于0、24、48、72 h 檢測以考察日間精密度，結果顯示，低、中、高濃度HM的日內精密度RSD 分別為0.26%、0.25%、0.41%，日間精密度RSD 分別為0.48% 、0.17% 、0.87% ，均小于2.00%（n=6），說明方法的精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.1”項下采用薄膜分散法結合擠出法制備的KA@HM-LPS 1 mL，分別在室溫條件下放置0、2、4、8、16、24 h 后，用甲醇溶解并定容至50 mL，在300 nm波長處測定A 值。結果顯示，A 值的RSD 為1.97%，小于2.00%（n=6），說明方法的穩(wěn)定性較好。（3）重復性試驗：取“2.2.1”項下采用薄膜分散法結合擠出法制備的KA@HM-LPS 100 μL，用甲醇溶解并定容至5 mL，在300 nm 波長處測定A 值。結果顯示，A 值的RSD 為1.74%，小于2.00%（n=6），說明方法的穩(wěn)定性較好。（4）加樣回收率試驗：從“2.1.1”項下制備的HM標準品貯備液中分別精密量取0.2、0.3、0.4 mL 置于50 mL 容量瓶中，各加0.5 mL 空白脂質體（KA@BLPS），用甲醇定容至刻度，得到HM質量濃度分別為4、6、8 μg/mL（低、中、高濃度）的供試品溶液。檢測300 nm波長處的A 值，以評價加樣回收率。結果顯示，低、中、高濃度HM對應的加樣回收率（n=3）分別為（99.30±0.47）%、（101.00±1.40）%和（104.10±0.33）%，表明方法的準確度較好[14]。

2.2 KA@HM-LPS制備方法的選擇

2.2.1 KA@HM-LPS 的制備分別采用逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備KA@HM-LPS。（1）逆相蒸發(fā)法：按照質量比10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA 和HM 標準品，用適量有機相（氯仿-甲醇混合液，體積比2 ∶1，下同）溶解，加入有機相1/3 體積的去離子水，冰浴超聲2 h（100 W），減壓旋蒸（壓力0.05 MPa，轉速100 r/min，下同）至有機溶劑除盡[15]，用微型脂質體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS。（2）pH 梯度法：按照質量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA和HM標準品，用適量有機相溶解，減壓旋蒸形成干燥的脂膜，加入有機相1/3 體積的檸檬酸緩沖液（濃度為50 mmol/L），此時的pH值為2.0;超聲水合30 min（100 W），形成的混懸液用碳酸鈉緩沖液（濃度為150 mmol/L）調節(jié)pH值至7.0，磁力攪拌（室溫，轉速200 r/min）2 h，微型脂質體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS[16]。（3）薄膜分散法：按照質量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密稱取SPC、DPPC、Chol、DSPEPEG2000-KA和HM標準品，用適量有機相溶解，減壓旋蒸形成干燥的脂膜，加入有機相1/3 體積的去離子水，超聲水合30 min（100 W），用微型脂質體擠出器擠出3 次，得KA@HM-LPS[17]。

2.2.2 脂質體的表征分別對逆相蒸發(fā)法、pH 梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS進行表征。（1）分離效率的測定：精密稱取HM標準品5 mg，加入KA@BLPS5 mL，超聲5 min，使之混勻，得到質量濃度為1 mg/mL的HM物理混合液。取HM物理混合液1 mL，置于超濾離心管（截留分子量為10 kDa）中，離心2 次（轉速6 000r/min，每次20 min），每次離心前加入去離子水1 mL，混勻3 次。離心結束后，將外管中的游離藥物用甲醇定容至5 mL，測定HM的濃度，采用分離效率評價方法的可行性。根據公式① 計算得到分離效率為（97.00 ±1.67）%，說明超濾法適用于游離HM 與脂質體的分離[18]。因此，采用超濾法測定包封率。（2）包封率的測定：精密量取KA@HM-LPS 1 mL，與上述同法測定其游離藥物的量（W游離）;另取1 mL KA@HM-LPS，用甲醇破乳并定容至50 mL，測定總藥物的量（W總），根據公式②計算包封率。（3）載藥量的測定：精密量取KA@HM-LPS1 mL，冷凍干燥24 h，通過減重法測定KA@HM-LPS的量（WKA@HM-LPS），根據公式③計算載藥量。（4）取0.5 mLKA@HM-LPS，加0.5 mL 去離子水混勻，分別測定粒徑、多分散系數（polydispersity index，PDI）和Zeta電位。

數據分析應用SPSS 26.0 軟件，計量資料以x±s 表示;組間對比時，數據首先采用單因素方差分析，而后采用Tukey HSD事后檢驗，并采用Bonferroni 法校正顯著性水平的Tukey HSD事后檢驗結果，檢驗水準α=0.05。結果顯示，逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率及載藥量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），而粒徑差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其中，薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率和載藥量最高（表1），因此，選擇薄膜分散法制備KA@HM-LPS用于后續(xù)實驗。根據薄膜分散法制備的KA@HM-LPS呈負電荷，說明其在體內的毒性可能較低。KA@HM-LPS原液（未經過稀釋的脂質體）借助透射電鏡觀察其形態(tài)，如圖1 所示。由圖1 可見，KA@HM-LPS呈類圓形，粒徑大小跟粒徑儀測定的平均粒徑相差不大[19]。另外，將KA@HM-LPS材料中的DSPE-PEG2000-KA 替換成DSPE-mPEG2000，按KA@HM-LPS 相同的制備方法制備未修飾脂質體（HM-LPS）。

2.3 KA@HM-LPS均質化方法的選擇

分別采用探針超聲法和擠出法進行KA@HM-LPS均質化。（1）探針超聲法：將KA@HM-LPS置于冰浴中，探針超聲10 min（150 W，工作3 s、停止2 s），共3 次。（2）擠出法：將KA@HM-LPS在37 ℃保溫條件下用微型脂質體擠出3 次。分別比較2 種方法所得KA@HM-LPS的粒徑和包封率。數據分析和統(tǒng)計方法同“2.2.2”項下。結果顯示，與探針超聲法相比，擠出法處理的KA@HMLPS包封率較低、粒徑較小（P<0.01），因此，本研究選擇擠出法作為均質化方法用于后續(xù)實驗。結果見圖2。

2.4 KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性評價

首先，取KA@HM-LPS 5 mL，依次在- 20 ℃ 和- 80 ℃ 冰箱中各預凍12 h;放入冷凍干燥機中，于- 55 ℃減壓條件下干燥24 h，得KA@HM-LPS 凍干粉。精密稱取1 mg KA@HM-LPS凍干粉，混懸在3 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫孵育24 h，模擬生理環(huán)境。分別在第0、1、2、4、6、8、10、12、24 h 時測定KA@HM-LPS 的粒徑，觀察血清對KA@HM-LPS 穩(wěn)定性的影響[20]。結果顯示，KA@HM-LPS的粒徑在12 h后幾乎未再變大，說明穩(wěn)定性良好。結果見圖3。

2.5 KA@HM-LPS的血漿穩(wěn)定性評價

為評價KA@HM-LPS 的血漿穩(wěn)定性，測定其在20%血漿中的體外釋放率。通過眼眶取血法從BALB/c裸鼠采集全血，將1 mL 裸鼠全血（加抗凝劑）以2 500r/min 離心10 min，吸取最上層的血漿部分，并用生理鹽水按照1 ∶ 5 稀釋，得到20%的血漿樣本。將“2.4”項下KA@HM-LPS 凍干粉和游離HM 分別混懸在20%的BALB/c裸鼠血漿中，調節(jié)HM的質量濃度為100 μg/mL，體積為2 mL，放入透析袋內（截留分子量為14 kDa），兩端系好，置于含40 mL 等滲PBS（pH=7.4）的50 mL EP管中，在37 ℃恒溫條件下以150 r/min 振搖。分別在第1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 取樣1 mL（每次取樣后補充同溫、等體積、等滲PBS），加甲醇1 mL混勻，采用紫外分光光度法測定HM的含量，計算體外釋放率[14]。結果顯示，KA@HM-LPS的體外釋放率在72 h 時為（90.80±1.28）%，而HM在24 h 時已達到（91.00±1.18）%，詳見圖4。此外，將KA@HM-LPS的體外釋放曲線分別與零級、一級、Higuchi 和Weibull 函數方程擬合，其擬合優(yōu)度分別為0.767 1、0.988 9、0.921 3 和0.996 3，體外釋放曲線更符合Weibull 分布，說明KA@HM-LPS 具有緩釋效果。

2.6 KA@HM-LPS的毒性評價

2.6.1 血液相容性為預測KA@HM-LPS在體內的血液相容性，測定其在2%紅細胞懸液中的溶血百分數。通過眼眶取血法從BALB/c 裸鼠采集抗凝全血1 mL，離心數次（轉速2 500 r/min，時間10 min），每次離心前均去掉上清液，加生理鹽水混勻。當上清液變得無色透明時，加入生理鹽水定容至50 mL，得到2%紅細胞懸液。將“2.4”項下KA@HM-LPS凍干粉用生理鹽水制成質量濃度為40、80、120、160、200 μg/mL 的混懸液，加入等體積的2%紅細胞懸液，于37 ℃保溫孵育2 h。陽性對照為去離子水，陰性對照為生理鹽水。以200 r/min 離心5min，取上清液，采用紫外可見分光光度計在416 nm 波長處測定A值，根據公式④計算溶血百分數[21-22]。各質量濃度（以HM計算）KA@HM-LPS 的溶血百分數分別與游離HM（質量濃度為40 μg/mL）對比。

2.6.2 KA@BLPS 對正常肝細胞存活率的影響為考察KA@BLPS 對正常肝細胞的毒性，將人正常肝細胞LO2 按照5 000 個/孔接種至96 孔板中，并在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質量濃度[0（空白）、25、50、100、200、400 μg/mL]加入KA@BLPS，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另設空白調零組，不加細胞和藥物，只加培養(yǎng)基。每個孔中加入10 μL CCK-8 孵育2 h，采用酶標儀在450nm波長處測定A值，并根據公式⑤計算細胞存活率。結果顯示，當KA@BLPS 的質量濃度達到400 μg/mL 時，LO2 細胞的存活率為（94.40±6.12）%，說明載體的毒性很小，生物相容性較好。結果見圖5A。

本課題組前期研究顯示，Legumain 酶在肝癌細胞中的表達量低于在肝癌組織中的表達量[13]。為進行KA@HM-LPS 的體外特性評價，本研究采用Legumain酶過表達人肝癌細胞系。取人正常肝癌細胞SK-Hep-1和LGMN+-SK- Hep-1，分別按照5 000 個/孔接種至96 孔板中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質量濃度[0（ 空白）、20、40、60、80、100 μ g/mL] 加入KA@HM-LPS，孵育48 h。每個孔中加入10 μL CCK-8孵育2 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定A值，并根據公式⑤計算細胞存活率[24]。

數據分析和統(tǒng)計方法同“2.2.2”項下。結果顯示，LGMN+-SK-Hep-1 的細胞存活率要顯著低于SK-Hep-1（P<0.001），表明KA@HM-LPS 對LGMN+-SK-Hep-1細胞的抑制作用顯著大于SK-Hep-1 細胞，初步說明KA@HM-LPS 具有顯著的Legumain 酶響應性。結果見圖5B。

2.8 Legumain 酶過表達對KA@HM-LPS線粒體靶向性的影響

由于HM無自發(fā)熒光特性，為觀察KA@HM-LPS被KA肽介導細胞的攝取和定位情況，將HM替換成Dil 細胞膜紅色熒光探針，采用與KA@HM-LPS相同的制備方法得到Dil 負載的KA 肽修飾脂質體（KA@Dil-LPS）。取SK-Hep-1 和LGMN+-SK-Hep-1 細胞，分別接種到Confocal 皿中，每皿1×104個細胞，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。加入KA@Dil-LPS 孵育6 h，其中Dil 的終濃度為2 μmol/L[25]。將細胞用預熱的無血清胰酶MEM培養(yǎng)基清洗3 次，根據MitoLite Blue FX490 線粒體藍色熒光染料試劑盒檢測結果標記各組細胞的線粒體，置于共聚焦顯微鏡下觀察KA@HM-LPS 在2 種細胞中的攝取情況與線粒體靶向性[26]。結果顯示，在Legumain 酶過表達的LGMN+-SK-Hep-1 細胞中，KA@Dil-LPS 更多地被細胞攝取，且特異性地聚集在線粒體膜上和線粒體內，這說明KA@HM-LPS 具有Legumain 酶響應性線粒體靶向特點，其可以被Legumain酶過表達的癌細胞特異性攝取，并靶向至癌細胞的線粒體。結果見圖6。

2.9 KA@HM-LPS對肝癌細胞遷移和侵襲的影響

腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)的重要原因[27]。本研究通過Transwell 實驗分別測定KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移和侵襲的影響。

2.9.1 細胞遷移實驗將LGMN+-SK-Hep-1 細胞重懸于無血清胰酶MEM培養(yǎng)基中，按照1×104個/孔接種至Transwell 小室。將細胞分為空白對照組（加入無血清胰酶MEM培養(yǎng)基）、HM組、未修飾脂質體（HM-LPS）組和KA@HM-LPS組，其中涉及HM的終濃度均為20 μmol/L（劑量依據來源于前期預實驗）。下室加入20%胎牛血清600 μL，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。上室用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色20min，PBS洗3 次，晾干，拍照[28]。Transwell 實驗圖片分析應用Image J 1.53 軟件，實驗數據分析和統(tǒng)計同“2.2.2”項下。結果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移的抑制作用顯著高于HM-LPS（P<0.001）。結果見圖7、圖8A。這說明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain酶過表達癌細胞的遷移。

2.9.2 細胞侵襲實驗Transwell 上室先用50 μL 基質膠（V 基質膠∶VPBS=1 ∶8）鋪膠，4 ℃過夜，再水化。后續(xù)實驗步驟同“細胞遷移實驗”。結果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞侵襲的抑制作用顯著高于HM-LPS（P<0.001），結果見圖8B、圖9。這說明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain 酶過表達癌細胞的侵襲。

3 討論

引起肝癌的主要危險因素有乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等各種慢性肝損傷[29]。由于肝癌早期癥狀不明顯，確診時通常已擴散到肝實質外[26]。生物堿作為一類天然中藥成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、轉移、血管生成，改變細胞形態(tài)，促進細胞凋亡和自噬，觸發(fā)細胞周期阻滯，調節(jié)多種癌相關基因和通路等抗腫瘤作用[30]。HM雖然也具有很好的抗腫瘤作用，但存在毒性問題，故本研究制備了KA@HM-LPS。

本研究首先篩選KA@HM-LPS的制備方法和均質化方法。結果顯示，薄膜分散法結合擠出法得到的KA@HM-LPS 呈負電荷，粒徑較小，其PDI 在0.3 左右，包封率為（90.50±0.62）%。體外釋放率是評價緩控釋制劑的重要參數之一，本研究中20%血漿中的體外釋放率結果顯示，KA@HM-LPS與HM溶液相比具有明顯的緩釋效果，體外釋放曲線更符合Weibull 分布。KA@HM-LPS 在37 ℃、10%胎牛血清中12 h 后的粒徑幾乎未再變大，表明KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性良好。

KA@HM-LPS在HM質量濃度為160 μg/mL時的溶血百分數低于游離HM在質量濃度為40 μg/mL 時的溶血百分數，說明KA@HM-LPS在體內具有良好的血液相容性。而且，KA@BLPS 對正常肝細胞LO2 的毒性低，說明載體的生物相容性較好。但是，KA@BLPS具體對機體的安全性還需要在體內模型中分別從血液學和組織學方面進一步評價。另外，本研究還比較了KA@HM-LPS 對LGMN+-SK-Hep-1 和SK-Hep-1 細胞的增殖抑制活性和線粒體靶向性。結果顯示，在LGMN+-SK-Hep-1 細胞中，KA@HM-LPS的抑制作用更大，且可以特異性聚集在其線粒體上。Transwell 實驗結果顯示，KA@HM-LPS對LGMN+-SK-Hep-1 細胞遷移和侵襲的抑制作用均高于HM-LPS。

綜上所述，將HM制備成KA@HM-LPS可以有效抑制Legumain酶過表達的肝癌細胞的遷移和侵襲，并提高HM的血液相容性。本研究后續(xù)將通過動物實驗進一步驗證KA@HM-LPS在體內的安全性和靶向性，以探究該載體設計的有效性。