伊帕爾古麗·阿皮孜 賀宏吉 王昭志 李喆喆 卡迪熱婭·艾克拉木 白靜雅 王梅
關(guān)鍵詞去氫駱駝蓬堿;線(xiàn)粒體;Legumain酶;脂質(zhì)體
肝癌嚴(yán)重影響著人類(lèi)的生活,其中,我國(guó)肝癌的發(fā)病例數(shù)占全球的55%[1-3]。在肝癌的藥物治療方面,由于化療藥物的全身毒性或嚴(yán)重不良反應(yīng),導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降[4]。研究與開(kāi)發(fā)安全高效的藥物遞送系統(tǒng),有望降低化療藥物毒性反應(yīng)的嚴(yán)重程度,同時(shí)維持或提高治療效果。
去氫駱駝蓬堿(harmine,HM)是從駱駝蓬種子中分離出來(lái)的生物堿。研究顯示,HM通過(guò)抑制蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡,并通過(guò)G2 細(xì)胞周期阻滯和線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)肝母細(xì)胞瘤HepG2 細(xì)胞凋亡[5-6]。然而,由于HM溶解度低且在大劑量下易引起神經(jīng)毒性,導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。線(xiàn)粒體是一種高度活躍的細(xì)胞器,通過(guò)不斷分裂和融合來(lái)維持細(xì)胞的正常生理功能[7]。線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)通常會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)、氧化還原信號(hào)和代謝功能。由于線(xiàn)粒體的功能障礙在腫瘤發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,已被確定為治療腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。Legumain酶,又稱(chēng)天冬酰胺內(nèi)肽酶,屬于半胱氨酸蛋白酶家族,最初發(fā)現(xiàn)于豆類(lèi)植物[9]。研究表明,Legumain 酶在不同類(lèi)型的實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào),其水平與腫瘤的惡性潛能呈正相關(guān)[10]。KA肽由Legumain 酶響應(yīng)氨基酸序列和線(xiàn)粒體靶向肽KLA 序列組成,其雙級(jí)靶向特點(diǎn)有待進(jìn)一步考察[11-12]。
為提高HM進(jìn)入腫瘤細(xì)胞及其線(xiàn)粒體的效率,降低HM的毒副作用,本研究以大豆磷脂(soybean phospholipid,SPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC)、膽固醇(cholesterol,Chol),以及KA肽偶聯(lián)的二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-KA)為材料負(fù)載HM,得到Legumain 酶和線(xiàn)粒體雙級(jí)靶向HM脂質(zhì)體(KA@HM-LPS),并對(duì)其制劑學(xué)特性、體外抗腫瘤作用及生物相容性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),以期為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1 材料
1.1 主要儀器
本研究的主要儀器有UV-2700 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司],R-2003 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),HWS-24 型電子恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),KQ5200DE型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),BSA124S型電子分析天平(德國(guó)Sartorius 公司),3-18KS 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma 化學(xué)公司),VCX500 型超聲波破碎儀(美國(guó)Sonics公司),610000 型微型脂質(zhì)體擠出器(美國(guó)Avanti 公司,孔徑為100 nm 的聚碳酸酯膜),PHSJ-3F 型pH 計(jì)(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司),Nano ZS 型納米粒徑儀(英國(guó)Malvern 公司),Modulyo 型真空冷凍干燥機(jī)、371型CO2培養(yǎng)箱、HerasafeTM KS 型Ⅱ級(jí)生物安全柜(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司),85-2 型恒溫磁力攪拌器(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司),ZWYR-D2402 型恒溫振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),Victor Nivo型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer 公司),JEM-1230 型透射電鏡[JEOL 捷歐路(北京)科貿(mào)有限公司],ECLIPSE Ti 型激光共聚焦顯微鏡[Nikon 儀器(上海)有限公司],SX-500型全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本Tomy DigitalBiology公司)。
1.2 主要藥品與試劑
本研究的主要藥品與試劑有HM標(biāo)準(zhǔn)品(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號(hào)Q041-180308,高效液相色譜法測(cè)得含量>98%),SPC[艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào)SY-SO-200401],二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)、DPPC、Chol(西安瑞禧生物科技有限公司,批號(hào)分別為L(zhǎng)P-R4-039、CC0657、RA0200624),胎牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、胰酶MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司,批號(hào)分別為2173969RP、2129299、2186962、8121247),磷酸鹽緩沖液(PBS,美國(guó)Hyclone 公司,批號(hào)AG29574691),Dil 細(xì)胞膜紅色熒光探針( 上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)010421210629),MitoLite Blue FX490 線(xiàn)粒體藍(lán)色熒光染料(美國(guó)AAT Bioquest 公司,批號(hào)1771462),CCK-8 試劑盒( 北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號(hào)BA03175388),基質(zhì)膠[ 康寧(上海)有限公司,批號(hào)1060001],甲醇(天津市化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20211101410),DSPE-PEG2000-KA(本實(shí)驗(yàn)室自制,批號(hào)20210828),其余試劑均為分析純。
1.3 細(xì)胞與動(dòng)物
人正常肝癌細(xì)胞SK-Hep-1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;Legumain 酶過(guò)表達(dá)的人肝癌細(xì)胞SK-Hep-1(LGMN+-SK-Hep-1)在本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法獲得[13];人正常肝細(xì)胞LO2 由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院艾尼娃爾·艾克木教授課題組贈(zèng)送;雄性BALB/c裸鼠(8周齡,22~24 g,生產(chǎn)許可證SCXK-2016-0006)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
2 方法與結(jié)果
2.1 HM含量測(cè)定方法的建立
2.1.1 HM標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立精密稱(chēng)取HM標(biāo)準(zhǔn)品10mg,用甲醇溶解,并定容至10 mL,制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的HM標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。將其用甲醇稀釋?zhuān)频觅|(zhì)量濃度為10 μg/mL的HM標(biāo)準(zhǔn)品溶液,置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示,HM在240、300 nm 波長(zhǎng)處均有較高的吸收,但是240 nm 波長(zhǎng)接近于紫外末端,因此,選擇300 nm作為檢測(cè)HM含量的最佳吸收波長(zhǎng)。將HM標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的系列溶液,分別于300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值,以A值對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得HM的回歸方程為A=0.082 8C+0.005 2(R2=0.999 5),表明HM檢測(cè)質(zhì)量濃度的線(xiàn)性范圍為1~10 μg/mL。
2.1.2 方法學(xué)考察(1)精密度試驗(yàn):將“2.1.1”項(xiàng)下制備的HM標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇稀釋到質(zhì)量濃度分別為4、6、8 μg/mL(低、中、高濃度),在300 nm波長(zhǎng)處分別于0、12、24 h 檢測(cè)以考察日內(nèi)精密度,于0、24、48、72 h 檢測(cè)以考察日間精密度,結(jié)果顯示,低、中、高濃度HM的日內(nèi)精密度RSD 分別為0.26%、0.25%、0.41%,日間精密度RSD 分別為0.48% 、0.17% 、0.87% ,均小于2.00%(n=6),說(shuō)明方法的精密度良好。(2)穩(wěn)定性試驗(yàn):取“2.2.1”項(xiàng)下采用薄膜分散法結(jié)合擠出法制備的KA@HM-LPS 1 mL,分別在室溫條件下放置0、2、4、8、16、24 h 后,用甲醇溶解并定容至50 mL,在300 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A 值。結(jié)果顯示,A 值的RSD 為1.97%,小于2.00%(n=6),說(shuō)明方法的穩(wěn)定性較好。(3)重復(fù)性試驗(yàn):取“2.2.1”項(xiàng)下采用薄膜分散法結(jié)合擠出法制備的KA@HM-LPS 100 μL,用甲醇溶解并定容至5 mL,在300 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A 值。結(jié)果顯示,A 值的RSD 為1.74%,小于2.00%(n=6),說(shuō)明方法的穩(wěn)定性較好。(4)加樣回收率試驗(yàn):從“2.1.1”項(xiàng)下制備的HM標(biāo)準(zhǔn)品貯備液中分別精密量取0.2、0.3、0.4 mL 置于50 mL 容量瓶中,各加0.5 mL 空白脂質(zhì)體(KA@BLPS),用甲醇定容至刻度,得到HM質(zhì)量濃度分別為4、6、8 μg/mL(低、中、高濃度)的供試品溶液。檢測(cè)300 nm波長(zhǎng)處的A 值,以評(píng)價(jià)加樣回收率。結(jié)果顯示,低、中、高濃度HM對(duì)應(yīng)的加樣回收率(n=3)分別為(99.30±0.47)%、(101.00±1.40)%和(104.10±0.33)%,表明方法的準(zhǔn)確度較好[14]。
2.2 KA@HM-LPS制備方法的選擇
2.2.1 KA@HM-LPS 的制備分別采用逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備KA@HM-LPS。(1)逆相蒸發(fā)法:按照質(zhì)量比10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1,精密稱(chēng)取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA 和HM 標(biāo)準(zhǔn)品,用適量有機(jī)相(氯仿-甲醇混合液,體積比2 ∶1,下同)溶解,加入有機(jī)相1/3 體積的去離子水,冰浴超聲2 h(100 W),減壓旋蒸(壓力0.05 MPa,轉(zhuǎn)速100 r/min,下同)至有機(jī)溶劑除盡[15],用微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次,得KA@HM-LPS。(2)pH 梯度法:按照質(zhì)量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1,精密稱(chēng)取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA和HM標(biāo)準(zhǔn)品,用適量有機(jī)相溶解,減壓旋蒸形成干燥的脂膜,加入有機(jī)相1/3 體積的檸檬酸緩沖液(濃度為50 mmol/L),此時(shí)的pH值為2.0;超聲水合30 min(100 W),形成的混懸液用碳酸鈉緩沖液(濃度為150 mmol/L)調(diào)節(jié)pH值至7.0,磁力攪拌(室溫,轉(zhuǎn)速200 r/min)2 h,微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次,得KA@HM-LPS[16]。(3)薄膜分散法:按照質(zhì)量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1,精密稱(chēng)取SPC、DPPC、Chol、DSPEPEG2000-KA和HM標(biāo)準(zhǔn)品,用適量有機(jī)相溶解,減壓旋蒸形成干燥的脂膜,加入有機(jī)相1/3 體積的去離子水,超聲水合30 min(100 W),用微型脂質(zhì)體擠出器擠出3 次,得KA@HM-LPS[17]。
2.2.2 脂質(zhì)體的表征分別對(duì)逆相蒸發(fā)法、pH 梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS進(jìn)行表征。(1)分離效率的測(cè)定:精密稱(chēng)取HM標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,加入KA@BLPS5 mL,超聲5 min,使之混勻,得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的HM物理混合液。取HM物理混合液1 mL,置于超濾離心管(截留分子量為10 kDa)中,離心2 次(轉(zhuǎn)速6 000r/min,每次20 min),每次離心前加入去離子水1 mL,混勻3 次。離心結(jié)束后,將外管中的游離藥物用甲醇定容至5 mL,測(cè)定HM的濃度,采用分離效率評(píng)價(jià)方法的可行性。根據(jù)公式① 計(jì)算得到分離效率為(97.00 ±1.67)%,說(shuō)明超濾法適用于游離HM 與脂質(zhì)體的分離[18]。因此,采用超濾法測(cè)定包封率。(2)包封率的測(cè)定:精密量取KA@HM-LPS 1 mL,與上述同法測(cè)定其游離藥物的量(W游離);另取1 mL KA@HM-LPS,用甲醇破乳并定容至50 mL,測(cè)定總藥物的量(W總),根據(jù)公式②計(jì)算包封率。(3)載藥量的測(cè)定:精密量取KA@HM-LPS1 mL,冷凍干燥24 h,通過(guò)減重法測(cè)定KA@HM-LPS的量(WKA@HM-LPS),根據(jù)公式③計(jì)算載藥量。(4)取0.5 mLKA@HM-LPS,加0.5 mL 去離子水混勻,分別測(cè)定粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)和Zeta電位。
數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 26.0 軟件,計(jì)量資料以x±s 表示;組間對(duì)比時(shí),數(shù)據(jù)首先采用單因素方差分析,而后采用Tukey HSD事后檢驗(yàn),并采用Bonferroni 法校正顯著性水平的Tukey HSD事后檢驗(yàn)結(jié)果,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示,逆相蒸發(fā)法、pH梯度法和薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率及載藥量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),而粒徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中,薄膜分散法制備的KA@HM-LPS包封率和載藥量最高(表1),因此,選擇薄膜分散法制備KA@HM-LPS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)薄膜分散法制備的KA@HM-LPS呈負(fù)電荷,說(shuō)明其在體內(nèi)的毒性可能較低。KA@HM-LPS原液(未經(jīng)過(guò)稀釋的脂質(zhì)體)借助透射電鏡觀察其形態(tài),如圖1 所示。由圖1 可見(jiàn),KA@HM-LPS呈類(lèi)圓形,粒徑大小跟粒徑儀測(cè)定的平均粒徑相差不大[19]。另外,將KA@HM-LPS材料中的DSPE-PEG2000-KA 替換成DSPE-mPEG2000,按KA@HM-LPS 相同的制備方法制備未修飾脂質(zhì)體(HM-LPS)。
2.3 KA@HM-LPS均質(zhì)化方法的選擇
分別采用探針超聲法和擠出法進(jìn)行KA@HM-LPS均質(zhì)化。(1)探針超聲法:將KA@HM-LPS置于冰浴中,探針超聲10 min(150 W,工作3 s、停止2 s),共3 次。(2)擠出法:將KA@HM-LPS在37 ℃保溫條件下用微型脂質(zhì)體擠出3 次。分別比較2 種方法所得KA@HM-LPS的粒徑和包封率。數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法同“2.2.2”項(xiàng)下。結(jié)果顯示,與探針超聲法相比,擠出法處理的KA@HMLPS包封率較低、粒徑較小(P<0.01),因此,本研究選擇擠出法作為均質(zhì)化方法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。
2.4 KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
首先,取KA@HM-LPS 5 mL,依次在- 20 ℃ 和- 80 ℃ 冰箱中各預(yù)凍12 h;放入冷凍干燥機(jī)中,于- 55 ℃減壓條件下干燥24 h,得KA@HM-LPS 凍干粉。精密稱(chēng)取1 mg KA@HM-LPS凍干粉,混懸在3 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫孵育24 h,模擬生理環(huán)境。分別在第0、1、2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)測(cè)定KA@HM-LPS 的粒徑,觀察血清對(duì)KA@HM-LPS 穩(wěn)定性的影響[20]。結(jié)果顯示,KA@HM-LPS的粒徑在12 h后幾乎未再變大,說(shuō)明穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)圖3。
2.5 KA@HM-LPS的血漿穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
為評(píng)價(jià)KA@HM-LPS 的血漿穩(wěn)定性,測(cè)定其在20%血漿中的體外釋放率。通過(guò)眼眶取血法從BALB/c裸鼠采集全血,將1 mL 裸鼠全血(加抗凝劑)以2 500r/min 離心10 min,吸取最上層的血漿部分,并用生理鹽水按照1 ∶ 5 稀釋?zhuān)玫?0%的血漿樣本。將“2.4”項(xiàng)下KA@HM-LPS 凍干粉和游離HM 分別混懸在20%的BALB/c裸鼠血漿中,調(diào)節(jié)HM的質(zhì)量濃度為100 μg/mL,體積為2 mL,放入透析袋內(nèi)(截留分子量為14 kDa),兩端系好,置于含40 mL 等滲PBS(pH=7.4)的50 mL EP管中,在37 ℃恒溫條件下以150 r/min 振搖。分別在第1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 取樣1 mL(每次取樣后補(bǔ)充同溫、等體積、等滲PBS),加甲醇1 mL混勻,采用紫外分光光度法測(cè)定HM的含量,計(jì)算體外釋放率[14]。結(jié)果顯示,KA@HM-LPS的體外釋放率在72 h 時(shí)為(90.80±1.28)%,而HM在24 h 時(shí)已達(dá)到(91.00±1.18)%,詳見(jiàn)圖4。此外,將KA@HM-LPS的體外釋放曲線(xiàn)分別與零級(jí)、一級(jí)、Higuchi 和Weibull 函數(shù)方程擬合,其擬合優(yōu)度分別為0.767 1、0.988 9、0.921 3 和0.996 3,體外釋放曲線(xiàn)更符合Weibull 分布,說(shuō)明KA@HM-LPS 具有緩釋效果。
2.6 KA@HM-LPS的毒性評(píng)價(jià)
2.6.1 血液相容性為預(yù)測(cè)KA@HM-LPS在體內(nèi)的血液相容性,測(cè)定其在2%紅細(xì)胞懸液中的溶血百分?jǐn)?shù)。通過(guò)眼眶取血法從BALB/c 裸鼠采集抗凝全血1 mL,離心數(shù)次(轉(zhuǎn)速2 500 r/min,時(shí)間10 min),每次離心前均去掉上清液,加生理鹽水混勻。當(dāng)上清液變得無(wú)色透明時(shí),加入生理鹽水定容至50 mL,得到2%紅細(xì)胞懸液。將“2.4”項(xiàng)下KA@HM-LPS凍干粉用生理鹽水制成質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200 μg/mL 的混懸液,加入等體積的2%紅細(xì)胞懸液,于37 ℃保溫孵育2 h。陽(yáng)性對(duì)照為去離子水,陰性對(duì)照為生理鹽水。以200 r/min 離心5min,取上清液,采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在416 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值,根據(jù)公式④計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)[21-22]。各質(zhì)量濃度(以HM計(jì)算)KA@HM-LPS 的溶血百分?jǐn)?shù)分別與游離HM(質(zhì)量濃度為40 μg/mL)對(duì)比。
2.6.2 KA@BLPS 對(duì)正常肝細(xì)胞存活率的影響為考察KA@BLPS 對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性,將人正常肝細(xì)胞LO2 按照5 000 個(gè)/孔接種至96 孔板中,并在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質(zhì)量濃度[0(空白)、25、50、100、200、400 μg/mL]加入KA@BLPS,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另設(shè)空白調(diào)零組,不加細(xì)胞和藥物,只加培養(yǎng)基。每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8 孵育2 h,采用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值,并根據(jù)公式⑤計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示,當(dāng)KA@BLPS 的質(zhì)量濃度達(dá)到400 μg/mL 時(shí),LO2 細(xì)胞的存活率為(94.40±6.12)%,說(shuō)明載體的毒性很小,生物相容性較好。結(jié)果見(jiàn)圖5A。
本課題組前期研究顯示,Legumain 酶在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于在肝癌組織中的表達(dá)量[13]。為進(jìn)行KA@HM-LPS 的體外特性評(píng)價(jià),本研究采用Legumain酶過(guò)表達(dá)人肝癌細(xì)胞系。取人正常肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和LGMN+-SK- Hep-1,分別按照5 000 個(gè)/孔接種至96 孔板中,5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照不同質(zhì)量濃度[0( 空白)、20、40、60、80、100 μ g/mL] 加入KA@HM-LPS,孵育48 h。每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8孵育2 h,采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值,并根據(jù)公式⑤計(jì)算細(xì)胞存活率[24]。
數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法同“2.2.2”項(xiàng)下。結(jié)果顯示,LGMN+-SK-Hep-1 的細(xì)胞存活率要顯著低于SK-Hep-1(P<0.001),表明KA@HM-LPS 對(duì)LGMN+-SK-Hep-1細(xì)胞的抑制作用顯著大于SK-Hep-1 細(xì)胞,初步說(shuō)明KA@HM-LPS 具有顯著的Legumain 酶響應(yīng)性。結(jié)果見(jiàn)圖5B。
2.8 Legumain 酶過(guò)表達(dá)對(duì)KA@HM-LPS線(xiàn)粒體靶向性的影響
由于HM無(wú)自發(fā)熒光特性,為觀察KA@HM-LPS被KA肽介導(dǎo)細(xì)胞的攝取和定位情況,將HM替換成Dil 細(xì)胞膜紅色熒光探針,采用與KA@HM-LPS相同的制備方法得到Dil 負(fù)載的KA 肽修飾脂質(zhì)體(KA@Dil-LPS)。取SK-Hep-1 和LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞,分別接種到Confocal 皿中,每皿1×104個(gè)細(xì)胞,在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。加入KA@Dil-LPS 孵育6 h,其中Dil 的終濃度為2 μmol/L[25]。將細(xì)胞用預(yù)熱的無(wú)血清胰酶MEM培養(yǎng)基清洗3 次,根據(jù)MitoLite Blue FX490 線(xiàn)粒體藍(lán)色熒光染料試劑盒檢測(cè)結(jié)果標(biāo)記各組細(xì)胞的線(xiàn)粒體,置于共聚焦顯微鏡下觀察KA@HM-LPS 在2 種細(xì)胞中的攝取情況與線(xiàn)粒體靶向性[26]。結(jié)果顯示,在Legumain 酶過(guò)表達(dá)的LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞中,KA@Dil-LPS 更多地被細(xì)胞攝取,且特異性地聚集在線(xiàn)粒體膜上和線(xiàn)粒體內(nèi),這說(shuō)明KA@HM-LPS 具有Legumain 酶響應(yīng)性線(xiàn)粒體靶向特點(diǎn),其可以被Legumain酶過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞特異性攝取,并靶向至癌細(xì)胞的線(xiàn)粒體。結(jié)果見(jiàn)圖6。
2.9 KA@HM-LPS對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響
腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因[27]。本研究通過(guò)Transwell 實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定KA@HM-LPS對(duì)LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
2.9.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞重懸于無(wú)血清胰酶MEM培養(yǎng)基中,按照1×104個(gè)/孔接種至Transwell 小室。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(加入無(wú)血清胰酶MEM培養(yǎng)基)、HM組、未修飾脂質(zhì)體(HM-LPS)組和KA@HM-LPS組,其中涉及HM的終濃度均為20 μmol/L(劑量依據(jù)來(lái)源于前期預(yù)實(shí)驗(yàn))。下室加入20%胎牛血清600 μL,在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。上室用PBS 洗3 次,4%多聚甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色20min,PBS洗3 次,晾干,拍照[28]。Transwell 實(shí)驗(yàn)圖片分析應(yīng)用Image J 1.53 軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)同“2.2.2”項(xiàng)下。結(jié)果顯示,KA@HM-LPS對(duì)LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞遷移的抑制作用顯著高于HM-LPS(P<0.001)。結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8A。這說(shuō)明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain酶過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞的遷移。
2.9.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell 上室先用50 μL 基質(zhì)膠(V 基質(zhì)膠∶VPBS=1 ∶8)鋪膠,4 ℃過(guò)夜,再水化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同“細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)”。結(jié)果顯示,KA@HM-LPS對(duì)LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞侵襲的抑制作用顯著高于HM-LPS(P<0.001),結(jié)果見(jiàn)圖8B、圖9。這說(shuō)明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain 酶過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞的侵襲。
3 討論
引起肝癌的主要危險(xiǎn)因素有乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等各種慢性肝損傷[29]。由于肝癌早期癥狀不明顯,確診時(shí)通常已擴(kuò)散到肝實(shí)質(zhì)外[26]。生物堿作為一類(lèi)天然中藥成分,具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成,改變細(xì)胞形態(tài),促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬,觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯,調(diào)節(jié)多種癌相關(guān)基因和通路等抗腫瘤作用[30]。HM雖然也具有很好的抗腫瘤作用,但存在毒性問(wèn)題,故本研究制備了KA@HM-LPS。
本研究首先篩選KA@HM-LPS的制備方法和均質(zhì)化方法。結(jié)果顯示,薄膜分散法結(jié)合擠出法得到的KA@HM-LPS 呈負(fù)電荷,粒徑較小,其PDI 在0.3 左右,包封率為(90.50±0.62)%。體外釋放率是評(píng)價(jià)緩控釋制劑的重要參數(shù)之一,本研究中20%血漿中的體外釋放率結(jié)果顯示,KA@HM-LPS與HM溶液相比具有明顯的緩釋效果,體外釋放曲線(xiàn)更符合Weibull 分布。KA@HM-LPS 在37 ℃、10%胎牛血清中12 h 后的粒徑幾乎未再變大,表明KA@HM-LPS的血清穩(wěn)定性良好。
KA@HM-LPS在HM質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)的溶血百分?jǐn)?shù)低于游離HM在質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時(shí)的溶血百分?jǐn)?shù),說(shuō)明KA@HM-LPS在體內(nèi)具有良好的血液相容性。而且,KA@BLPS 對(duì)正常肝細(xì)胞LO2 的毒性低,說(shuō)明載體的生物相容性較好。但是,KA@BLPS具體對(duì)機(jī)體的安全性還需要在體內(nèi)模型中分別從血液學(xué)和組織學(xué)方面進(jìn)一步評(píng)價(jià)。另外,本研究還比較了KA@HM-LPS 對(duì)LGMN+-SK-Hep-1 和SK-Hep-1 細(xì)胞的增殖抑制活性和線(xiàn)粒體靶向性。結(jié)果顯示,在LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞中,KA@HM-LPS的抑制作用更大,且可以特異性聚集在其線(xiàn)粒體上。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KA@HM-LPS對(duì)LGMN+-SK-Hep-1 細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用均高于HM-LPS。
綜上所述,將HM制備成KA@HM-LPS可以有效抑制Legumain酶過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲,并提高HM的血液相容性。本研究后續(xù)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證KA@HM-LPS在體內(nèi)的安全性和靶向性,以探究該載體設(shè)計(jì)的有效性。