吳允正，陶天宇，張慶生，戴益民，曾 秀，張 玲，王 嬌，張錦華* (.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；.江西省吉安市畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343000)

腹瀉是仔豬常見(jiàn)的疾病之一，能降低仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，造成仔豬生長(zhǎng)緩慢、死亡率上升，是損害仔豬生長(zhǎng)性能的主要因素。研究表明，幾乎有一半的仔豬死亡是感染性腹瀉引起的[1]。仔豬出生后1周內(nèi)，容易發(fā)生腹瀉，除感染流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等病毒性腹瀉外，仔豬細(xì)菌性腹瀉是重要病因，仔豬腸道微生態(tài)平衡失調(diào)導(dǎo)致條件致病菌大量增加[2]。仔豬的胃腸道內(nèi)存在多種共生微生物，這些微生物大多是有益的，能提供必要的營(yíng)養(yǎng)或阻擋病原微生物的入侵和定植，在腸道生態(tài)系統(tǒng)形成天然屏障，如果這種天然屏障未完全形成，或被破壞，腸道的致病共棲菌(pathobionts)就會(huì)在腸道內(nèi)富集，引起腸道菌群紊亂，導(dǎo)致宿主腸道疾病的發(fā)生[3-4]。研究表明，當(dāng)腸道內(nèi)大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌等有害菌豐度增加，可能引發(fā)急性壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)等腹瀉癥狀[5-7]。仔豬腸道菌群組成復(fù)雜、干擾因素眾多，相比于菌群結(jié)構(gòu)較為相似的健康個(gè)體，失調(diào)個(gè)體間菌群差異更大，符合“安娜·卡列尼娜原則”[8-9]。因此，從微生態(tài)學(xué)的角度分析，造成仔豬腹瀉不是單一的病原菌，而是一些與宿主共生細(xì)菌在微生態(tài)失調(diào)時(shí)大量增殖，直接參與疾病的發(fā)展，這些細(xì)菌稱為致病共棲菌譜[10]。

梭桿菌在人類及動(dòng)物腸道中普遍存在，尤其是具核梭桿菌，大量研究表明，具核梭桿菌能從各種臨床標(biāo)本中被分離出來(lái)，并且發(fā)現(xiàn)其在病變組織中的分布高于正常組織,已被證實(shí)為一種條件致病菌[11-12]。梭桿菌可促進(jìn)不能直接黏附或入侵的腸道病原菌的定植，能導(dǎo)致腸道屏障受損[13]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多研究都集中在具核梭桿菌與結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制關(guān)系，以糞便樣品中具核梭桿菌作為生物標(biāo)志物，用于結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)檢測(cè)[14-16]。然而，梭桿菌與仔豬腹瀉等疾病之間的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本課題組前期對(duì)江西地區(qū)新生仔豬腸道菌群研究發(fā)現(xiàn)：梭桿菌在腹瀉新生仔豬腸道豐度明顯高于健康仔豬，與新生仔豬腹瀉呈正相關(guān)。

本研究通過(guò)細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)高通量測(cè)序、熒光定量PCR和PCR-DGGE等分子生物學(xué)技術(shù)比較分析腹瀉仔豬和健康仔豬腸道菌群組成差異，并對(duì)腹瀉仔豬腸道致病菌進(jìn)行分離鑒定，旨在揭示腹瀉仔豬的腸道致病菌譜，探索腹瀉仔豬的檢測(cè)指示菌。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及采集選取江西省7個(gè)不同地區(qū)同一窩內(nèi)有健康和腹瀉仔豬的豬場(chǎng)，采集7日齡內(nèi)仔豬糞樣48份(腹瀉和健康樣品各24份)，分別標(biāo)記為健康組(H組，n=24)和腹瀉組(D組，n=24) ，樣品分組情況見(jiàn)表1。同一地區(qū)的樣品均來(lái)源于同一頭母豬哺乳期內(nèi)仔豬新鮮糞便；腹瀉仔豬排稀糞，出現(xiàn)精神不振、脫水等癥狀，24份腹瀉仔豬樣品經(jīng)檢測(cè)，豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性腸胃炎病毒均為陰性。將樣品低溫送至實(shí)驗(yàn)室，用于細(xì)菌的分離；并提取總細(xì)菌DNA分析腸道菌群結(jié)構(gòu)。

表1 樣品來(lái)源及分組情況 份

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑哥倫比亞培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色液、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、糞便細(xì)菌總DNA快速抽提試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 DNA提取與測(cè)序各取仔豬糞便樣品100～200 mg，采用DNA快速抽提試劑盒對(duì)糞便細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取。所提取的DNA于-20℃保存，干冰條件下送往上海美吉生物科技有限公司，對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。將各樣本序列進(jìn)行質(zhì)量控制過(guò)濾后，進(jìn)行Alpha多樣性及菌群組成分析。

1.4 熒光定量PCR測(cè)定仔豬糞樣中的梭桿菌數(shù)參照文獻(xiàn)[17]設(shè)計(jì)梭桿菌特異性引物(F:5′-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA-3′；R:5′-TACTGAGGGAGATTATGTAAAAATC-3′)，對(duì)梭桿菌基因進(jìn)行擴(kuò)增。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序，按試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列梯度稀釋(108～104拷貝)，以梯度稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行q-PCR檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。將江西南昌地區(qū)的8份仔豬糞便樣品總DNA稀釋至100 mg/L。反應(yīng)體系：SyBr Green 5.0 μL，Rox 0.5 μL，上、下游引物各0.1 μL，ddH2O 3.3 μL，模板1.0 μL，引物終濃度為 0.1 mmol/L。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性90 s；95℃變性10 s，57℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線溫度為60～95℃[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件中雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

1.6 梭桿菌PCR-DGGE分析使用梭桿菌屬引物[20](Fus F:5′-GGATTTATTGGGCGTAAAG-3′;Fus R:5′-GGCATTCCTACAAATATCTACG-3′)，在Fus F的5′ 端加入一個(gè)40 bp的GC夾子(CCGCCCGCCGCGGCGGCGGGCGGGGCGGGG-GCACGGGGGG)，對(duì)南昌地區(qū)仔豬糞便樣品細(xì)菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，膠濃度梯度為35%～65%，電壓設(shè)置120 V電泳8 h[21]。對(duì)達(dá)到測(cè)序要求的條帶進(jìn)行切膠并回收，以膠回收產(chǎn)物為模板，用梭桿菌屬引物進(jìn)行PCR,產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。

1.7 梭桿菌的分離鑒定將南昌等7個(gè)地區(qū)腹瀉仔豬糞便樣品加入適量生理鹽水充分混勻后，分別涂布于含有100 mg/L新霉素，5 mg/L萬(wàn)古霉素和1 mg/L紅霉素的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后觀察菌株生長(zhǎng)情況[22]，根據(jù)形態(tài)(形狀、顏色、表面、邊緣、突起) 不同的菌落劃線培養(yǎng)3次，直至純化為單一菌落，利用革蘭染色鏡檢對(duì)分離菌株做初步鑒定。采用試劑盒提取分離菌株的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。擴(kuò)增條件:95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的菌株序列進(jìn)行同源性分析，使用MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序分析

2.1.1腹瀉及健康仔豬腸道菌群的組成 為了解腹瀉仔豬腸道的細(xì)菌群落組成，對(duì)腹瀉與健康仔豬腸道細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4進(jìn)行了序列分析。通過(guò)測(cè)序質(zhì)控篩選后，選擇97%相似度的OTU，對(duì)仔豬腸道菌群組成進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，H與D組樣本共有716個(gè)OTU，H組特有181個(gè)OTU，D組特有139個(gè)OTU，H組OTU數(shù)量高于D組(圖1A)，表明H組較D組微生物組成更具多樣性。7個(gè)地區(qū)腹瀉仔豬腸道菌群共有的OTU有56個(gè)，不同地區(qū)樣品特有的OTU數(shù)差異較大，其中南昌地區(qū)樣品中特有的OTU數(shù)最多，達(dá)259個(gè)(圖1B)。

本試驗(yàn)共測(cè)得20個(gè)細(xì)菌門分類物種,其中共有16個(gè)細(xì)菌門，僅在H組中檢測(cè)出的有2個(gè)，分別是脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)，僅在D組中檢測(cè)出的也有2個(gè)，分別是綠菌門(Chlorobi)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)(圖2A)。健康仔豬和腹瀉仔豬腸道微生物均以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)為主要優(yōu)勢(shì)菌群。但H組中厚壁菌門所占比例較D組高,而D組的梭桿菌門占比較高，其相對(duì)豐度分布見(jiàn)圖2B。7個(gè)地區(qū)腹瀉仔豬腸道菌群共有的門類有6個(gè)，上饒、南昌地區(qū)分別特有門類為4和1個(gè)，其他地區(qū)無(wú)特有的門類(圖2C)。

在屬水平上，從Venn圖(圖 3A) 中可以看出,2組共檢測(cè)出324種菌屬,其中270種菌屬重疊，只在H組中檢測(cè)出的菌屬有34種，只在D組中檢測(cè)出的菌屬有20種，其相對(duì)豐度分布見(jiàn)圖3B。其中Escherichia、Shigella、擬桿菌屬(Bacteroides)為H組中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，次要優(yōu)勢(shì)菌屬均低于10%,包括:梭桿菌屬(Fusobacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus) 等;而D組相對(duì)豐度最高的菌屬為梭桿菌屬、擬桿菌屬、Escherichia、Shigella，次要優(yōu)勢(shì)菌屬包括：放線菌屬、RuminococcaceaeUCG-002菌屬、巴斯德菌屬(Pasteurella)、乳酸菌屬等；各地區(qū)腹瀉仔豬腸道菌群共有的屬有51個(gè)，南昌地區(qū)特有的屬最多，達(dá)46個(gè)(圖3C)。

圖3 各組樣品在屬水平上的Venn圖(A)和相對(duì)豐度(B)及7個(gè)地區(qū)D組屬水平Venn圖(C)

2.1.2腹瀉和健康仔豬腸道菌群組成的差異分析 通過(guò)2組樣品物種差異分析，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道與健康仔豬腸道具有顯著性差異的微生物類群：在屬水平上(圖4A)，D組中乳酸菌屬相對(duì)豐度顯著低于H組(P< 0.05),Escherichia、Shigella、擬桿菌屬相對(duì)豐度低于H組，但差異不顯著(P>0.05);在種水平上(圖4B)，D組中unclassifiedLactobacillus相對(duì)豐度極顯著低于H組(P<0.01)，食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)相對(duì)豐度顯著低于H組，而死亡梭桿菌(Fusobacteriummortiferum)相對(duì)豐度顯著高于H組(P< 0.05)。

圖4 各組樣品在屬水平(A)和種水平(B)物種差異分析(豐度前15的物種)

通過(guò)LEfSe多級(jí)物種差異判別分析得出，H組乳酸菌屬的食淀粉乳桿菌、unclassifiedLactobacillus等是使組間菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性差異的主要貢獻(xiàn)菌，而D組梭桿菌屬中的死亡梭桿菌是引起組間菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要菌群(圖5)。

圖5 仔豬腸道菌群LEfSe屬水平上物種差異判別分析(LDA>2)

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)仔豬腸道中梭桿菌對(duì)含梭桿菌屬特異基因片段重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，得到104～108拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，顯示擴(kuò)增結(jié)果較好。以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2值為0.987，這表明Ct值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間存在較好的線性關(guān)系，作為梭桿菌屬計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品符合計(jì)數(shù)要求(圖6A)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，南昌地區(qū)腹瀉仔豬糞便樣品DNA中檢測(cè)到的梭桿菌數(shù)量顯著高于健康仔豬(P<0.05，圖6B)，與16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果一致。

圖6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)和仔豬糞便樣品中梭桿菌數(shù)量(B)

2.3 DGGE圖譜條帶的DNA序列分析對(duì)梭桿菌屬DGGE指紋圖譜中主要的條帶進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)。結(jié)果顯示，腹瀉及健康仔豬樣品泳道A1～A8的DNA條帶測(cè)序結(jié)果與Fusobacteriumnucleatum(登錄號(hào)：GU412343.1)同源性最高；在腹瀉仔豬樣品中還檢測(cè)到其他2種梭桿菌，分別是B3泳道的Fusobacteriumgastrosuis(登錄號(hào)：NR146837.2)，對(duì)比區(qū)分度為99.19%；C1～C4泳道的unculturedFusobacteriumsp.(登錄號(hào)：MN215159.1)為腹瀉組樣品共有檢測(cè)到的梭桿菌，對(duì)比區(qū)分度為96.97%(圖7)。

1～4.腹瀉組樣品；5～8.健康樣品；9.陰性對(duì)照;A～C.各電泳條帶縱列位置圖7 梭桿菌屬DGGE指紋圖譜

2.4 梭桿菌的分離鑒定從南昌和九江地區(qū)的腹瀉樣品中各分離到1株梭桿菌，該菌在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形凸?fàn)罹?，中心不透明，邊緣呈半透明，無(wú)溶血。革蘭染色陰性，其中1株菌體細(xì)長(zhǎng)、兩端尖細(xì)如梭狀，編號(hào)為FB1，如圖8A所示；另1株菌體形態(tài)具有多形性，有部分菌體呈梭狀，兩端尖細(xì)，有部分游離者為橢圓體(圓體腫脹區(qū))，菌體中有革蘭陽(yáng)性顆粒存在，編號(hào)為GH1，如圖8B所示。

圖8 菌株FB1(A)和GH1(B)革蘭染色鏡檢 (×1 000)

根據(jù)菌落形狀大小、革蘭染色鏡檢特性，并結(jié)合16S rDNA鑒定，確定得到的純化菌株鑒定結(jié)果為具核梭桿菌和死亡梭桿菌。將分離菌株16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)后，選取同源性較高的序列，利用MegAlign軟件進(jìn)行序列分析后建立遺傳基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖9所示：分離菌株FB1、GH1分別與具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)和死亡梭桿菌(Fusobacteriummortiferum)同源性在99.2%～99.4% 之間，同源性較高；分離菌株FB1與Fusobacteriumnucleatum、Fusobacteriumnucleatumsubsp.屬于同一分支，而分離菌株GH1與Fusobacteriummortiferum、Clostridiumrectum屬于同一分支。

圖9 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

動(dòng)物腸道微生態(tài)菌群平衡失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致仔豬生理功能紊亂，引起腸道疾病的發(fā)生，而糞便菌群變化可一定程度反映腸道菌群的狀態(tài)[23]。SEKIROV等[24]和LIU等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)會(huì)導(dǎo)致宿主患病。大腸埃希菌首先作為一種腸道致病共棲菌譜(pathobionts)被研究者提出[26]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)、熒光定量PCR，并結(jié)合PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)對(duì)仔豬腸道菌群進(jìn)行分析，腹瀉仔豬與健康仔豬腸道菌群相比，主要體現(xiàn)在梭桿菌屬豐度增高和乳酸桿菌屬豐度降低，提示梭桿菌可能是引起仔豬腹瀉的致病共棲菌譜中的重要成員。

梭桿菌被認(rèn)為是一種炎癥微生物，是抑制T細(xì)胞反應(yīng)和促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的預(yù)后生物標(biāo)志物[27-28]。HUH等[29]研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者及結(jié)直腸癌患者的糞便樣品中具核梭桿菌含量顯著高于健康人群。LIU等[30]通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)患結(jié)腸炎小鼠及正常小鼠糞便細(xì)菌含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患病小鼠糞便中具核梭桿菌的豐度顯著高于正常小鼠。THE等[31]研究表明，在腹瀉患者人群糞便中死亡梭桿菌豐度也顯著升高。COSTA等[32]的研究表明，腹瀉仔豬和患有結(jié)腸炎馬的糞便中梭桿菌的相對(duì)豐度顯著增加。本試驗(yàn)腹瀉組仔豬腸道中梭桿菌門的豐度高達(dá)16.58%，相比于健康組(8.85%)升高將近一倍，這與HERMANN-BANK等[33]的研究結(jié)果類似。熒光定量PCR試驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了梭桿菌數(shù)的菌群分析結(jié)果，從而推測(cè)梭桿菌豐度升高可能是造成仔豬腹瀉的微生態(tài)病因。

PCR-DGGE技術(shù)在一定程度上可對(duì)第2代細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序在種水平上進(jìn)行補(bǔ)充。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于H組，D組中的死亡梭桿菌顯著升高。經(jīng)LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，死亡梭桿菌在腹瀉組的判別得分最高，這說(shuō)明腹瀉仔豬腸道中死亡梭桿菌對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)起到了重要影響，這與HAN等[7]報(bào)道相一致，其或許是引起仔豬腹瀉的關(guān)鍵菌。有研究表明，死亡梭桿菌可以分泌一種細(xì)菌素，能夠?qū)θ樗峋纳L(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[34]。從梭桿菌屬的DGGE圖譜可得知，腹瀉樣品組中梭桿菌DNA條帶的數(shù)量多于健康組，且整體條帶亮度高于健康組，說(shuō)明腹瀉仔豬的梭桿菌種類及豐度高于健康仔豬；梭桿菌是一種較為嚴(yán)格的厭氧菌，24份腹瀉樣品最后只分離純化得到2株梭桿菌，其培養(yǎng)技術(shù)還需進(jìn)一步完善。本研究利用PCR-DGGE分子技術(shù)在腹瀉仔豬樣品中檢測(cè)到的unculturedFusobacteriumsp.(登錄號(hào)：MN215159.1)與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)得到的死亡梭桿菌是否為同種細(xì)菌還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：腹瀉仔豬與健康仔豬腸道菌群差異較大，腹瀉仔豬腸道中梭桿菌數(shù)量顯著高于健康仔豬(P<0.05)，主要體現(xiàn)腸道中死亡梭桿菌等相對(duì)豐度的增加及有益菌食淀粉乳桿菌、unclassifiedLactobacillus等相對(duì)豐度的減少，推測(cè)梭桿菌與仔豬腹瀉密切相關(guān)，死亡梭桿菌可作為仔豬腹瀉致病共棲菌譜的重要成員，但分離到的死亡梭桿菌、具核梭桿菌與仔豬腹瀉的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為診斷及預(yù)防仔豬腸道疾病提供新思路。